ФГБОУ ВПО «ИРКУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
На правах рукописи
ПОНОМАРЕВА
АННА ЛЕОНИДОВНА
ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ВОДЫ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДОВ БИОТЕСТИРОВАНИЯ
Специальность
03.02.08 – Экология (биологические науки)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Иркутск — 2012
Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Иркутский государственный университет» на биолого-почвенном факультете и в ФГБОУ ВПО «Национальный исследовательский Иркутский государственный технический университет»
Научный руководитель:
|
доктор биологических наук,
профессор, заслуженный работник ВШ
Стом Дэвард Иосифович
|
научный консультант:
|
доктор химических наук,
профессор Калабин Геннадий Александрович
|
Официальные оппоненты:
|
доктор биологических наук, профессор Дрюккер Валентин Валерианович
доктор биологические наук, профессор Родченко Октябрина Павловна
|
Ведущая организация:
|
ФГБОУ ВПО «Сибирский Федеральный Университет»
|
Защита состоится 16 марта 2012 г. в 15:00 на заседании совета Д 212.074.07 при при ГОУ ВПО Иркутский государственный университет по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, Байкальский музей им. проф. М.М. Кожова (ауд. 219).
Факс (3952) 241855
Email: dissovet07@gmail.com
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Иркутского государственного университета.
Автореферат разослан февраля 2012 г.
Учёный секретарь
диссертационного совета, к.б.н., доцент
|
|
А.А. Приставка
|
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Вода является базовым компонентом любой экосистемы, и изменение ее свойств вызывает перемены в подавляющем большинстве элементов экологических систем. Существует труднообозримый массив данных о зависимости влияния воды на живые организмы от предварительного воздействия на нее различных экологических (как биотических, так и абиотических) факторов, от ее структуры, а также от изотопного состава (Кариманов, 2000; Лавренков, 2006; Bild, 1995; Сho, 1999; Sessions, 2005;). Влияние изотопного состава на биологические эффекты воды (БЭВ) в подавляющем большинстве работ изучали лишь при обогащении воды дейтерием, и очень мало сообщений о воде с низким показателем D/H (Помыткин, 2006; Rakovski, 1996; Knatz, 2000). Значительное число публикаций посвящено анализу структуры воды с помощью ЯМР-, и ИК-спектроскопии а также квантово - механических расчетов. К сожалению, как правило, подобные исследования носят односторонний характер – изучается либо только структура воды, либо ее физические или биологические свойства (Стебновский, 2004; Габуда, 2005; Shmiter, 1992; Hoynut, 1997; Nodiche, 2000). Серьезной трудностью при исследовании БЭВ является плохая воспроизводимость результатов экспериментов. Одна из важнейших причин этого кроется в том, что БЭВ и характер ее влияния на организмы после обработки различными факторами могут меняться за очень короткие промежутки времени, а основные биотесты, позволяющие определять БЭВ, измененную под действием различных факторов, дают ответ через 1 – 4 и более суток (Помыткин, 2006; Лихолат, 1999; Лехтлаан-Теннисон, 2004; Barnes, 2004). Поэтому наиболее слабым моментом в изучении влияния воды на организмы является отсутствие экспрессных методов определения ее эффектов и недостаточное использование комплексного подхода при изучении рассматриваемой проблемы.
Таким образом, изучение с помощью тест-организмов связи БЭВ с действием на нее различных экологических факторов, ее структурой, и изотопным составом представляется крайне важной и перспективной областью экологии и имеет большое практическое и теоретическое значение.
Цель данной работы: с использованием приемов биотестирования провести комплексное изучение БЭВ с разным изотопным составом и воды, после действия ряда экологических факторов.
Для достижения этой цели были поставлены и решены следующие задачи:
Выяснить возможность проявления беспозвоночными животными реакций гидропреференции по отношению к воде с разным изотопным составом и к воде, подвергнутой воздействию различных экологических факторов.
С использованием разных тест-организмов (бактерий, дрожжей, водорослей, высших растений, беспозвоночных животных) и различных тест-откликов (рост, поведенческие, физиологические и биохимические реакции) изучить динамику изменения БЭВ под действием ряда экологических факторов, при варьировании концентрации дейтерия и при изменении структуры воды, определенной с помощью ЯМР-анализа.
