На правах рукописи

Официальные оппоненты:

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Иркутский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»

Защита состоится «28» апреля 2011 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 208.065.03 при ГОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации» по адресу: 644043, г. Омск, ул. Ленина, 12; тел. (3812) 23-13-32.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Омской государственной медицинской академии (644043, г. Омск, ул. Ленина, 12)

Автореферат разослан «_____» _____________ 2011 г.

И. о. ученого секретаря диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор В.А. Ширинский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Во многих регионах мира в последние десятилетия отмечается активизация эпидемических проявлений природных очагов эндемических риккетсиозов, объединяемых в группу клещевых пятнистых лихорадок (КПЛ), что привело к росту заболеваемости данными инфекциями (Тарасевич И.В. и др., 1980; Рудаков Н.В. и др., 1994, 1996, 2003; Ястребов В.К., 2006; Mansueto S. et al. 1986).

На территории Российской Федерации осуществляется официальная регистрация двух риккетсиозов из группы КПЛ: сибирского клещевого тифа (СКТ) или клещевого риккетсиоза (КР), вызываемого Rickettsia sibirica, и астраханской пятнистой лихорадки с этиологическим агентом, отнесенным к комплексу R. conorii (Лысковцев М.М., 1963; Rudakov N.V., 1996; Tarasevich I.V. et al., 1991). На Дальнем Востоке недавно описано заболевание по клинической картине схожее с СКТ, вызываемое «R. heilongjiangensis» (Mediannikov O. et al., 2004).

Под названием «Сибирский клещевой тиф» данное заболевание официально регистрируется согласно данным федерального статистического наблюдения Росстата «Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях» (формы №№1,2).

Эпидемически активные очаги СКТ распространены преимущественно в азиатской части России, где заболеваемость регистрируется на 18 административных территориях (Rudakov N. V. et al., 2003). Начиная с 1936 г. по 2009 г. в РФ зарегистрировано более 70 тыс. случаев СКТ.

Алтайский край является эндемичным по ряду природноочаговых облигатно-трансмиссивных инфекций, среди которых лидирующее место занимает СКТ. Наряду с этим, Алтайский край занимает первое место по числу заболеваний этим риккетсиозом в РФ с показателями заболеваемости от 24,3 до 70,4⁰/₀₀₀₀ в разные годы. За 65 лет (1945-2009 гг.) в крае было зарегистрировано 27435 случаев СКТ, из них 9596 (35,0%) – за последнее десятилетие (2000-2009 гг.). При этом в РФ до настоящего времени отсутствует молекулярно-биологическая верификация диагноза «Сибирский клещевой тиф» у пациентов.

Углубленное изучение эпидемических проявлений очагов СКТ в ландшафтно-географических зонах Алтайского края было проведено в периоды с 1942 по 1967 (Кулагин С.М. и др., 1947; Веселов Ю.В. и др., 1970) и с 1981 по 1992 (Рудаков Н.В. и др., 1989; Рудаков Н.В., Оберт А.С., 2001) годы. Ввиду этого назрела необходимость дать эпидемиологическую и клинико-лабораторную характеристику СКТ в Алтайском крае в современный период.

Для эффективного решения задачи обеспечения эпидемиологического благополучия населения необходима четкая организация эпидемиологического надзора за СКТ на очаговых территориях с использованием комплекса современных эпидемиологических, клинических и лабораторных методов и подходов, включая верификацию диагноза заболевания у больных с применением молекулярно-биологических методов.

Цель исследования: Охарактеризовать эпидемический процесс и клиническое течение сибирского клещевого тифа с верификацией этиологического агента комплексом молекулярно-биологических методов для совершенствования системы эпидемиологического надзора и клинико-лабораторной диагностики данного риккетсиоза в Алтайском крае.

Задачи исследования:

1. 
   Провести анализ современной эпидемиологической ситуации по сибирскому клещевому тифу в Алтайском крае.
   
