На правах рукописи
ДРУЖЕВСКАЯ АНАСТАСИЯ МИХАЙЛОВНА
ПОЛИМОРФИЗМЫ ГЕНОВ
МИОГЕННОГО ФАКТОРА 6 И АЛЬФА-АКТИНИНА-3
И ИХ АССОЦИАЦИЯ СО СТРУКТУРОЙ И ФУНКЦИЕЙ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ ЧЕЛОВЕКА
03.01.04 - Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург – 2010
Работа выполнена в Секторе биохимии спорта Федерального государственного учреждения «Санкт-Петербургского научно-исследовательского института физической культуры» (ФГУ СПб НИИФК).
Научный руководитель:
кандидат биологических наук, доцент Астратенкова Ирина Викторовна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Розенгарт Евгений Викторович
доктор медицинских наук, профессор Шавловский Михаил Михайлович
Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им.акад. И.П.Павлова.
Защита состоится «….» ……………2010 года в …. часов на заседании совета Д 001.022.03 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, Каменноостровский пр., д.69/71
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Ак. Павлова, д.12
Автореферат разослан «….»…………..2010 года.
Ученый секретарь диссертационного совета
Доктор биологических наук, профессор Л.В. Пучкова
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы.
После успешной реализации многолетней международной программы «Геном человека» появилась возможность выявлять гены, тесно ассоциированные с формированием, развитием и проявлением физических качеств человека. Генетические факторы наряду с эпигенетическими и средовыми играют важную роль в детерминации индивидуальных различий в проявлении физических качеств и адаптационных возможностях человека [Ahmetov and Rogozkin, 2009]. Последняя генетическая карта физической активности, выпущенная группой американских ученых, включает 239 генов и 119 локусов количественных признаков, полиморфизмы которых ассоциированы с развитием и проявлением выносливости, быстроты и силы, а также связаны со структурой скелетных мышц, тренируемостью и ограничением физической деятельности [Bray et al., 2009]. Фенотипы физической активности являются высоко полигенными [Williams, 2008], поэтому для создания молекулярных диагностических комплексов необходимо увеличивать объем исследований в области функциональной геномики и расширять спектр полиморфных генов, ассоциированных с физической активностью.
Поиск полиморфных генов-кандидатов и их использование в изучении генетической предрасположенности к выполнению различных физических нагрузок основан на знании молекулярных механизмов мышечной деятельности и предположении, что полиморфизм данного гена может повлиять на уровень метаболических процессов в организме [Рогозкин и др., 2004]. Анализ исследований в области молекулярной биологии и генетики физической активности, а также понимание необходимости миогенного фактора 6 (MYF6) и структурного белка α-актинина-3 для формирования скелетных мышц и поддержания целостности мышечного аппарата у взрослого человека повлияли на выбор генов-кандидатов. MYF6 регулирует экспрессию множества генов и является одним из ключевых факторов, выполняющих важную функцию в миогенезе на эмбриональной стадии развития и репарации скелетных мышц во взрослом организме человека [Braun et al., 1990; Kassar-Duchossoy et al., 2004]. Известно также, что MYF6 принимает участие в детерминации композиции мышечных волокон [Pin and Konieczny, 2002; Walters et al., 2004] и гипертрофии скелетных мышц при физических нагрузках [Psilander et al., 2003; Dieli-Conwright et al., 2009]. Альфа-актинин-3, связывающий актиновые филаменты в быстрых гликолитических мышечных волокнах, стабилизирует сократительный аппарат скелетных мышц [Imamaura et al., 1988; Beggs et al., 1992]. Кроме выполнения механической функции α-актинин-3 взаимодействует с белками, вовлеченными во множество сигнальных и метаболических путей, что говорит о его возможной регуляторной роли [Mills et al., 2001]. Отсутствие α-актинина-3 в быстрых мышечных волокнах, вызванное нонсенс-мутацией в кодирующей последовательности гена ACTN3, может стать причиной пониженного уровня развития скоростно-силовых качеств человека [Yang et al., 2003; Niemi and Majamaa, 2005; Papadimitriou et al., 2007]. На этом основании можно предположить, что вариации генов MYF6 и ACTN3 способны повлиять на метаболизм мышечной ткани и процессы адаптации скелетных мышц к физическим нагрузкам.
Цель настоящей работы заключалась в изучении ассоциации полиморфизмов генов MYF6 и ACTN3 со структурой и функцией скелетных мышц человека.
Задачи исследования:
Разработать методику определения полиморфизма C964T гена MYF6.
Провести анализ полиморфизмов C964T гена MYF6 и R577X гена ACTN3 и распределения частот генотипов и аллелей у жителей России (контрольная группа) и в группах спортсменов различных специализаций и квалификаций.
Определить ассоциацию полиморфизмов C964T гена MYF6 и R577X гена ACTN3 с морфофункциональными показателями человека и морфометрическими параметрами скелетных мышц у спортсменов и в группах физически активных здоровых людей.
Проверить гипотезу о возможной ассоциации полиморфизмов C964T гена MYF6 и R577X гена ACTN3 со степенью гипертрофии мышечных волокон и отдельных мышц в результате длительных тренировок смешанной и силовой направленности.
