          На правах рукописи
БУРКОВ ИВАН АНДРЕЕВИЧ
ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ С ГЕНАМИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ЧЕЛОВЕКА (Г-КСФ И ГМ КСФ) ПОД КОНТРОЛЕМ 5’-РЕГУЛЯТОРНОЙ ОБЛАСТИ ГЕНА α S1 КАЗЕИНА КОЗЫ
Специальность 03.02.07 - генетика
АВТОРЕФЕРАТ
Диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Новосибирск 2011
Работа выполнена в лаборатории генетики развития Учреждения РАН Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.
Научный руководитель:
|
Кандидат биологических наук
Ирина Александровна Серова
Институт Цитологии и Генетики
СО РАН, г. Новосибирск
|
Официальные оппоненты:
|
Доктор биологических наук,
Елена Викторовна Дейнеко
Институт Цитологии и Генетики
СО РАН, г. Новосибирск
|
Доктор биологических наук, профессор,
Людмила Фёдоровна Гуляева
Научно исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, г. Новосибирск
|
Ведущее учреждение:
|
Институт молекулярной генетики РАН,
г. Москва.
|
Защита диссертации состоится «____» ____________ 2012 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д 003.011.01) в конференц-зале Института цитологии и генетики СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, 90, пр. акад. Лаврентьева, 10, тел. (383)363-49-06, факс: (383)333-12-78; e mail: dissov@bionet.nsc.ru.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.
Автореферат разослан «____» ____________ 201 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность. Возможность искусственно включать в геном практически любой интересующий исследователей ген позволила создать огромное количество трансгенных животных, используемых для решения самых различных задач современной биологии, медицины и сельского хозяйства. Одно из новейших направлений биотехнологии, заключается в создании так называемых биореакторов, - трансгенных сельскохозяйственных молочных животных, способных с молоком продуцировать ценные белки человека. Данная методика получения рекомбинантных белков является альтернативным подходом ныне существующим, основанным на бактериальных продуцентах или на использовании трансформированных клеток млекопитающих. Стратегия создания животных-биореакторов основана на введении в их геном конструкции, содержащей последовательность ДНК, кодирующую необходимый белок, и управляемую регуляторными элементами одного из «генов молока» – αS1-, αS2-, β- и κ-казеинов, β-лактоглобулина, кислого белка молока или β-лактальбумина (Maga et al., 1995; Wall et al.,1996; Wall et al.,1997; Гольдман и др., 2002; Niemann and Kues, 2007; Kues and Niemann, 2011). Полученные таким способом трансгенные животные способны на высоком уровне синтезировать целевой рекомбинантный белок в молочной железе и секретировать его в молоко, которое, в свою очередь, становится источником для выделения белка. В настоящее время имеются примеры успешного применения этой технологии и созданы трансгенные козы, коровы, овцы, свиньи и кролики – продуценты человеческих белков: α-антитрипсина, сывороточного реактивного белка С, анти тромбина, факторов VIII и IX свертывания крови, лактоферрина, кальцитонина и других (Wall et al.,1997; Wall et al., 1997; Rudolph, 1999; Гольдман и др., 2002; Niemann and Kues, 2007; Kues and Niemann 2011).
Считается, что для корректной экспрессии трансгена в его составе должен присутствовать промотор, энханесеры, инсуляторы, интроны, а так же терминатор транскрипции (Houdebine 2006). Некоторые исследователи полагают, что для обеспечения экономической выгоды, концентрация рекомбинантных белков в молоке животных биореакторов должна составлять около 1-2 мг/мл (Wall et al., 1997; Houdebine 2009). Действительно, такие высокие концентрации желательны, но только в том случае, если рекомбинантный белок не обладает биологической активностью и может находиться в трансгенном организме в высоких концентрациях (например, альбумин или фибриноген). Если же речь идет о белках, имеющих высокую биологическую активность (ростовые факторы, цитокины и др.), такие уровни продукции непригодны, ввиду того, что рекомбинантные белки могут нанести вред самому трансгенному животному при всасывании из молочной железы (Houdebine 2009). В свете этого не удивительно, что список белков человека, созданных к настоящему времени с помощью животных биореакторов, не включает ростовых факторов или цитокинов (Lubon, 1998; Rudolph 1999; Goldman et al., 2002; Houdebine 2006; Niemann and Kues 2007, Niemann 2011). Рекомбинантные белки могут оказывать вредное влияние на организм трансгенного сельскохозяйственного животного как в случае эктопической экспрессии трансгена, так и в случае их адсорбции из молока в кровяное русло (при высоком уровне секреции в молочной железе). Таким образом, стратегия получения трансгенных животных, продуцирующих биологически активные белки человека, должна быть пересмотрена, с целью обеспечить умеренную секрецию рекомбинантного белка в молоко. Для реализации этой цели необходимо создавать и тестировать такие генетические конструкции, которые смогли бы обеспечить умеренную, а самое главное тканеспецифичную экспрессию биологически активных рекомбинантных белков.