2. 
   Изучить проявления эпидемического процесса сибирского клещевого тифа в Алтайском крае в период с 1990 по 2009 годы.
   
3. 
   Дать клинико-лабораторную характеристику сибирского клещевого тифа в Алтайском крае в современный период.
   
4. 
   Верифицировать этиологический агент в материале (биоптаты с места первичного аффекта) от больных сибирским клещевым тифом комплексом молекулярно-биологических методов (ПЦР и секвенирование).
   
5. 
   Разработать предложения по совершенствованию микробиологического мониторинга в системе эпидемиологического надзора за природными очагами сибирского клещевого тифа.
   

Научная новизна

Установлены основные эпидемиологические закономерности (территории риска, время риска, основные переносчики) распространения природных очагов СКТ на территории Алтайского края в период 1990-2009 гг. Проведено ранжирование административных территорий по уровню заболеваемости (низкий, средний, высокий, очень высокий) и определены зоны различной степени эпидемиологической опасности. Выделены районы со стабильно высоким уровнем заболеваемости в разрезе ландшафтно-географических подзон края.

Установлены различия сезонного распределения заболеваемости СКТ в гиперэндемичных районах подзон разнотравно-типчаково-ковыльных степей и северной лесостепи, соответствующие пикам активности видов клещей, доминирующих на указанных территориях.

Выявлены особенности клинической картины СКТ в современный период. Изучены клинико-лабораторные особенности СКТ в группе больных с молекулярно-биологическим подтверждением диагноза.

В результате молекулярно-биологических исследований у больных с клинически диагностированным СКТ в биоптатах с места первичного аффекта впервые генотипирована R. sibirica sensu stricto и доказана ее этиологическая роль в возникновении случаев этой инфекции в Алтайском крае.

Обоснованы предложения по использованию методов молекулярно-биологического анализа при микробиологическом мониторинге в системе эпидемиологического надзора и контроля за СКТ.

Практическая значимость работы

На основании районирования территории Алтайского края по уровню заболеваемости составлена сравнительно-эпидемиологическая карта-схема распространения и эпидемической активности природных очагов СКТ, что может служить основой для целенаправленного эпидемиологического надзора, эпизоотологических наблюдений и изучения факторов, влияющих на активность функционирования природных очагов СКТ в крае.

Определены особенности современного клинического течения СКТ в крае, позволяющие усовершенствовать клинико-эпидемиологические критерии диагностики этого заболевания. Предложено включить в программу лабораторного обследования больных СКТ комплекс молекулярно-биологических исследований (ПЦР и секвенирование), что позволит улучшить лабораторную верификацию диагноза «Сибирский клещевой тиф».

На основании проведенных исследований разработаны предложения по совершенствованию эпидемиологического надзора и контроля за СКТ в Алтайском крае.

Подготовлено и издано учебное пособие «Сибирский клещевой тиф» (автор Арсеньева И.В.). Результаты исследований используются в работе инфекционных отделений лечебных учреждений г.Барнаула, учебном процессе кафедры инфекционных болезней и кафедры эпидемиологии ГОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Росздрава.

Положения, выносимые на защиту:

1. 
   Эпидемический процесс при сибирском клещевом тифе в Алтайском крае (1990-2009 гг.) проявляется высоким уровнем заболеваемости, неравномерным территориальным распространением в очагах различного ландшафтного типа с высокой степенью эпидемиологической опасности в районах подзон разнотравно-типчаково-ковыльных степей и северной лесостепи, в несколько меньшей степени – в районах подзон южной лесостепи и Северного Алтая.
   
2. 
   Клиническая картина сибирского клещевого тифа у жителей Алтайского края сохраняет черты острой риккетсиозной инфекции. Наиболее постоянными признаками являются: лихорадка, макуло-папулезная сыпь и первичный аффект. Клиническое течение СКТ в современный период характеризуется меньшей частотой тяжелых форм болезни, снижением длительности лихорадочного периода, частоты выявления гепатомегалии, относительной брадикардии и гипотонии.
   
