Исследование in vivo Влияние различных доз препарата «ga-40» на накопление антитело образующих клеток (аок)

Влияние препарата GA-40 на прирост массы самок крыс (генеративная функция), г Группа Дни опыта 1-15 15-25 25-35 1-35 Контроль 18,9±1,8 27,8±2,9 32,8±3,0 79,4±5,9 Самки GA-40, 2 мкг/кг) 11,8±1,6* 21,4±2,3 33,6±4,3 66,8±6,2 Самцы СА-40, 2 мкг/кг 15,5±1,2 23,0±3,4 32,5±3,6 71,0±6,2 * - разница статистически достоверна по сравнению с контролем при Р < 0,05 Таблица 9 Влияние препарата GA-40 на генеративную функцию самок и самцов крыс Группа Число желтых тел на 1 самку Число мест имплантаций на 1 самку Предимпланта-ционная гибель % Число живых плодов Постимпланта-ционная гибель % Контроль 10,0 ±0,5 9,6 ± 0,5 3,8 9,3 ± 0,5 3,9 Самки GA-40, 2 мкг/кг 10,4 ±0,4 10,1 ±0,3 2,7 9,9 ±0,3 2,9 Самцы GA-40, 2 мкг/кг 9,9 ± 0,5 9,0 ±0,6 8,7* 8,6 ±0,7 3,2 Таблица 10 Динамика массы крысят, г (постнатальное развитие, генеративная функция) Группа Пол животных Дни жизни 5 15 30 Контроль Самки 10,7±0,14 22,4±0,13 54,4±0,34 Самцы 11,1±0,20 22,2±0,21 53,5±0,42 Самки GA-40, 2 мкг/кг Самки 10,9±0,29 20,7±0,16 52,7±0,50 Самцы 10,8±0,21 19,6±0,27* 53,4±0,33 Самцы GA-40, 2 мкг/кг Самки 10,1±0,18 18,4±0,33* 52,2±0,37 Самцы 9,9± 0,22* 17,9±0,31* 52,4±0,41 * - разница статистически достоверна по сравнению с контролем при Р < 0,05 Таблица 11 Двигательная активность и сенсорно-двигательные рефлексы у крысят на 5 день жизни (генеративная функция) Группа Пол животных Количество животных «Горизонтальная веревочка» удерживание передними лапами 5 сек, выполняющие, % Рефлекс «Пререворот на плоскости», выполняющие, % Рефлекс «Избегание обрыва», выполняющие, % Контроль самки 11 81,8 90,9 90,9 самцы 15 80,0 93,3 80,0 Самки GA-40, 2 мкг/кг самки 14 85,7 92,8 78,6 самцы 10 90,0 80,0 100 Самцы GA-40, 2 мкг/кг самки 14 78,6 85,7 85,7 самцы 13 76,9 76,9 84,6 ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОДУКЦИИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ-АЛЬФА МОНОНУКЛЕАРНЫМИ КЛЕТКАМИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ДОБРОВОЛЬЦЕВ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ПРЕПАРАТА «GA-40» В ПРИСУТСТВИИ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕИНКИНАЗЫ С И ТИРОЗИНОВЫХ ПРОТЕИНКИНАЗ. Целью данного раздела было исследовать возможные механизмы индукции ФНО-альфа препаратом «GA-40», в частности зависимость этого процесса от протеинкиназ и тирозинкиназ - основных участников внутриклеточной передачи сигнала. Протеинкиназа С (РКС) - это семейство Са2+/фосфолипид-зависимых серин­треониновых киназ, которые играют важную роль в передаче сигнала и регуляции клеточного роста, дифференцировки и апоптоза. Выделяют по крайней мере 12 изоформ РКС, различающихся по структуре, клеточному разнообразию и биологическим функциям. Тирозиновые протеинкиназы (ТРК) являются участниками передачи сигналов с вовлечением на конечном этапе ядерных транскрипционных факторов, результатом чего является модификация экспрессии специфических генов, действие которых проявляется в регуляции клеточного роста и дифференцировки. Выделяют 2 типа ТРК: рецепторные и нерецепторные. В первый тип входит 19 классов протеинкиназ, которые являются чаще всего рецепторами факторов роста (эпидермального фактора роста, тромбоцитарного фактора роста, инсулина, инсулин-подобного фактора роста и др.). Нерецепторные ТРК включают в себя 9 семейств (Jak-киназы, Srs-киназы, Syk/Zap70-киназы, FAK-киназы и др.). Для ингибиторного анализа использовали стауроспорин (антибиотик АМ-2282) -главный неселективный ингибитор РКС и геништейн (4',5,7 –тригидро­дрокси­сольфлавон) - высокоспецифичный ингибитор ТРК, конкурентный ингибитор в различных протеинкиназных реакциях. Материалы и методы В исследовании участвовало 8 здоровых добровольцев в возрасте от 24 до 33 лет. Забор крови производи утром натощак из локтевой вены в пробирку с гепарином в концентрации 20 Ед/мл. