На правах рукописи
Прудникова Татьяна Юрьевна
Изучение гена D-глюкуронил С5-эпимеразы как возможного гена-супрессора опухолевого роста
03.00.04 – биохимия
03.00.03 – молекулярная биология
А В Т О Р Е Ф Е Р А Т
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Новосибирск – 2009
Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (Новосибирск, Россия)
Научный руководитель:
кандидат биологических наук Григорьева Эльвира Витальевна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Душкин Михаил Иванович
кандидат биологических наук Катохин Алексей Вадимович
Ведущая организация:
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск.
Защита диссертации состоится «___»_________2009 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д.001.034.01 в ГУ Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2; тел. 8 (383) 333-54-81).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательского института биохимии СО РАН.
Автореферат разослан «___» _________2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук,
старший научный сотрудник Г.С. Русских
Общая характеристика работы
Актуальность темы. В настоящее время открыто множество биологических молекул, которые участвуют в процессах злокачественной трансформации. К таким молекулам относятся и протеогликаны (ПГ) - сложные макромолекулы, состоящие из белкового кора и присоединённых к ним цепей гликозаминогликанов (ГАГ). Протеогликаны находятся на клеточной поверхности и во внеклеточном матриксе (ВКМ), выполняя разнообразные функции, в том числе связанные с участием в межклеточных взаимодействиях и во взаимодействиях клетки с ВКМ за счет связывания с различными компонентами ВКМ, включая факторы роста и их рецепторы (Ori et al., 2008; Lindahl et al., 2007, Santra et al., 2002). Изменения экспрессии или локализации этих молекул, так же как и ферментов, вовлеченных в их биосинтез и деградацию, ассоциированы с измениями пролиферативной активности клеток (Yip et al., 2006; Li et al., 2008), изменениями их подвижности (Gordon et al., 2008; Giordano et al., 2008) и ангиогенеза (Bix et al., 2008).
Известно, что при злокачественной трансформации меняется структура, состав, степень сульфатирования (Theocharis et al., 2003; Achilleas et al., 2002) и эпимеризации протеогликанов – замещения остатков глюкуроновой кислоты (GlcUA) на идуроновую (IdoUA) (Timar et al., 2002; Valla et al., 2001). Содержание остатков идуроновой кислоты в составе протеогликанов (ПГ) имеет важное значение для нормального функционирования гепарансульфат протеогликанов (ГСПГ) (Westergren-Thorsson et al., 1991). Показано, что содержание идуронового компонента коррелирует с антипролиферативным эффектом гепарансульфат протеогликанов – ГС, богатые остатками идуроновой кислоты (IdoUA) оказывали значительный антипролиферативный эффект на клетки мезотелиомы, тогда как ГС, имеющие в своем составе в основном остатки глюкуроновой кислоты, не имели подобного эффекта (Syrokou et al., 1999). При опухолях прямой кишки (Tsara et al., 2002), толстого кишеника (Theocharis, 2002), опухолях поджелудочной железы (Skandalis et al., 2006a) и карциномы гортани (Skandalis et al., 2006b) содержание идуроновой кислоты в углеводных цепях ГАГ версикана и декорина снижается. Изменения в структуре и соотношении GlcUA/IdoUA в опухоли могут свидетельствовать о том, что, возможно, при злокачественной трансформации происходит нарушение в процессе биосинтеза ПГ, в частности в процессе эпимеризации.
Одним из ключевых ферментов биосинтеза гепарансульфат протеогликанов является D-глюкуронил С5-эпимераза (GLCE). Этот фермент проводит реакцию эпимеризации остатков глюкуроновой кислоты в идуроновую в углеводных цепях ГСПГ, участвующих в поддержании межклеточного контакта и передаче сигнальной информации. Эпимераза является единственным ферментом биосинтеза ГСПГ о котором практически ничего не известно. До настоящего времени эпимераза изучалась исключительно как фермент биосинтеза ПГ – определена ее субстратная специфичность, кинетические свойства (Hagner-McWhirter et al., 2000b), механизмы эпимеризации глюкуронила (Prihar et al., 1980; Backstrom et al., 1979), клонирована кДНК эпимеразы из легкого быка (Li et al., 1997), мышиной печени (Li et al., 2001) и клеток мышиной мастоцитомы (Crawford et al., 2001).
