Исследование in vivo Влияние различных доз препарата «ga-40» на накопление антитело образующих клеток (аок)
Скачать 3.37 Mb.
|
ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТА «GA-40» НА ВНУТРИКЛЕТОЧНУЮ ПРОДУКЦИЮ ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА КЛЕТКАМИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА Внутриклеточное накопление кислородных радикалов свидетельствует об увеличении бактерицидного потенциала клетки, активации ряда сигнальных молекул, запускающих защитные механизмы иммунной системы. Внутриклеточное увеличение уровня перекиси водорода является ключевым для активации ряда сигнальных молекул [Junn et al., 2000; kim et., 2001; Koh et аl., 2001]. Известно участие перекиси водорода в процессе активации важного транскрипционного фактора NF-kB [Kamata et al., 2002]. В основе метода оценки накопления внутриклеточной перекиси водорода лежит способность флюорохрома светиться после окисления его различными формами кислородных продуктов. Краситель - дихлорфлюоресцеина диацетат (ДХФ-ДА), изначально нефлюоресцирующий, пассивно проникая внутрь клетки, обрабатывается эстеразами - отщепляется ацетатная группа и он переходит в полярное соединение, неспособное диффундировать обратно из клетки. При взаимодействии с перекисью водорода, образующейся во время кислородного «взрыва», ДХФ-ДА превращается во флюоресцирующее соединение (область зеленого спектра), что позволяет анализировать клетки по интенсивности свечения красителя с помощью проточной цитофлюориметрии. Материалы и методы Выделение лейкоцитов В исследовании участвовало 8 здоровых добровольцев. Забор крови производи утром натощак из локтевой вены в пробирку с гепарином в концентрации 10 Ед/мл. К 4 мл гепаринизированной крови добавляли 2 мл 3% желатины на фосфатно-солевом буфере (ФСБ) (0.15М NaCl, lМ K2НРО4, lМ КН2РО4, рН 7,4), перемешивали и инкубировали в течение 10-15 минут при 37°С для осаждения эритроцитов. Лейкоциты из надосадочной жидкости отбирали и двукратно отмывали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ). Концентрацию лейкоцитов доводили до 2х106/мл по сегментоядерным нейтрофилам в ФСБ. Оценка накопления внутриклеточной перекиси: Исследование влияния препарата «GA-40» на продукцию внутриклеточной перекиси лейкоцитами здоровых доноров проводили по методике описанной у Bass et аl., 1983. Лейкоциты предварительно инкубировали с ДХФ-ДА в присутствии азида натрия в течение 20 мин., при 37°С 96-луночном планшете (Nunc). Затем вносили «GA-40» в концентрации 100, 10, 1 мкг/мл, в качестве отрицательного контроля - фосфатно-солевой буфер, положительного - форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА). После 30-минутной инкубации при 37°С, клетки осаждали центрифугированием. Эритроциты разрушали лизирующим буфером (0,15М NH4Сl, 0,01M NaHCOз, 0,1 мМ Na2ЭДТА, рН 7,4) и клетки отмывали ФСБ. Анализ образцов проводили с помощью проточного цитофлюориметра FACSCalibur в программе «CellQuest» на канале FL1. В результате анализа проб оценивали показатели средней интенсивности флуоресценции. Результаты Результаты представлены в таблице 3. Из таблицы видно, что препарат «GA-40» 10 и 100 мкг/мл вызывает снижение уровня внутриклеточной перекиси водорода в нейтрофилах периферической крови здоровых доноров. При использовании «GA-40» в концентрации 100 мкг/мл наблюдалось достоверное снижение этого показателя 27%, а 1 мкг/мл эффекта не оказал. На рисунке 4 представлен пример цитофлюорограммы, демонстрирующей накопление перекиси водорода в нейтрофилах здорового донора под действием ФМА и «GA-40». В моноцитах также обнаружена тенденция к подавлению продукции перекиси водорода, но данный эффект статистически недостоверен. Таблица 3. Влияние препарата «GA-40» на накопление внутриклеточной перекиси водорода нейтрофилами и моноцитами периферической крови здоровых доноров, указаны средние значения флюоресценции в зеленом спектре, М±m.