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли с помощью одноступенчатого градиента плотности фиколл-верографин (d=1.077 (ПанЭко) методу Boyum А., 1968. Для этого гепаринизированную кровь разводили в два раза средой 199 (ПанЭко) и наслаивали на фиколл. Пробирки центрифугировали в течение 20 минут 400g при t 20-25°С. Клетки в интерфазе стерильно собирали и дважды отмывали в среде 199. Жизнеспособность клеток после выделения составляла 98%-99% (по методу окраски 0,1% раствором трипанового синего (Serva)). МНК разводили до концентрации 2x106 клеток/мл полной культуральной средой (RPMI 1640 (Sigma), 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma) и 2 mМ L-глутамина (Sigma)). К 4х105 клеток добавляли ингибиторы стауроспорин (Sigma) (10, 100, 500 nМ) и геништейн (Sigma) (1, 10, 100 µМ) на 1 ч, затем вносили активаторы продукции ФИО- α (100нг/мл ЛПС и 100 мкг/мл «GA-40») и инкубировали в течение 48 ч в 5% СО2 при 37°С. Продукцию цитокина ФНО-α определяли в супернатантах культур клеток с использованием твердофазного иммуноферментного анализа, применяя коммер­ческую тест-систему фирмы «Вектор Бест» (Россия). Результаты Предобработка МНК в течение 1 ч стауроспорином в исследуемых дозах вызывало значительное снижение продукции ФНО-α, стимулированной «GA-40», аналогично ЛПС-индуцированной. Ингибирование носило дозозависимый характер и в максимальных дозах стауроспорина (200 и 500 nМ) приводило к снижению синтеза цитокина до фонового уровня как при индукции «GA-40», так и ЛПС. Спонтанная продукция цитокина варьировалась от 0 до 48 пкг/мл. При минимальной использованной дозе стауроспорина 10 nМ наблюдалось наименьшее ингибирование продукции ФНО- α (в 4,5 раза для GA-40 и в 9 раз для ЛПС) (табл.1, рис.1). Ингибитор тирозиновых протеинкиназ геништейн также снижал продукцию ФНО-α дозозависимо во всех тестируемых дозах при действии изучаемого препарата и ЛПС на мононуклеарные клетки. Так, при минимальной дозе геништейна 1 µМ отмечено сходное снижение в синтезе цитокина для «GA-40» и ЛПС в 2 раза, при максимальной дозе ингибитора 200 µМ отмечено практически полное подавление продукции ФНО-α до спонтанного уровня (снижение в 16 и 21 раз соответственно) (табл.1, рис.2). Таблица 1. Продукция ФНО-α (пкг/мл) мононуклеарными клетками периферической крови здоровых добровольцев. МНК предварительно обрабатывали ингибиторами протеинкиназ или тирозинкиназ (стауроспорин или геништейн) в течение 1 ч, затем инкубировали в присутствии GA-40 или ЛПС в течение 48 ч (М±m). Индуктор Ингибитор GA-40, 100 мкг/мл ЛПС, 200нг/мл Стауроспорин, нМ 0 534±258,4 406±112,2 10 118±31,5* 43±11,4* 100 60±19,2* 15±4,5* 200 38±19,9* 12±3,1* 500 26±16,6* 10±3,8* Геништейн, мкМ 0 534±258,4 406±112,2 1 264±194,7* 209±39,2* 10 121±79,3* 88±39,7* 100 58±35,8* 41±20,6* 200 34±9,2* 19±8,6* * - достоверные различия по сравнению со значениями, полученными в отсутствие ингибиторов, р<0,05 Рисунок 1. Продукция ФНО-α (пкг/мл) мононуклеарными клетками периферичес­кой крови здоровых добровольцев в присутствии стауроспорина. Рисунок 2. Продукция ФНО-α (пкг/мл) мононуклеарными клетками пери­фе­ри­чес­кой крови здоровых добровольцев в присутствии геништейна. ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТА «GA-40» НА ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ НАКОПЛЕНИЕ КАЛЬЦИЯ КЛЕТКАМИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА Кальций (Са2+) играет важную роль как медиатор трансмембранной передачи сигнала, поэтому оценка изменения внутриклеточного содержания ионизированного Са2+ является признаком активации клетки. Материалы и методы Выделение клеток Выделение мононуклеарных клеток Для оценки изменения внутриклеточного содержания кальция в лимфоцитах и моноцитах были использованы мононуклеарные клетки периферической крови здоровых доноров выделенные на градиенте плотности фикол-верографина как описано в разделе 1. Выделение нейтрофилов К 4 мл гепаринизированной крови добавляли 2 мл 3% желатины на фосфатно-солевом буфере (ФСБ) (0.15М NaCl, 1М К2НРО4, 1М КН2РО4, рН 7,4), перемешивали и инкубировали в течение 10-15 минут при 37°С для осаждения эритроцитов. Лейкоциты из надосадочной жидкости отбирали и двукратно отмывали в RPMI 1640 (ПанЭко). Лейкоциты ресуспендировали в среде RPMI 1640 в концентрации доводили 2х106/мл по сегментоядерным нейтрофилам. Оценка внутриклеточного кальция Для оценки внутриклеточного кальция клетки инкубировали с Fluo-3 АМ (Sigma) 6 µМ в течение 30 мин при 37 °С. Свечение красителя Fluo-3 АМ наблюдается в зеленом спектре при связывании со свободным внутриклеточным кальцием. Влияние препарата «GA-40» на исследуемый показатель оценивали следующим образом: сначала регистрировали спонтанный уровень внутриклеточного кальция, затем добавляли препарат в концентрации 10 и 100 мкг/мл либо Са2+-ионофор достоверно увеличивающий содержание внутриклеточного кальция А23187 (Sigma), а затем препарат. Результаты Результаты представлены в таблице 2. Препарат в исследованных концентрациях не оказал влияния на накопление внутриклеточного кальция, в связи с чем было решено исследовать влияние «GA-40» на индуцированное накопление кальция. При добавлении Са2+-ионофора А23187 наблюдается повышение интенсивности свечения по сравнению с контролем (табл. 2, рис. 3). Последующее добавление GA-40 в концентрации 100 мкг/мл снижает стимулированную Са-ионофором А23187 мобилизацию кальция нейтрофилами, моноцитами и лимфоцитами на 46%, 86% и 52% соответственно, что проявляется в снижении свечения по FLI каналу. В концентрации 10 и 1 мкг/мл эффект отсутствует (табл. 2). Таблица 2. Влияние GA-40 на накопление внутриклеточного кальция лимфоцитами, моноцитами и нейтрофилами периферической крови здоровых доноров. М±m контроль А23187 GA-40, мкг/мл 100 10 1 лимфоциты 18,3±6,33 130,8*±15,64 70,1*±12,33 130,4±17,55 134,1±12,14 моноциты 12,8±2,14 110,5*±14,12 15,4*±2,11 98,7±14,52 100,8± 10,98 нейтрофилы 60,5±6,54 230,7*±14,35 110,4*±11,25 220,3±14,44 231,6±17,41 * - достоверные отличия по сравнению с индуцированным А23187 накоплением кальция, р<0,05 Рисунок. 3. Влияние GA-40 на содержание внутриклеточного кальция лимфоцитами, моноцитами и нейтрофилами периферической крови здорового донора.

Похожие:

	Диссертации: “Анализ разнообразия антитело-образующих клеток в иммунном ответе на овальбумин” Высшее образование: биолог, специальность “Микробиология” 1989, Биологический факультет мгу им. М. В. Ломоносова, Москва		Перечень научно-исследовательских, опытно-конструкторских и технологических... Изучение закономерностей дифференцировки стволовых и прогениторных клеток из различных источников в условиях in vitro и in vivo и...
	Перечень электронных образовательных ресурсов, разработанных учителем... Увеличительные приборы. Строение светового микроскопа и правила работы с ним. Лабораторная работа «Приготовление препарата клеток...		Отчет о результатах клинического исследования, проведеного по ограниченной... «Открытое исследование по изучению эффективности и переносимости препарата лома люкс псориаз, раствор для внутреннего применения...
	«Влияние различных веществ на рост и развитие растений» Целью исследования является накопление и обработка данных о влиянии солей тяжёлых металлов на рост и развитие растений, а так же...		Жцк g1-рост, синтез (2n2c), s-репликация ДНК (2n4c), G2-накопление... Методы иссл. In vivo (вживл камер), in vitro (культуры тканей, культивир гиб-ридизация), прижизн окрашив, гист препараты (срез, пленка,...
	Влияние микрогравитации на межклеточное взаимодействие иммунокомпетентных...		Влияние антиоксидантного витаминного препарата на нарушения обмена... Работа выполнена на кафедре биологической химии гбоу впо «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения...
	Исследовательская работа по физике на тему: Звук. Влияние звука на... Целью семинара является обсуждение и проработка лучших мировых практик и современных моделей реализации проектного подхода в инженерном...		Реферат по теме: «Вселенная: происхождение и исследование» Вселенную до конца изучить невозможно. Во Вселенной насчитывается миллиарды галактик, образующих сгущения, слои и цепочки, разделённые...
	Биологические науки влияние условий культивирования и фазы роста... Геологическая съемка, поиски и разведка месторождений твердых полезных ископаемых		Тематическое планирование уроков музыки по курсу «Музыкальная культура Тверского края» 8 класс Знание: 1- влияние различных предпосылок на формирование особенностей и культурных тра диций народов Верхневолжья с VII –iх в.: (Образование...
	Способ криосохранения клеток морских беспозвоночных Дмсо. Способ позволяет повысить степень сохранности клеток морских беспозвоночных без нарушения их функциональной активности после...		Реферат по проекту «Исследование языковой компетенции и «языкового самоощущения» «Исследование языковой компетенции и «языкового самоощущения» различных слоев российского общества»рук. Л. А. Вербицкая
	Современные подходы в лечении диабета 2 типа Основным преимуществом инкретинов перед устаревшими стимуляторами инсулиновой секреции является их положительное влияние на численность...		Исследование цветовой гаммы исследование естественного освещения... Исследование процентного соотношения кабинетов с люминесцентными и электрическими лампами