Разрушение гена, кодирующего D-глюкуронил С5-эпимеразу у мыши, приводило к гибели эмбрионов, у которых были обнаружены дефекты развития почек, легких, нарушения в костной ткани (Hagner-McWhirter et al., 2004). Эти данные свидетельствуют о том, что экспрессия/акивность эпимеразы может иметь важное значение для правильного формирования органов.
Отсутствие других данных о D-глюкуронил С5-эпимеразе не позволяет получить представление о том, есть ли какая-либо тканеспецифичность в экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы у человека, изменяется ли экспрессия/активность этого фермента при злокачественной трансформации и существует ли связь между изменением состава ПГ и изменением экспрессии/активности D-глюкуронил С5-эпимеразы.
Нами была высказана гипотеза, что при злокачественной трансформации клеток происходит нарушение экспрессии либо активности D-глюкуронил С5-эпимеразы, что приводит к изменению структуры и состава ГСПГ и пролиферативной активности клеток.
Цель данной работы: исследовать роль D-глюкуронил С5-эпимеразы в регуляции клеточной пролиферации при злокачественной трансформации.
В соответствии с целью, были поставлены следующие задачи:
Определить уровень экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в различных тканях человека
Исследовать экспрессию D-глюкуронил С5-эпимеразы в клинических образцах злокачественных и доброкачественных опухолей и культурах опухолевых клеток рака легкого, молочной и предстательной железы человека.
Изучить влияние экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы на пролиферативную активность опухолевых клеток карциномы молочной железы (MCF7), карциномы предстательной железы (LNCaP) и мелкоклеточного рака легкого (U2020) in vitro.
Изучить влияние D-глюкуронил С5-эпимеразы на формирование экспериментальных опухолей in vivo (мыши SCID) и провести анализ ее экспрессии в выросших опухолях.
Научная новизна работы
В данной работе впервые было показано, что:
ген D-глюкуронил С5-эпимеразы экспрессируется во всех изученных нормальных тканях человека (молочная железа, легкое, тимус, щитовидная железа, почка, кишечник, предстательная железа) и показана тканеспецифичность экспресии данного гена.
при злокачественной трансформации ткани молочной железы и предстательной железы человека происходит снижение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы по сравнению с нормальной тканью. Снижение экспрессии гена эпимеразы детектируется даже в неизмененной ткани, окружающей опухоль молочной железы.
восстановление экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы оказывает антипролиферативное влияние на культуру опухолевых клеток различного происхождения - культуру клеток рака молочной железы линии MCF7, рака предстательной железы линии LNCaP и мелкоклеточного рака легкого линии U2020.
восстановление экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы оказывает супрессирующий эффект на формирование и рост экспериментальных опухолей у иммунодефицитных мышей линии SCID
Научно-практическая значимость
Полученные данные о снижении гена D-глюкуронил С5-эпимеразы не только в опухоли молочной железы, но и в неизмененной ткани, окружающей опухоль, привлекает внимание к этому гену как новому возможному маркеру доклинической диагностики рака молочной железы.
Способности эпимеразы супрессировать пролиферацию опухолевых клеток in vitro и рост экспериментальных опухолей in vivo дают основу для дальнейших исследований гена D-глюкуронил С5-эпимеразы как возможного кандидата для генотерапии злокачественных новообразований.
Основные положения, выносимые на защиту
Ген D-глюкуронил С5-эпимеразы человека экспрессируется во всех исследованных тканях человека, с наивысшим уровнем экспрессии в молочной железе и легком и меньшей экспрессией в тканях почки, тимуса и щитовидной железы.
В злокачественных опухолях молочной и предстательной железы человека происходит значительное снижение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы, при гиперплазии и в доброкачественных опухолях экспрессия гена в большинстве случаев сохраняется на нормальном уровне.
Усиление экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках при введении плазмидной конструкции, несущей полноразмерную кДНК эпимеразы, супрессирует пролиферацию опухолевых клеток in vitro для клеточных линий MCF7 (рак молочной железы), LNCaP (рак предстательной железы) и U2020 (мелкоклеточный рак легкого).
D-глюкуронил С5-эпимераза подавляет формирование экспериментальных опухолей in vivo у мышей SCID – при инокуляции экспрессирующих эпимеразу клетками U2020 опухоли образовались лишь у 5 из 10 экспериментальных мышей, в выросших опухолях экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы практически отсутствует.