Научная новизна.
Впервые определены частоты генотипов и аллелей по гену MYF6 (C964T полиморфизм) и ACTN3 (R577X полиморфизм) у жителей России, Великобритании и у российских спортсменов. Обнаружена ассоциация С964Т полиморфизма гена MYF6 (964TT генотип) со спортивной деятельностью, направленной на развитие выносливости. Результаты одномоментных и динамических исследований по поиску ассоциации C964T полиморфизма гена MYF6 с составом мышечных волокон и размером отдельных мышц позволяют отнести генотип 964ТТ по MYF6 к генетическим маркерам мышечной работоспособности. При проведении исследования «случай-контроль» впервые показано, что 577RR генотип по гену ACTN3 дает преимущество не только для развития и проявления скорости и силы, но и для качества выносливости. Результаты сравнительного анализа R577X полиморфизма гена ACTN3 с морфофункциональными параметрами мышечной деятельности в результате систематической мышечной деятельности подтверждают благоприятное влияние 577R аллеля на развитие и проявление физических качеств человека.
Научно-практическое значение.
Результаты данной работы вносят вклад в развитие геномики физической активности, а также биохимии и физиологии мышечной деятельности. В комплексе с другими генами-маркерами мышечной деятельности генотипирование по генам ACTN3 и MYF6 может быть использовано для определения индивидуальной предрасположенности к развитию и проявлению физических качеств человека. Проведение такого генетического теста спортсменам и лицам, занимающимся фитнесом, позволит индивидуализировать тренировочный процесс для оптимального развития двигательных качеств и повышения мышечной массы, а также поможет сохранить здоровье на протяжении спортивной карьеры. Предложенный комплексный подход исследования полиморфизмов – от ассоциации со спортивной деятельностью до анализа мышечных волокон – может быть применен для проведения молекулярно-генетических исследований по поиску взаимосвязи «генотип-фенотип». Более того, знания о генетических маркерах мышечной деятельности могут помочь в правильной организации экспериментов, в которых необходимо учитывать принцип генетической однородности выборок (одинаковое число аллелей, ассоциированных с определенным мышечным фенотипом).
Основные положения, выносимые на защиту:
Полиморфизмы С964Т гена MYF6 и R577X гена ACTN3 ассоциируются с физической активностью человека. Частота 964ТТ генотипа (статистически значимо) и 964Т аллеля (статистически незначимо) гена MYF6 выше в группе спортсменов, занимающихся видами спорта с преимущественным проявлением выносливости по сравнению с контрольной группой; частота 577RR генотипа и 577R аллеля гена ACTN3 превалирует в группе спортсменов, занимающихся скоростно-силовыми видами спорта и видами спорта на выносливость. На этом основании MYF6 TT генотип можно рассматривать как маркер предрасположенности к развитию и проявлению выносливости, а ACTN3 R аллель и RR генотип – к физической деятельности любой направленности.
С964Т полиморфизм гена MYF6 ассоциирован с размером мышц и мышечных волокон. Носители 964ТТ генотипа и 964Т аллеля обладают большей площадью поперечного сечения (ППС) мышц и мышечных волокон за счет преобладания медленных волокон. R577X полиморфизм гена ACTN3 не связан с исходным размером мышц, ППС и составом мышечных волокон.
В результате силовой тренировки у носителей генотипа 577RR по ACTN3 имелась тенденция к большему приросту максимальной произвольной силы (МПС) и более высокой степени гипертрофии отдельных мышц и быстрых мышечных волокон. После тренировки смешанной направленности ассоциация полиморфизмов генов MYF6 и ACTN3 со степенью мышечной гипертрофии не выявлена.
С964Т полиморфизм гена MYF6 не имеет статистически значимого эффекта на антропометрические, композиционные, силовые и функциональные показатели профессиональных спортсменов.
Внедрение результатов. Результаты научного исследования используются в училищах и детско-юношеских школах олимпийского резерва г.Санкт-Петербурга, а также в программе спортивно-ориентированного физического воспитания учеников пяти школ г.Сургута.
Личный вклад автора. Автором лично выполнены обзор литературы, планирование исследований, разработка методики определения С964Т полиморфизма гена MYF6, весь объем молекулярно-генетической диагностики (забор биологического материала, выделение ДНК различными методами, анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ)), гистоморфологический анализ мышечной ткани, компьютерный анализ изображений магнитно-резонансной томографии (МРТ), измерение морфофункциональных показателей у бодибилдеров, статистический анализ и обработка полученных результатов.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на X, XI, ХII и XIII конгрессах Европейского колледжа спортивных наук (Белград, Сербия и Черногория, 2005; Лозанна, Швейцария, 2006; Ювяскюля, Финляндия, 2007; Эшторил, Португалия, 2008), III и IV Всероссийских с международным участием школах-конференциях по физиологии мышц и мышечной деятельности (Москва 2005, 2007), IX и Х Всероссийских конференциях «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2006, 2007), Международной научно-практической конференции «Современные проблемы физической культуры и спорта» (Санкт-Петербург, 2008) и на ежегодных научных итоговых конференциях и конференциях аспирантов ФГУ СПб НИИ физической культуры (2006, 2007, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 21 печатная работа, в том числе 8 работ в изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Текст диссертации изложен на 137 страницах, содержит 22 рисунка и 22 таблицы. Список литературы состоит из 137 источников, включающих 14 работ отечественных авторов и 123 – иностранных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
В исследовании «случай-контроль» приняли участие 2139 человека. Основная контрольная группа состояла из 1197 человек. В спортивную группу при исследовании полиморфизма MYF6 входило 563 спортсмена различных специализаций и квалификаций, ACTN3 – 942 спортсмена. Выборка для исследования с помощью подхода «генотип-фенотип» насчитывала 784 человек: 173 человека, входящих в общую группу спортсменов, и 611 физически активных здоровых людей.