Учитывая длительный репродуктивный период большинства крупных животных – потенциальных продуцентов белков человека – трансгенные мыши являются незаменимой модельной системой в тестировании генетических конструкций, созданных для получения трансгенных животных-биореакторов.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы являлось детальное исследование параметров экспрессии 2-х генно-инженерных конструкций, имеющих идентичные 5’- и 3’ регуляторные последовательности гена α-S1-казеина козы, «слитые» с полноразмерными генами гранулоцит-колониестимулирующего (Г-КСФ, конструкция pGoatcasGCSF) или гранулоцит-макрофаг колониестимулирующего (ГМ-КСФ, конструкция pGoatcasGMCSF) факторов человека у трансгенных мышей. Отдельным фрагментом работы являлось изучение экспрессии гена ГМ КСФ человека у трансгенных мышей, несущих модифицированную конструкцию pGoatGMCSF, с добавленным в ее состав потенциальным инсулятором - MAR элементом дрозофилы (pMARGoatcasGMCSF).
Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:
Создать 3 группы линий трансгенных животных, несущих генно-инженерные конструкции pGoatcasGCSF, pGoatcasGMCSF и pMARGoatcasGMCSF, изучить наследование и копийность трансгенов.
Оценить экспрессию генов Г-КСФ и ГМ-КСФ человека в различных тканях и органах лактирующих и нелактирующих трансгенных животных с помощью ОТ ПЦР.
Провести иммунофлуоресцентный анализ экспрессии гемопоэтических факторов Г-КСФ и ГМ-КСФ человека в молочной железе в различных физиологических состояниях; и в тканях основных внутренних органов трансгенных мышей.
Используя количественный иммуноферментный метод (ELISA) определить уровень секреции белков Г-КСФ и ГМ-КСФ человека в молоке и сыворотке крови трансгенных мышей.
Посредством иммуноблоттинга определить наличие посттрансляционных модификаций белков Г-КСФ и ГМ КСФ человека, синтезируемых в молоке трансгенных мышей.
С использованием теста на образование колоний из кроветворных клеток предшественников пуповинной крови человека оценить биологическую активность белков Г-КСФ и ГМ-КСФ человека, синтезируемых в молоке трансгенных мышей.
Научная новизна
Проведена функциональная характеристика генно-инженерных конструкций pGoatcasGCSF, pGoatcasGMCSF и pMARGoatcasGMCSF, способных обеспечивать экспрессию генов Г КСФ и ГМ КСФ человека в молочной железе трансгенных мышей.
Впервые для создания вектора экспрессии использована 5’ фланговая область гена α-S1-казеина козы, включающая в себя 1944 п.н. 5’ регуляторный район и 1443 п.н. последовательность, содержащую экзон 1, интрон 1 и 8 п.н. экзона 2.
Впервые показано, что данная нуклеотидная последовательность обеспечивает корректную и умеренную тканепецифичную экспрессию генов Г-КСФ и ГМ-КСФ человека в молочной железе трансгенных мышей, не нарушая гематологические показатели у трансгенных животных.
В результате изучения функциональных характеристик вектора pMARGoatcasGMCSF получены данные, свидетельствующие о негативном влиянии MAR элемента дрозофилы на экспрессию трансгена у мышей в случае включения его в 5’ область генно-инженерной конструкции pGoatcasGMCSF.
В работе проведена оценка влияния гомозиготного состояния трансгена на его экспрессию. Показано, что в большинстве случаев данный подход позволяет увеличить продукцию рекомбинантного белка.
Положения, выносимые на защиту
5’ фланговая область гена α-S1-казеина козы длиной 3387 п.н., включающая в себя регуляторный район длиной 1944 п.н., способна обеспечивать умеренную, стабильную и тканеспецифичную экспрессию трансгенов с гемопоэтическими гранулоцит колониестимулирующим и гранулоцит-макрофаг колониестимулирующим факторами человека в клетках молочных желез лактирующих трансгенных мышей.
Экспрессия трансгенов с гемопоэтическими факторами человека не зависит от места их интеграции в реципиентный геном и количества копий в случае тандемного характера встройки.
Рекомбинантные белки гемопоэтических факторов человека секретируются в молоко трансгенных мышей, имеют нормальный профиль гликозилирования, обладают полноценной колониестимулирующей активностью и не нарушают собственный гемопоэз трансгенных животных.
Инсуляторная активность MAR-элемента дрозофилы в составе трансгена с гранулоцит-макрофаг колониестимулирующим фактором человека не подтвердилась.
Практическая значимость. Исходя из результатов, полученных в данной работе, мы можем рекомендовать использование генно-инженерных конструкций pGoatcasGCSF и pGoatcasGMCSF для создания трансгенных коз-биореакторов. К настоящему времени генно-инженерная конструкция pGoatcasGCSF уже использована сотрудниками Факультета репродукции мелкого рогатого скота университета штата Сеара (Бразилия) для создания трансгенных коз. Получены первые животные, секретирующие белок Г-КСФ человека в молоко.
Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на отчетной конференции по программе президиума РАН "Биоразнообразие и Динамика генофондов" (Москва, 2008), XV Школе «Актуальные проблемы биологии развития» (Звенигород, 2008), V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), IV международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки» (2010, Москва), Международной научной студенческой конференции (2011, Новосибирск) и 10th Transgenic Technology Meeting (Флорида, США, 2011).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе были использованы:
- генно-инженерные конструкции pGoatcasGCSF, pGoatcasGMCSF и pMARGoatcasGMCSF, созданные доктором Г.А. Дворянчиковым (Университет Майами, США) и доктором И.В. Бабкиным (ИЦиГ СО РАН, Новосибирск).
- Коммерческие препараты “Granulen” и “Filgrastim” -рекомбинантные белки Г-КСФ, полученные в бактериальной системе E.coli.
- Рекомбинантный негликозилированный ГМ-КСФ, полученный в бактериальной системе E.coli, любезно предоставлен доктором И.П. Гилевой (НПО «Вектор», Новосибирск).
Для выделения суммарной РНК использовался Trizol reagent (Life Technology, USA), согласно рекомендациям производителя. Для синтеза кДНК использовали набор реактивов Reverse Transcription System (Pronega, USA).
Иммунофлуоресцентный анализ криостатных срезов органов и тканей трансгенных мышей проводили с использованием моноклональных антител против Г-КСФ и ГМ-КСФ человека (Santa Cruz, USA).
Для определения копийности трансгенных вставок использовали количественный ПЦР-анализ с использованием набора реактивов Синтол (Москва, Россия).
Иммуноблоттинг белка Г-КСФ в образцах молока трансгенных мышей проводили с использованием поликлональных антител против Г-КСФ и ГМ-КСФ человека (Santa Cruz).
Количественное определение содержания белков Г-КСФ и ГМ-КСФ человека в молоке и сыворотке крови проводили с помощью иммуноферментного анализа ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), используя наборы реактивов компании “Quantikine”: “Human G-CSF”, “Human GM CSF” (R&D Systems), USA.
Подсчет форменных элементов крови частично производился с использованием гемоцитометра Hemolux 19 (Mindray, Shenzhen, China).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Изучение трансгенных мышей, несущих конструкцию pGoatcasGCSF
Создание трансгенных мышей
Генетическая конструкция, использованная в работе для получения трансгенных мышей, была получена доктором Г.А. Дворянчиковым (Университет Майами, США). 5’-регуляторная область гена αS1-казеина козы, размером 3387 п.н. была синтезирована с помощью амплификации геномной ДНК козы. Этот фрагмент включает все известные регуляторные сайты, охарактеризованные к настоящему времени (Ramunno et al., 2004). 3’-нетранслируемая область гена αS1-казеина коровы включала в себя 1518 п.н. вместе с экзонами 18 и 19. Общая длина вектора, получившего название pGoatcasGCSF, составила 6409 п.н. (рис. 1).
Рис. 1. Схематическое изображение вектора pGoatcasGCSF, использованного для создания трансгенных мышей.
Очищенная ДНК была инъецирована в мужской пронуклеус зигот мыши (7-10 нг/мкл). Инъецированные одноклеточные эмбрионы были перенесены реципиентам. Среди родившихся животных были идентифицированные четыре трансгенные мыши: две самки - #57 и #78, и два самца - #60 и #83 (рис.2).
Рис. 2. Идентификация трансгенных мышей методом ПЦР с использованием праймеров PrA-PrB (1) и PrC-PrD (2). #58, #60, #78 и #83 – трансгенные фаундерные животные. K+ - положительный контроль, K- - отрицательный контроль, L100 – маркер.
Все первичные трансгенные мыши оказались фертильными и посредством скрещивания с нетрансгенными животными линии С57Bl/6 основали четыре индивидуальные линии. Чтобы выяснить, влияет ли гомозиготность трансгена на экспрессию гена Г-КСФ человека, с помощью анализирующего скрещивания были получены гомозиготные по трансгену pGoatcasGCSF мыши линий #78 и #83.
Определение количества копий трансгена pGoatcasGCSF
Для определения копийности трансгенных встроек был использован метод qPCR. Референсным геном был выбран Ltb, представленный в геноме в единственном экземпляре. Было установлено, что генетическая конструкция pGoatcasGCSF присутствует в геноме гомозиготных мышей линий #78 в количестве двух копий, а в геноме гомозиготных мышей линии #83 – в количестве пяти копий. Количество копий приведено в расчете на гаплоидный геном.
Экспрессия гена Г-КСФ человека в различных органах и тканях трансгенных мышей
В молочных железах трансгенных самок линий #58, #60, #78 и #83 обнаружено присутствие транскрипта гена Г-КСФ человека (рис. 3). |