Апробация работы
Результаты работы были представлены и обсуждены на 42ой Международной Научной Студенческой Конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, Россия, 2004), на 8ой Международной школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, Россия, 2004), на Российской Научно-практической конференции «современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, Россия, 2004), на Российской Научно-практической конференции «Новые технологии в онкологии» (Барнаул, Россия, 2005) , на Мировом конгрессе по онкологии и Симпозиуме по молекулярной медицине (The World Congress on Advances in Oncology, and International Symposium on Molecular Medicine, Крит, Греция, октябрь 2004, 2005, 2006, 2007, 2008), на 6ой Европейской конференции по раку молочной железы (6th Europeam Breast Cancer Conference, Берлин, Германия, 15-19 апреля 2008), на 8ой Международной конферении по исследованию рака (8th International Conference of Anticancer Research, Кос, Греция, 2008), на Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная Онкология» (Новосибирск, Россия, 2008).
Публикации. По материалам диссертации имеется 15 печатных работ.
Структура работы. Диссертационная работа изложена на 95 страницах машинописного текста с полуторным интервалом, содержит 3 таблицы и 37 рисунков и состоит из 6 разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения результатов, выводов, а также списка цитируемой литературы, содержащего 123 зарубежных источника.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для изучения экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы использовали клинические образцы нормальной ткани (косметические операции), доброкачественных опухолей (фиброаденомы), образцы из зоны опухолевого очага и наименее измененных удаленных участков молочной железы одного и того же пациента, удаленные в ходе хирургического вмешательства. Операционный материал получали в Городской Клинической Больнице N1 г. Новосибирска, забор образцов проводили под контролем главного онколога г. Новосибирска д.м.н., проф. С. В.Сидорова, диагноз верифицирован гистологическим исследованием. От всех пациентов имеется письменное информированное согласие на участие в исследовании, эксперименты соответствуют этическим принципам Хельсинкской Декларации и стандартам биоэтического комитета ГУНИИ МББ СО РАМН. Образцы опухолей и гиперплазий предстательной железы были получены из Университета Крита, Лаборатория Клинической Вирусологии, Греция. В качестве нормальных образцов использовали ткань предстательной железы, полученную от людей, погибших в результате несчастного случая.
Суммарную РНК выделяли с использованием реагента PureLink Total RNA Purification System (Invitrogen, США) согласно рекомендациям производителя. Относительное содержание мРНК GLCE определяли методом мультиплексной ОТ-ПЦР и количественной ОТ-ПЦР в реальном времени. В качестве эндогенного внутреннего контроля были выбраны гены «домашнего хозяйства» β-актин и GAPDH. Для синтеза кДНК брали по 1 мкг РНК на пробу. Каждая проба ПЦР содержала ~100нг кДНК, 1 мкл 10x ПЦР-буфера (10 мМ Tris-HCl, 1,8 мМ MgCl2, 50 мМ KCl, pH 8,3), 10 пмоль каждого праймера, 0,1 ммоль каждого дезоксинуклеозидтрифосфата и 1 ед.акт. Taq-ДНК-полимеразы. Для гена эпимеразы, амплификация проводилась в течение 15 циклов, после чего в реакционную смесь добавляли праймеры для GAPDH и проводили еще 18 циклов амплификации. Каждую пробу амплифицировали трижды. Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 1,5 - 2% агарозном геле, гель окрашивали бромистым этидием и сканировали с помощью видеосистемы «DNA Analyzer» (Москва). Денситометрию проводили с помощью программы ”Total Lab”(Nonlinear Dynamics, UK). Содержание мРНК GLCE оценивали в относительных единицах как отношение интенсивности окрашивания специфической полосы гена эпимеразы к интенсивности полосы гена «домашнего хозяйства» GAPDH.
Количественную ПЦР в реальном времени проводили с использованием Custom GLCE TaqMan Assay (AppliedBiosystems, США) на приборе BioRad IQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System (BioRad, США). Реакционная смесь содержала ~100 нг кДНК, 1х TaqMan Universal PCR Master Mix (AppliedBiosystems, США), по 100нМ каждого праймера, 250нМ пробы. Каждая пробу амплифицировали трижды.