Для анализа полиморфизма гена MYF6 группа спортсменов была разделена на пять подгрупп в соответствии с типом энергообеспечения и характером физической нагрузки:
I группа (n = 135) – умеренная мощность; выносливость;
II группа (n = 86) – большая мощность; выносливость;
III группа (n = 123) – переменная мощность; ловкость, быстрота, сила и выносливость;
IV группа (n = 119) – максимальная мощность; сила и быстрота;
V группа (n = 100) – максимальная мощность; быстрота и сила.
При исследовании полиморфизма ACTN3 спортсмены относились к одной из двух подгрупп: виды спорта с преимущественным проявлением скорости и силы (n = 486) и виды спорта с преимущественным проявлением выносливости (n = 456).
Молекулярно-генетические методы
Для молекулярно-генетического анализа использовали геномную ДНК испытуемых, выделенную из различного биологического материала (эпителиальные клетки ротовой полости, кровь и мышечная ткань).
Методика определения C964T полиморфизма гена MYF6 была разработана с использованием биотехнологической информационной базы данных NCBI, приложения «SNP» для идентификации мутации и программы «BLAST» для подбора праймеров.
Генотипирование образцов ДНК проводили при помощи метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием двухпраймерной системы:
Прямой праймер MYF6: 5’-GAAGATCCCACCGACCCTTCCTGGC-3’
Обратный праймер MYF6: 5’-GAGGCTAGACCTAAGCCACTCGCA-3’
Прямой праймер ACTN3: 5’-CTGTTGCCTGTGGTAAGTGGG-3’
Обратный праймер ACTN3: 5’-TGGTCACAGTATGCAGGAGGG-3’
Далее проводили ПДРФ-анализ, применяя для гидролиза ампликонов специфические эндонуклеазы рестрикции: SphI для MYF6 и DdeΙ для ACTN3. Анализ продуктов рестрикции проводился электрофоретическим разделением в полиакриламидном либо агарозном геле с последующей окраской бромистым этидием и визуализацией в проходящем ультрафиолетовом свете.
Гистоморфологический анализ мышечной ткани
Образцы мышечной ткани m. semitendinosus 8 физически активных здоровых мужчин фиксировали в 4% формалине и хранили в 80% растворе этанола при 4°C. Для приготовления гистоморфологического препарата проводили инклюзию образца в парафин и при помощи микротома получали срезы мышечной ткани. После дегидратации этанолом препараты окрашивали гематоксилином и эозином и просматривали в электронном микроскопе. Измерение ППС мышечных волокон осуществляли с использованием компьютерной программы «Infinity Analyse Software».
Иммуногистохимический анализ мышечной ткани
Биопсия скелетных мышц из m. vastus lateralis 15 физически активных здоровых мужчин и 26 конькобежцев проводилась сотрудниками Института медико-биологических проблем РАН (ИМБП РАН, Москва) под руководством проф. О.Л.Виноградовой. Иммуногистохимический анализ мышечной ткани выполняли с помощью иммунофлуоресцентной техники. Для выявления изоформ тяжелых цепей миозина (ТЦМ) применяли первичные антитела против медленных и быстрых ТЦМ и вторичные антитела, конъюгированные с FITC.
Метод магнитно-резонансной томографии и компьютерный анализ полученных изображений отдельных мышц
Компьютерные изображения МРТ нижних конечностей 548 рекрутов Великобритании получали, используя мобильный МР сканер 1.5 Tesla Siemens Sonata (работа выполнена сотрудниками University College London под руководством проф. Hugh Montgomery). Нами проводился анализ МРТ изображений с помощью компьютерной программы CMR-Tools©. Измеряли ППС m. rectus femoris правого и левого бедра до и после 12-недельной смешанной тренировки.
Аналогичным способом сотрудники ИМБП РАН проводили анализ МРТ изображений у 15 физически активных здоровых людей до и после силовой тренировки (классической и статодинамической). После определения ППС всего бедра, m. guadriceps femoris, m. rectus femoris, m. vastus lateralis, m. gluteus max, а также подкожного жира на передней и задней сторонах бедра с использованием программы Autocad 2000 проводили вычисление их объемов. У участников эксперимента также измеряли МПС.
|