3. 
   В очагах сибирского клещевого тифа в Алтайском крае этиологическим агентом заболевания является Rickettsia sibirica sensu stricto, что впервые было показано в результате молекулярно-биологических исследований (ПЦР и секвенирование) образцов клинического материала от пациентов.
   
4. 
   Эффективная система эпидемиологического надзора за сибирским клещевым тифом основывается на данных, полученных с использованием апробированного комплекса эпидемиологических, клинических и лабораторных методов, включая молекулярно-биологический анализ.
   

Апробация и публикация результатов исследования

В завершенном виде диссертационная работа апробирована на объединенном заседании сотрудников кафедр эпидемиологии и инфекционных болезней ГОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Росздрава, 2010. Материалы диссертации представлены на: Третьей Российской научной конференции с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера», Новосибирск, 2006; 17^th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Munich, Germany, 2007; Научно-практической конференции «День науки в АГМУ», Барнаул, 2008, 2009; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы инфекционной патологии», посвященной 85-летию кафедры инфекционных болезней ИГМУ, Иркутск, 2008; научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии», посвященной 50-летию кафедры инфекционных болезней АГМУ, Барнаул, 2009; Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 70-летию теории академика Е.Н. Павловского о природной очаговости болезней «Актуальные проблемы природной очаговости болезней», Омск, 2009.

По теме диссертации опубликована 21 печатная работа, в том числе 4 - в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, моноавторских работ – 4.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 194 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, приложения. Работа иллюстрирована 11 таблицами, 35 рисунками, 1 схемой, 4 выписками из истории болезни. Библиография включает 264 отечественных и 74 иностранных источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Работа проводилась в 2005-2009 гг. в соответствие с планом научно-исследовательской работы Алтайского государственного медицинского университета, номер государственной регистрации 0120.0600348.

В работе использован комплекс эпидемиологических, клинико-лабораторных, серологических, молекулярно-биологических (генетических) и статистических методов исследования.

Осуществлен многолетний ретроспективный анализ заболеваемости СКТ за весь период официальной регистрации в РФ (1936-2009 гг.) и Алтайском крае (1945-2009 гг.). Проведена дифференциация территории Алтайского края на зоны и подзоны на основании ландшафтно-географического районирования. Изучено территориальное распределение и динамика заболеваемости СКТ во всех районах (60) и городах (12) края в разрезе ландшафтно-географических зон (подзон) за период 1990-2009 гг. Проведено районирование территории края по уровню заболеваемости. Определена взаимосвязь между численностью клещей (средний сезонный показатель) в изучаемом биотопе и уровнем заболеваемости СКТ (I⁰/₀₀₀₀) в соответствующих районах. Изучены возрастная, половая и социально-профессиональная структура, сезонность, обстоятельства заражения.

В течение 2005-2008 гг. обследовано 185 больных СКТ. Диагноз СКТ был выставлен на основании клинических симптомов, данных эпидемиологического анамнеза, результатах клинико-лабораторного и серологического исследований. С целью этиологической верификации диагноза сыворотка крови всех больных была исследована в РСК с цельнорастворимым антигеном R. sibirica. У 12 больных, наряду с РСК, проведено исследование биопсийных образцов кожи с места первичного аффекта на наличие ДНК риккетсий комплексом молекулярно-биологических методов (ПЦР+секвенирование). Тяжесть течения заболевания устанавливали согласно классификации К.М. Лобана (1980, 2002).