Детекцию белка D-глюкуронил С5-эпимеразы проводили при помощи метода Вестерн-блота. Белки разделяли электрофорезом с использованием системы Mini-Protean II Cell-system (Bio-Rad, США), переносили на PVDF мембрану (Bio-Rad Laboratories, США). Мембрану инкубировали с поликлональными антителами против GLCE человека (GenScript Corp., США). Визуализацию иммунореактивных полос проводили проводили с использованием системы ECL Plus Western blotting detection reagents (Amersham Biosciences) и рентгеновской пленки.
Иммунохимическое окрашивание проводили при помощи системы ImmunoPure Ultra-Sensitive ABC Standard Peroxidase Staining Kit (Pierce,USA) согласно инструкции производителя. Стекла с парафиновыми срезами депарафинировали при помощи ксилола и спиртов различной концентрации, демаскировку антигенов приводили при помощи раствора Unmasking solution (Vector,США). Срезы инкубировали с поликлональными антителами против GLCE человека (GenScript Corp., США) Визуализацию проводили при помощи субстрата ДАБ, ядра клеток окрашивали гематоксилином.
Клонирование гена эпимеразы проводили в экспрессирующий эписо-мальный вектор pETE/BSD с последующим переклонированием в вектор pCEP4. Последовательность вставки была подтверждена секвенированием (Dye Terminator Cycle sequencing Kit (Perkin–Elmer) на ABI PRISM 3700 genetic analyzer). Трансфекцию проводили при помощи реагента Липофектамин-плюс (Lipofectamine LTX-Plus Reagent combination (Invitrogen, США) согласно инструкции производителя. Клетки культивировали в 12-луночном планшете, в среде IMDM-L-Gln-pen/strep-10%FBS. Плазмиднyю ДНК смешивали с Липофектамином и IMDM-L-Gln средой и добавляли к клеткам. Через три часа добавляли по 300 мкл среды с двойным содержанием сыворотки (IMDM-L-gln-pen/strep-20%FBS) и культивировали 24-48 часов в CO2 инкубаторе. Для получения стабильных клонов, транзиентно-трансфецированные клетки через 48ч после трансфекции рассаживали на 10см чашки и культивировали 2-6 недель в IMDM среде, содержащей 5 мкг/мл Bsd. Отбирали одиночные клоны и растили отдельно в той же среде. Степень клеточной пролиферации определяли при помощи набора реагентов CY QUANT NF Cell Proliferation Assay (Invitrogen, USA) согласно инструкции производителя. Клетки рассаживали плотностью 100-500 клеток/лунку в 8-12 лунок 96-луночного микропланшета. Количество ДНК в лунках измеряли каждые 24 часа – удаляли среду, добавляли по 50мкл флуоресцентного красителя и инкубировали 30 минут при 37 оС. Интенсивность флуоресцентного свечения каждого образца измеряли при помощи Fluorescence Microplate Reader (SPECTRA max, “Molecular Devices”, Великобритания), с детекцией на длине волны 530нм. Способности к формированию опухолей in vivo клетками исходных линий U2020 и клетками, стабильно экспрессиирующими эпимеразу, определяли методом инокуляции клеток иммунодефицитным мышам линии SCID. Для инъекции использовали клетки в концентрации 2-3*106 клеток на 100 мкл, каждому животному инокулировали 2-3*106 клеток в смеси с Матригелем согласно инструкции производителя (BD Biosciences, Belgium).
Наблюдения за формированием опухолей проводились дважды в неделю в течение 35 дней, выросшие опухоли были использованы для определения уровня экспрессии эпимеразы методом ПЦР в реальном времени и иммуногистохимического анализа, как описано выше.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы STATISTICA 6.0. Результаты представлены в виде M ± m, где М - среднее, m – ошибка среднего. Для оценки достоверности проводили по критерию Манна-Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Изучение экспрессии эпимеразы в нормальных и опухолевых тканях человека.
Для того, чтобы оценить уровень экспрессии эпимеразы в различных тканях человека был проведен анализ экспрессии гена эпимеразы методом мультиплексной ОТ-ПЦР с использованием кДНК из различных тканей (Multiple cDNA Panel, Clontech) (Рис.1.)
А.
Б.