На основании проведённых исследований предложить легкодоступные, технически простые пригодные для широкого применения вне специализированных лабораторий методы и проверить возможность их применения для оценки БЭВ при варьировании изотопного состава воды и при действии на нее различных экологических факторов.
Основные положения, выносимые на защиту:
Некоторые беспозвоночные организмы (Eisenia fetida Andrei Bouche, Drosophila melanogaster Mg., Nauphoeta cinerea Oliv.) обладают положительной преференцией по отношению к воде с низким содержанием дейтерия.
При обогащении воды дейтерием до концентрации выше природной (136 ppm дейтерия) рост микроорганизмов: Bacillus thuringiensis, Pseudomonas аeruginosa, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae подавляется; лаг-фаза у исследуемых микроорганизмов удлиняется при культивировании в средах как с повышенным, так и с пониженным относительно природного содержания дейтерия.
Степень структурированности воды и БЭВ после воздействия на нее различных экологических факторов способны довольно быстро изменяться; они тесно связаны друг с другом и при повышении степени структурированности талой воды ее биологические эффекты усиливаются.
Предложенный метод определения БЭВ, основанный на изменении подъемной силы дрожжей позволяет фиксировать ее колебания, относительно чувствителен, технически прост, дешев, легкодоступен, дает возможность проводить анализ без микробиологической техники, а в качестве тест-объекта могут быть использованы любые коммерческие препараты дрожжей, выпускаемые для бытовых целей.
Научная новизна и теоретическое значение. Впервые обнаружена реакция преференции дождевых червей, мраморных тараканов и мушек дрозофил по отношению к воде с более низким содержанием дейтерия. Показана применимость и перспективность для изучения вопросов связанных с исследованием БЭВ ряда экспрессных методов биотестирования. Для определения быстроизменяющихся БЭВ предложен метод оценки подъемной силы дрожжей S. cerevisiae. Установлены закономерности между содержанием дейтерия в воде, ее структурой и ферментативными, а также ростовыми реакциями микроорганизмов. Показано увеличение продолжительности фазы адаптации исследуемых штаммов микроорганизмов, при культивировании их как на более легкой по сравнению с природной, так и на более тяжелой воде. Обнаружено, что БЭВ после воздействия различных факторов (ЭМП разной силы и частоты, размораживание при различной температуре, обработка шумами различных диапазонов частот) способны относительно быстро изменяться. Они тесно связаны друг с другом и при колебании показателей степени структурированности воды БЭВ также меняются. Изучены особенности накопления воды живыми и погибшими семенами гороха в зависимости от соотношения D/H.
Практическое значение. Впервые предложены экспрессные дешевые методы определения БЭВ, дающие возможность проведения анализа вне микробиологической лаборатории (Патент РФ № 2376513 от 20.09.2009). Проведена оценка некоторых минеральных вод, воды с различным изотопным составом («Лангвей – 60» и «Лангвей – 100»), а также воды после воздействия на нее различных экологических факторов. Предложена методика обогащения пищевых продуктов легкой водой, позволяющая увеличивать вероятность замещения в организмах дейтерия протием и, соответственно, повышать скорость выведения тяжелого водорода (Патент РФ № 2376475 от 20.05.2009). Выявлены диапазоны концентрации дейтерия в воде, стимулирующие и ингибирующие рост, размножение и физиологические процессы некоторых штаммов микроорганизмов.