В зависимости от результатов серологического и молекулярно-биологического исследований было сформировано 3 группы больных. Основную группу (I группа) составили больные с серологическим подтверждением диагноза в РСК с антигеном R. sibirica («серопозитивные») - 81 человек, среди которых было 46 мужчин и 35 женщин в возрасте от 20 до 86 лет (средний возраст 52,7±1,66 года). Группу сравнения (II группа) - больные, у которых диагноз СКТ не имел серологического подтверждения в РСК и был выставлен на основании клинико-эпидемиологических данных («серонегативные») – 92 человека, из них 59 мужчин и 33 женщины в возрасте от 15 до 80 лет (45,9±1,61 лет). Третью группу (III группа) исследования составили больные с молекулярно-биологической верификацией диагноза СКТ - генотипирование ДНК R. sibirica sensu stricto в биопсийных образцах кожи – 10 из 12 обследованных больных (5 мужчин и 5 женщин в возрасте от 23 до 67 лет, средний возраст – 42,1±4,19 года).

Постановку РСК осуществляли микрометодом по общепринятой методике (Метод. рекомендации, 1992), используя диагностикум риккетсиозный Сибирика сухой для РСК производства НПО «Биомед» (ФГУП «НПО «Микроген»), г. Пермь. Диагностически значимым было нарастание титра антител в динамике не менее чем в 2-4 раза.

С целью исключения микстиинфекции проводились серологические исследования на КЭ методом ИФА (наборы «ВектоВКЭ-IgМ-стрип», «ВектоВКЭ-IgG-стрип», ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирская область, пгт. Кольцово) и РТГА (диагностикум КЭ сухой для РТГА, ФГУП НПО «Вирион», г. Томск), на ИКБ – методом ИФА (наборы «Боррелиоз-ИФА-IgМ» и «Боррелиоз-ИФА-IgG», ООО «Омникс», г. Санкт-Петербург).

Суммарную ДНК из 12 биопсийных образцов кожи экстрагировали индивидуально, используя набор QIAamp Tissue Kit (QIAGEN, Hilden, Germany). Для амплификации ДНК риккетсий применяли праймеры Rr190.70p и Rr190.701n, амплифицирующие фрагмент 590 п.о. гена, кодирующего белок наружной мембраны риккетсий 190-кД (ompA) (Fournier P.-E. et al., 1998), и две пары праймеров CS1d-CS535r и CS409d-RP1258n, амплифицирующих ген цитрат синтазы всех известных видов риккетсий (Roux V. et al., 1997). Секвенирование было выполнено на ABI 3100 PRISM (Applied Biosystems) автоматическом секвенаторе. Последовательности ДНК, полученные при секвенировании, были идентифицированы с депонентами, находящимися в GenBank, в режиме прямого доступа.

Комплексное лечение СКТ включало в себя назначение этиотропной, патогенетической и симптоматической терапии с учетом тяжести течения и сопутствующих заболеваний.

Материалы эпидемиологического исследования подвергались статистической обработке с использованием эпидемиологических методов (Брико Н.И., Покровский В.И., 2010; и др.). Статистический анализ проводили методами параметрического и непараметрического анализа (Сепетлиев Д.А., 1968; Гланц С., 1999; Реброва О.Ю., 2002; и др.) с помощью пакета STATISTICA 6.1 (StatSoft, Inc.) и возможностей MS Excel. Выбор методов статистической обработки определен характером распределения изучаемых признаков (проверка – по критерию Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилк W-теста) типом данных (количественные или качественные) и дизайном исследования. При проверке статистических гипотез критический уровень значимости p принимался равным 0,05.

Клинико-лабораторное обследование и лечение больных осуществляли на базе инфекционных отделений и лабораторий МУЗ «Городская больница №5» г. Барнаула (главный врач – И.А. Вильгельм). Серологические исследования на клещевые инфекции проведены в аттестованной вирусологической лаборатории ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Алтайском крае» (зав. лабораторией – Н.Р. Досужева). Раздел молекулярно-биологических исследований выполнен совместно с д.м.н. С.Н. Шпыновым (ФГУН Омский НИИПОИ Роспотребнадзора) на базе лаборатории «Unite des Rickettsies» Средиземноморского университета (г. Марсель, Франция) (проф. Dider Raoult).