GLCE
GAPDH
Рисунок 1. Экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы в различных тканях человека. А. – Электрофореграмма продуктов мультиплексной ПЦР. М – маркер молекулярного веса, 100bp (Fermentas), 1 – молочная железа, 2 – легкое, 3 – щитовидная железа, 4 – тимус, 5 – почки. 6 – тонкий кишечник. Б – Полуколичественный анализ экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в различных тканях человека. Каждую реакцию проводили трижды, приведены средние значения ± SD .
Полученные результаты показали, что ген эпимеразы экспрессируется у человека на достаточно высоком уровне в молочной железе, в легких и в меньшей степени в щитовидной железе, тимусе и почках. Таким образом, мо-лочная железа была выбрана нами для дальнейшего анализа экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы.
Уровень экспрессии эпимеразы в нормальной ткани молочной железы человека был изучен при помощи набора праймеров для гена GLCE (NM015554). Поскольку нет никакой информации о существовании изоформ или альтернативно сплайсированных форм эпимеразы, то нами были подобраны комбинации праймеров для различных участков гена эпимеразы (Рис.2).
Рисунок 2. Схема расположения сайтов для праймеров для амплификации различных участков гена D-глюкуронил С5-эпимеразы.
Экспрессия GLCE была исследована в нормальной ткани молочной железы человека (от пациентов, не страдающих злокачественными заболеваниями – косметические операции) и в клинических образцах молочной железы (опухолевая и контрольная ткань от одного и того же пациента) при помощи 6 различных пар праймеров.
 
Рисунок 3. Анализ экспрессии GLCE методом мультиплексной ПЦР.
(А) Электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР из нормальной ткани молочной железы человека. (Б) Электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР из клинических образцов опухолевой (О) и контрольной (К) ткани одного пациента. 1-6 – различные пары праймеров. В качестве внутреннего стандарта использовался ген GAPDH.
В нормальной ткани молочной железы все праймеры давали фрагмент ДНК ожидаемого размера, приблизительно одинаковой интенсивности (Рис. 3А). Однако у некоторых пациентов в опухолевых образцах наблюдалось различие в интенсивности и размерах амплифицированных фрагментов (Рис. 3Б). Так, пара праймеров на 4 экзон (1 и 2 пара) в опухоли и контроле давала полосы одинаковой интенсивности, тогда как пары 3, 4 и 5 (затрагивающие 2 и 3 экзон) показывали значительные различия в опухоли по сравнению с контролем (Рис.3Б) – полоса в опухоли была заметно меньшей интенсивности, 4 пара праймеров давала фрагмент меньшего размера. Возможным объяснением такого различия в экспрессии при использовании различных пар праймеров может быть альтернативный сплайсинг или патологическое укорочение мРНК эпимеразы в опухолях молочной железы в районе 3 экзона.
Таким образом, пара праймеров 4 была выбрана нами для дальнейшего анализа экспрессии и для выявления возможного сплайсинга D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолях молочной железы методом мультиплексной ПЦР.
Для сравнительного анализа экспрессии GLCE в тканях молочной железы человека были использованы три типа образцов, обозначенные как норма, контроль и опухоль. Нормальными образцами считались клинические образцы молочной железы пациентов, не страдающих злокачественными новообразованиями, полученные в результате косметической хирургии. Опухолевая и контрольная ткань – центральная часть опухоли и максимально удаленный образец неизмененной ткани железы одного и того же пациента. Выделенная РНК использовалась в дальнейшем ОТ-ПЦР анализе с использованием праймеров для GLCE (пара 4) и внутреннего контроля гена GAPDH (Рис. 4).
Экспрессия гена эпимеразы была определена в 10 образцах нормальной ткани и 43 парах образцов опухолевой и контрольной ткани, при прочих равных условиях. Уровень мРНК гена GLCE оценивали в относительных единицах как отношение интенсивности амплифицированного фрагмента GLCE к интенсивности фрагмента гена GAPDH. Относительный уровень экспрессии гена эпимеразы определяли с помощью компьютерной программы ”Total Lab, Nonlinear Dynamics, UK”.
 
Рисунок 4. Анализ экспрессии гена эпимеразы в нормальной, контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека. (А) Относительный уровень экспресссии гена эпимеразы в норме (Н), контроле (К) и опухоли (О) у различных (1-125) пациентов по отношению к гену GAPDH. Каждую реакцию проводили трижды, приведены средние значения ± SD.