Апробация работы: Материалы диссертации докладывались: на межрегиональной научно-практической конференции «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование», 2004 г; на научной конференции «Фундаментальные проблемы изучения и использования воды и водных ресурсов», 2005 г; на Всероссийской научно - практической конференции студентов и аспирантов с международным участием «Безопасность – 05», «Безопасность – 06» (Иркутск, 2005, 2006); на 2-ом Байкальском микробиологическом симпозиуме с международным участием «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек, водохранилищ» (Иркутск, 2007 г); на межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Проблемы экологии. Чтения памяти проф. М.М. Кожова» (Иркутск, 2010). Результаты исследований применяли при чтении курсов лекций «Прикладная экология»; «Экотоксикология»; «Рациональное природопользование» на биолого-почвенном факультете ИГУ и проведении учебных практик студентов. Материалы диссертации были использованы при подготовке отчетов по проектам РФФИ : № 05-04-97237 – Байкал – р; № 06-04-39003; №08-04-98057-Сибирь_а; РФФИ - ГФЕНа № 06-04-39003. ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России»: ГК № 02.740.11.0018 от 15.06.2009 г., ГК 02.740.11.0418. от 30.09.2009 г, ГК № 02.740.11.0018, П1242, задания РНП 2.1.1/1539, 2.2.1.1/5901 НОЦ «Байкал», ФЦП «Исследование и разработка по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы»: ГК № 11.519.11.5016 от 28.10.11. Материалы работы включены российско-китайской Комиссией по подготовке встреч глав правительств в «Программу научно-технического сотрудничества № 12-35., 24.09.2008 г. Экологическая безопасность оз. Байкал – р. Амур».
Публикации: По материалам диссертационной работы опубликовано 13 статей, 7 из них в журналах, рекомендованных к изданию ВАК, по теме диссертации получены 2 патента на изобретение.
Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 141 страницах и состоит из введения, 3 глав, выводов, списка литературы и приложений. Работа иллюстрирована 31 рисунком и содержит 13 таблиц. Список литературы состоит из цитированных литературных источников: 252-х библиографических названий, из них 128 отечественных и 124 иностранных.
Личный вклад автора. Лабораторные исследования, анализ полученных данных, обобщение и интерпретация полученных результатов, подготовка материалов для докладов и публикаций проведены лично или при определяющем вкладе автора. Работа проводилась на биолого-почвенном факультете и в НИИ биологии и ФГБОУ ВПО «Иркутский государственный университет», а также в ФГБОУ ВПО Национальный исследовательский «Иркутский государственный технический университет» и в Байкальском музее ИНЦ СО РАН.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Микроорганизмы способны проявлять специфическую чувствительность к различным воздействиям и могут быть качественными и количественными биоиндикаторами их влияния. Многие микроорганизмы обнаруживают высокую скорость ответа при действии на них различных агентов. Методика содержания и культивирования микроорганизмов проста и позволяет за короткое время получать в массовом количестве однородный материал, не требующий разделения по возрастным, размерным, весовым, половым и другим признакам, что существенно снижает систематические ошибки, характерные для биологического эксперимента. В связи со всем вышесказанным трудно переоценить перспективы микробиологического тестирования. Важность микробиологического биотестирования связана и с огромной ролью микроорганизмов в жизнедеятельности экосистем как в процессах очищения, так и в качестве одного из начальных звеньев трофической цепи и вообще в круговороте веществ. Наиболее достоверные показатели о характере воздействия на организм получают при использовании в качестве тест-откликов процессов роста и размножения. Но для проведения экспрессного биотестирования больше подходят физиологические и биохимические реакции тест-организмов, поэтому именно на них и был сделан основной упор в работе.
В качестве тест-культур брали следующие микроорганизмы. Бактериальные штаммы: P. aeruginosa (предоставлен проф. д.б.н. В.В. Дрюккером и к.б.н. Павловой О.Н.), B. сereus (из коллекции микроорганизмов кафедры микробиологии ИГУ), R. erythropolis (получен от чл.-корр. РАН И. Б. Ившиной) и B. thuringiensis (предоставлен к.б.н. доц. О. Ф. Вятчиной). Дрожжи Y. lipolytica (получены от д.б.н. проф. Борзенкова И. А.), S. cerevisiae (предоставлен к.б.н. О. Ф. Вятчиной), водоросли - Chlorella vulgaris (переданы проф. д.б.н. С. Е. Плехановым). В работе использовали также сухой препарат хлебопекарных дрожжей «Саф-момент» («S.I.Lesaffre», Франция), изготовленный по ГОСТ 171-81 и представляющий собой культуру хлебопекарных дрожжей (S. cerevisiae).
В качестве тест-объектов использовали беспозвоночных животных: дрозофилы (D. melanogastres) предоставлены д.б.н. проф. Никитиным А.Я., мраморные тараканы (N. cinerea) – получены от к.б.н. доц. Шиленкова В. Г., дождевые черви – красный калифорнийский гибрид (E. fetida), дафнии (Daphnia magna Straus), планарии (Phagocata sibirica Zabussov).