* - достоверные различия по сравнению с контролем, р<0,5  GA-40 контроль ФМА    Рисунок 4. Влияние препарата «GA-40» в концентрации 100мкг/мл на содержание внутриклеточной перекиси водорода в нейтрофилах периферической крови здорового донора, по оси абсцисс — интенсивность флюоресценции в зеленом спектре, по оси ординат - количество клеток. ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТА «GA-40» НА ЭКСПРЕССИЮ КОСТИМУЛЯТОРНЫХ МОЛЕКУЛ НА МАКРОФАГАХ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ МОНОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА Макрофаги являются важным компонентом как врожденного, так и адаптивного иммунного ответа. Макрофаги формируют основную линию защиты от микробной инфекции за счет поглощения и деградации патогенов, и представлении на своей поверхности чужеродного антигенного материала. Для эффективной презентации чужеродного пептида необходимо представление антигенного материала в составе главного комплекса гистосовместимости второго класса (HLA). Эту структуру на поверхности антиген-презентирующих клеток распознает Т клеточный рецептор. Однако для активации наивных Т клеток помимо распознавания антигена в составе HLA важно наличие костимуляторных сигналов. Наиболее изученными костимуляторными молекулами, представленными на поверхности антиген-презентирующих клеток, являются структурно сходные гликопротеины CD80/CD86, представители семейства иммуноглобулиновых рецепторов. На поверхности Т клеток за взаимодействие с этими структурами отвечает CD28. В процессе активации наивной Т клетки экспрессируется большое количество протеинов, поддерживающих или модифицирующих костимуляторные сигналы. К представителям таких молекул можно отнести CD40 и CD40L, являющихся членами семейства рецепторов фактора некроза опухоли. Взаимодействие этих структур приводит к взаимной активации как Т лимфоцитов, так и антиген-презентирующих клеток, что находит отражение в усилении экспрессии молекул CD80/CD86 на поверхности последних. Таким образом, для эффективной презентации чужеродного антигена и активации Т клеток необходимо увеличение экспрессии молекул HLA и костимуляторных молекул на поверхности антигенпрезентирующей клетки. Целью данного исследования явилась оценка влияния препарата на антиген-презентирующую функцию макрофагов, а именно влияние на экспрессию молекул HLA-DR и CD80/CD86. Материалы и методы Получение культуры макрофагов Мононуклеары периферической крови выделяли из свежей лейкомассы доноров с помощью одноступенчатого градиента плотности фиколл-верографин (ПанЭко) по методу Boyum А., 1968 путем центрифугирования. Лейкомассу разводили средой 199 (ПанЭко), содержащей 25 ЕД/мл гепарина (ФГУП Московский эндокринный завод), в 2 раза, затем наслаивали на градиент плотности фиколл-верографин с последующим центрифугированием при 400g 40 минут. Интерфазное кольцо собирали, клетки отмывали в среде 199 (ПанЭко) 20 минут при 400g. Затем мононуклеары центрифугировали для удаления тромбоцитов. В пластиковую чашку Петри (Costar), диаметром 60мм, добавляли 50x106 выделенных клеток и оставляли для адгезии в течение 1часа в культуральной среде (1% плазмы человека АВ (ICN), RPMI-1640 (ICN), 2mМ глютамин (ICN), пируват (ПанЭко), витамины (ПанЭко)) при 5% CO2 и 37°С. Не прилипшие клетки удаляли отмывали. Агезированные клетки культивировали в течение 7 дней в полной культуральной среде (10% фетальная сыворотка (ICN), RPMI-1640 (ICN), 2mМ глютамин (ICN), пируват (ПанЭко), витамины (ПанЭко)), содержащей 80нг/мл гранулоцитарно-макрофагального фактора (Leucomax). На 3 и 5 день отбирали 1 мл и добавляли свежей среды, содержащей цитокин. На 7 день добавляли исследуемый препарат в концентрации 1ООмкг/мл и проводили анализ экспрессии поверхностных молекул через 24 часа.  