Обнаружено, что уровень мРНК D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухоли был значительно ниже, чем в нормальной ткани – у 82% исследованных пациентов экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы снижена более чем в два раза. Более того, в большинстве случаев уже в контрольной ткани было отмечено снижение экспрессии эпимеразы по сравнению с нормой.
Анализ экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека
Количественную оценку yровеня экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы определяли методом количественной ПЦР в реальном времени. Были подобраны специфические праймеры и проба (TaqMan) на область 3 экзона гена эпимеразы, дополнительно исследовано 11 нормальных образцов молочной железы человека и 31 пара контрольных и опухолевых образцов (Рис. 5).
 
Рисунок 5. Анализ экспрессии гена эпимеразы методом количественной ОТ-ПЦР в реальном времени. (А) Экспрессия эпимеразы в нормальной (Н), контрольной (К) и опухолевой (О) ткани молочной железы человека (TaqMan Assay, Applied Biosystems). Каждую реакцию проводили трижды, приведены средние значения ± SD.
Результаты количественной ОТ-ПЦР в реальном времени подтвердили имеющиеся данные мультиплексной ОТ-ПЦР. Согласно полученным данным, в номальной ткани эпимераза экспрессируется на уровне 1000-2000 молекул (на 1000 молекул актина). Среди опухолевых пациентов лишь у одного уровень экспрессии эпимеразы и в опухоли, и в контроле оказался сопоставимым с нормальной тканью (№133). Большинство пациентов имели сниженную экспрессию эпимеразы (не больше 387-396 молекул эпимеразы/1000 молекул актина) как в опухоли, так и в прилежащей контрольной ткани.
Все пациенты были разделены на 4 группы соответственно изменению уровня экспрессии эпимеразы в контрольной и опухолевой тканях: I – нормальный уровень экспрессии в контрольной и опухолевой ткани (К+О+), II – нормальная экспрессия эпимеразы в контроле, сниженная в опухоли – (К+О-), III – экспрессия эпимеразы снижена как в контрольной, так и в опухолевой тканях (К-О-), IV – сниженная экспрессия эпимеразы в контроле, при нормальной экспрессии эпимеразы в опухоли (К-О+). Как видно из диаграммы (Рис. 6) только 16% опухолей и 23% контрольных образцов показывали экспрессию эпимеразы, сопоставимую с нормой.
Рисунок 6. Диаграмма распределения пациентов по степени экспрессии эпимеразы.
Полученный данные подтвердили результаты мультиплексной ПЦР – только в 82-84% опухолей молочной железы человека уровень экспрессии эпимеразы снижен более чем в 2 раза по сравнению с нормальной тканью (Медиана 2067/65 p<0.0001). Причем в 77% случаев экспрессия эпимеразы была снижена как в опухолевой, так и в контрольной ткани. Статистический анализ проводили при помощи критерия Манн-Уитни (Медиана 2067/71, p<0.0001).
Таким образом, мы наблюдали изменение экспрессии гена эпимеразы при злокачественной трансформации ткани молочной железы. Однако оставалось неясным, на какой стадии патологии молочной железы происходит снижение экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы, и может ли она служить ранним доклиническим маркером злокачественной трансформации молочной железы. Поэтому следующей задачей было исследовать экспрессию гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в доброкачественных новообразованиях молочной железы человека.
Анализ экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы в доброкачественных опухолях молочной железы человека.
Экспрессия гена эпимеразы была определена в 21 образце доброкачественной опухоли (фиброаденомы) молочной железы методом мультиплексной ОТ-ПЦР и количественной ПЦР в реальном времени (Рис. 7).
GLCE
GAPDH
Рисунок 7. Анализ экспрессии гена эпимеразы в доброкачественных опухолях молочной железы человека. М – маркер молекулярного веса, 100bp (Fermentas). H1-H4 – образцы нормальной ткани молочной железы человека, Ф1-Ф3 – образцы фиброаденомы молочной железы человека.
Методом мультиплексной ОТ-ПЦР было показано, что в 4 клинических образцах фиброаденомы молочной железы экспрессия GLCE полностью отсутствовала, тогда как в 17 образцах ее уровень был сопоставим с нормой.