При оценке БЭВ также применяли семена растений: гороха (Pisum sativum L.) – сорт Аксаевский усатый, и пшеницы (Triticum durim L.) – Тулунская 12.
Лабораторные исследования проводили в соответствии с общепринятыми в микробиологии методами (Нетрусов, 2005). При изучении влияния содержания дейтерия на бактерии интенсивность роста культур оценивали по накоплению биомассы клеток (в единицах оптической плотности, регистрируемой на «Thermo Helios 298006» при λ мах = 590 нм). Титр жизнеспособных клеток в средах определяли, используя метод серийных разведений с последующим высевом на плотные питательные среды, а кинетические параметры роста по (Евдокимов, 2001). Для исследования БЭВ с использованием тест-культур применяли также метод лунок. Дегидрогеназную активность определяли по (Нетрусов, 2005), а уреазную – по (Красильников,1999). Выделение СО2 дрожжами оценивали по (Вадюнина,1986), изменение подъемной силы дрожжей – по (Зюзина, 2006). Общее содержание белка определяли модифицированным методом Лоури (Новиков, 2001).
Для культивирования микроорганизмов использовали рыбо-пептоннный агар (РПА), мясо-пептонный бульон (МПБ), пептонную воду (%) (пептон – 1, NaCl – 0,5), среду Эндо, синтетическую среду с гексадеканом и глюкозой (%) (KNO3 – 0,4, MgSO4 – 0,08, KH2PO4 – 0,06, Na2HPO4 – 0,14, гексадекан или глюкоза – 1) , IEPD (г/л) (глюкоза – 20, пептон основной – 10, автолизат дрожжевой – 5).
Изменение растворимости NaCl, KCl, CaCO3 в воде с разным содержанием дейтерия и воде, обработанной цветными шумами, оценивали по (Летников, 1976).
Легкая и тяжелая вода получена в Объединенном институте ядерных исследований г. Дубна и предоставлена к.х.н. Тимаковым А. А. Для исследования брали также минеральную «легкую» воду, выпускаемую под торговой маркой «Лангвей – 60» и «Лангвей – 100», производитель «МТК Айсберг». Общая минерализация воды «Лангвей – 100» не менее 0,2 г/дм³. Соотношение изотопов кислорода в пробах воды относительно природной не изменяли. Исключение составляли «Лангвей – 60 и 100» – в них содержание тяжелой кислородной воды (О18) снижено по отношению к природному уровню на 15%. Приготовление опытных проб воды с разной концентрацией дейтерия (10; 13; 100; 280; 300; 1200; 1400; 1600; 2300 ppm) при природном соотношении изотопов кислорода проводили на кафедре аналитической химии ИГУ под руководством проф., д.х.н. Д.Ф. Кушнарева и проверяли с помощью ЯМР - спектроскопии. В качестве контроля брали питательную среду, приготовленную на основе природной воды (~136 ppm дейтерия).
Обработку воды проводили несколькими способами. Воду замораживали при -18 °С в течение 12 часов. После этого оттаивали при температурах: 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80 °С. Воду обрабатывали «цветными» шумами (Яворский, 1989) в течение 30 с. Белый шум – это сигнал с гладким спектром на всех частотах. Частотный спектр розового шума является гладким в логарифмическом масштабе. Коричневый шум схож с розовым шумом, однако его спектральная плотность затухает на 6 дБ на октаву. Синий шум – вид сигнала, чья спектральная плотность увеличивается на 3 дБ на октаву в ограниченной полосе частот, то есть его спектральная плотность пропорциональна частоте. В спектре серого шума виден большой «провал» на средних частотах. Воду подвергали и воздействию переменных ЭМП различной силы и частоты. Поле создавали при помощи установки, предоставленной д.ф.н. проф. Р. А. Рахматуллиным, основными блоками которой были генератор сигналов специальной формы Г6-27 и присоединенная к нему индукционная катушка.