Рисунок 8. Анализ экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в фиброаденомах молочной железы человека (12-28). 1-11 – нормальные образцы. Каждую реакцию проводили трижды, приведены средние значения ± SD
Данные количественной ПЦР в реальном времени подтвердили результаты мультиплексной ПЦР – у 17 пациентов уровень экспрессии эпимеразы был сопоставим с нормальным (1000-2000 молекул эпимеразы на 1000 молекул актина), и лишь у 4 пацентов уровень экспрессии был значительно снижен (10-100 молекул эпимеразы на 1000 молекул актина).
Согласно полученным данным, снижение экспрессии эпимеразы происходило в 20% случаев доброкачественных новообразований (медиана 2067/978, p<0.01). Однако эти изменения выявлены лишь на уровне мРНК, поэтому следующим этапом данной работы был анализ содержания белковой молекулы эпимеразы при злокачественных и доброкачественных патологиях молочной железы человека.
Определение присутствия белка D-глюкуронил С5-эпимеразы
Присутствие белка эпимеразы в нормальной, контрольной и опухолевой ткани изучали методом Вестерн-блоттинга при помощи поликлональных антител, специфичной для белковой молекулы эпимеразы (Рис. 9).
Н1 Ф1 Н2 Ф2 К1 О1 К2 О2
Рисунок 9. Вестерн-блот анализ наличия белковой молекулы эпимеразы в образцах молочной железы человека. Н – нормальная ткань молочной железы, К – контрольная ткань молочной железы, О – опухолевая ткань молочной железы человека; различные пациенты.
Белок эпимеразы (68кДа) выявлялся в контрольной ткани всех пацентов с диагнозом рак молочной железы и во всех образцах фиброаденомы молочной железы (21 образец). Однако 84% опухолевых образцов показывали значительное снижение либо полное исчезновение эпимеразного белка.
Полученные данные свидетельствуют о том, что экспрессия эпимеразы значительно снижается в опухолях молочной железы человека, причем это можно наблюдать как на транскрипционном, так и на трансляционном уровне. Возможно, данный эффект каким-то образом связан с тенденцией окружающей опухоль ткани молочной железы к озлокачествлению – в нормальной ткани присутствует и мРНК, и белок эпимеразы, а в ткани, окружающей опухоль экспрессия мРНК может быть уже снижена, хотя белок еще детектируется. В опухоли наблюдается снижение как мРНК, так и белка эпимеразы. В случаях с доброкачественными опухолями (фиброаденомами) молочной железы у некоторых пациентов наблюдается практически полное исчезновение экспрессии эпимеразы на уровне мРНК.
Является ли снижение экспрессии эпимеразы в опухоли специфичным лишь для молочной железы, либо данный эффект проявляется в различных типах опухолей, оставалось неизвестным. Поэтому следующим этапом нашей работы был анализ экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в злокачественных опухолях и гиперплазиях предстательной железы.
Анализ экспрессии гена D-глюкурнил С5-эпимеразы в злокачественных опухолях и гиперплазиях предстательной железы человека
Уровень экспрессии гена эпимеразы в образцах предстательной железы определяли методом ПЦР в реальном времени с использованием технологии TaqMan. В исследовании использовали 5 нормальных образцов (от людей, погибших в результате несчастного случая), 42 клинических образца злокачественных опухолей предстательной железы (карциномы предстательной железы) и 41 образец гиперплазии предстательной железы (Рис.10) .
Опухолевые образцы
Образцы гиперплазии
 
Б.
А.
Рисунок 10. Диаграммы изменения экспрессии GLCE методом ОТ-ПЦР в реальном времени в опухолевых образцах предстательной железы человека и гиперплазиях.
Согласно полученным данным, снижение экспрессии гена эпимеразы происходило у 46% пациентов со злокачественными опухолями предстательной железы и лишь у 7% пациентов с доброкачественными новообразованиями (более чем в 2 раза по сравнению с нормальной тканью). Остальные образцы имели уровень экспрессии эпимеразы, сопоставимый с нормой либо выше нормального.
Таким образом, было показано, что уровень экспрессии гена эпимеразы снижается в опухолях не только молочной железы, но и предстательной железы. Возможно, что ген эпимеразы каким-то образом вовлечен в процесс злокачественной трансформации, и снижение экспрессии или активности этого фермента играют важную роль в индукции опухолевого роста.
Поэтому следующим этапом данной работы было изучение влияния восстановления экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы на пролиферативную активностькультуры опухолевых клеток in vitro и на формирование опухолей in vivo.
|