Для исследования влияния изотопного состава водорода на связывание воды в опытах с растениями использовали семена пшеницы и гороха. При анализе интенсивности поглощения объекты помещали в воду с различной концентрацией изотопов водорода. Семена инкубировали в течение 3 ч, так как дальнейшее увеличение времени экспонирования существенно не влияло на степень насыщения. Количество поглощенной воды определяли по разнице масс сухого и насыщенных водой объектов, и рассчитывали в процентах на единицу исходного сухого веса. Воду, поглощенную семенами гороха, выделяли методом перегонки (Вадюнина,1986). Оценку содержания дейтерия проводили методом ЯМР. Спектры ЯМР 2Н образцов регистрировали в ампулах диаметром 5 и 10 мм. Условия измерений: резонансная частота ядер дейтерия – 76,6 МГц, ширина развёртки – 1 500 Гц, релаксационная задержка 8 с, длительность 90° импульса — 23,5 мкс, запись спектра производилась до получения соотношения сигнал/шум >100. Регистрацию спектров проводили без стабилизации резонансного условия частота/поле при контроле однородности и дрейфа магнитного поля Во по эталонному соединению (Кушнарев, 1995; Калабин,1998).
При изучении возможности использования для биотестирования способности беспозвоночных организмов выбирать более благоприятную среду обитания, червей предварительно обезвоживали, помещая их в физиологический раствор на 30 мин. При этом потери влаги составляли около 35±9 %. Затем червей переносили в чашку Петри, из которой они имели полный и равноценный доступ к другим чашкам, содержащим воду с различной концентрацией дейтерия. В каждую пробу воды добавлялось равное количество особей (30 шт.). Опыты продолжались один час.
Для изучения степени насыщения водой с разным содержанием дейтерия живых и погибших организмов использовали воду, содержащую 13, 1200 ppm дейтерия и минеральную воду «Лангвей – 60». В каждой пробе использовали 20 семян гороха и 10 экземпляров червей.
Все исследования проводили не менее чем в 4-5 независимых опытах при 3-4 аналитических повторностях. Графические материалы выполнены при помощи программ Excel 7,0 и Microsoft Word. Результаты всех наблюдений и экспериментов обработаны стандартными методами с использованием корреляционного, регрессионного анализов (Поллард, 1982; Боровиков, Ищенко, 2000). Достоверность различия определяли с помощью критерия Стьюдента. Выводы сделаны при вероятности безошибочного прогноза р≥0,05.
Результаты и их обсуждение
Возможность использования преференции некоторых беспозвоночных животных к легкой и тяжелой воде
Эксперименты показали, что при увеличении в воде содержания дейтерия уменьшалось количество червей E. fetida, заползающих в чашки c этими пробами воды. В контроле (136 ppm дейтерия) количество червей, составляло 11,5±2,8%, а в воде – 13 ppm дейтерия и воде «Лангвей – 60» – 40,7±8,2% и 27±2,4%, соответственно (см. рис. 1).
В воде, содержащей 280 ppm дейтерия, оказалось всего 5,6±2,1% от общего числа взятых в опыт экземпляров червей. К концу опыта (по истечении 60 мин) самую тяжелую воду (1400 ppm дейтерия) не выбрал ни один червь (см. рис 1).
Рис. 1. Количество червей E. fetida (% от общего числа особей) в чашках Петри с различным содержанием дейтерия в воде
Не только E. fetida, но и D. melanogaster выбирали воду с меньшим содержанием дейтерия, чем в природной. Так, к концу в садках эксперимента, с тяжелой водой (1400 ppm дейтерия) оказалось 3,1±0,93% D. melanogaster. Мраморные тараканы N. cinerea предпочитали воду с содержанием дейтерия 13, 60, 100, 136 ppm. Самый низкий процент потребления воды отмечали в садках с тяжелой водой (300 и 1400 ppm дейтерия) (см. рис. 2)
Рис. 2. Количество мушек дрозофил D. melanogaster, оказавшихся через 1 ч в садках с водой с разным содержанием дейтерия и количество воды с разным содержанием дейтерия, поглощенной тараканами N. cinerea (по оси абсцисс – содержание в воде дейтерия; по оси ординат – количество дрозофил и количество воды поглощенной мраморными тараканами через час, в % от общего числа)
|