изотип спонт GA-40 ЛПС     изотип спонт GA-40 ЛПС    изотип спонт GA-40 ЛПС   B Рисунок 5. Экспрессия костимуляторны х молекул и молекул главного комплекса гистосовместимости второго класса под действием препарата «GA-40» на поверхности макрофагов, полученных из моноцитов периферической крови человека. А - экспрессия HLA-DR.-FITC, Б - экспрессия CD86-FITC, В - экспрессия CD40-FITC. Окрашенная гистограмма - изотипический контроль, сплошная линия - клетки, стимулированные препаратом GA-40 100 мкг/мл, пунктирная линия – нестимулированные клетки. Фенотипический анализ Затем макрофаги в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) инкубировали с меченными моноклональными антителами (CD86-FITC, CD40-FITC, HLA-DR-FITC, изотопический контроль мышиный 1gC1-FTTC (Caltag)) в течение 30 минут при 4°С. Макрофаги дважды отмывали холодньм ФСБ с 0.02% ЭДТА. Отмытые клетки фиксировали ФСБ, содержащим 1% параформальдегида (Sigma). Клетки анализировали на проточном цитофлуориметре FACSCalibur используя программное обеспечение CellQuest (Becton Dickinson на канале FL. Результаты Было исследовано 6 здоровых доноров (возраст от 25 до 54 лет). Изменений в экспрессии костимуляторных молекул (CD40, CD86) и молекул главного комплекса гистосовместимости второго класса (HLA-DR.) на поверхности макрофагов под действием препарата «GA-40» выявлено не было. На рисунке 5 представлен пример экспрессии исследованных молекул на макрофагах одного из доноров. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ NF-КВ ПОД ВЛИЯНИЕМ ПРЕПАРАТА «GA-40» Материалы и методы Стимуляция клеток и приготовление ядерного экстракта: Исследование проводили на клетках человеческой моноцитарной лимфомы U937. Клетки разводили в ПКС и инкубировали в присутствие или без стимуляторов (ЛПС Е. coli (Sigma) 1 мкг/мл, GA-40 100 мкг/мл) в микропробирках (Eppendor) в количестве 1х106 клеток на пробу в атмосфере 5% CO2 при 37 °С 10 мин. Затем клетки осаждали центрифугированием, супернатант отбирали, а осадок клеток лизировали в 150 мкл гипотонического буфера (10мМ HEPES (Sigma), 10мМ КС1, 0,2 мМ ЭДТА, 10% глицерин, 1 мМ фенилметилсульфонилфлюорид, ингибиторы протеаз таблетированные (Sigma), 0,05% Тритон-Х100, 1мМ дитиотритол) 5 мин. на холоде. Для осаждения клеточных ядер пробы центрифугировали 3000 об/мин 15 мин, надосадок собирали и к осадку добавляли 50 мкл лизирующего буфера (20мМ HEPES (Sigma), 0,4М NaCl, 1мМ ЭДТА (ПанЭко), 20% глицерин, 1мМ фенилметилсульфонилфлюорид (Sigma), ингибиторы протеаз таблетированные (Sigm), 0,1% Тритон-Х100, 1мМ дитиотритол (LOBA)). Лизис проводили в течение 1ч при +4°С при постоянном перемешивании. Затем пробы смешивали с буфером для образцов (0,5М Трис-HCl, рН 6,8, ДДС-Na 2%, 0,1% бромфеноловый синий, 20% глицерин, 0,05% меркаптометанол) в соотношении 1:2 и прогревали 5 мин при +95°С. Вестери-блот Проводили ДДС-электрофорез в 12% полиакриламидном геле в электрофорезной ячейке Mini-PROTEAN II (BioRad), после чего переносили белки на нитроцеллюлозную мембрану (BioRad) в установке для полусухого переноса Trans-Blot® SD (BioRad). Мембрану блокировали в 2% растворе бычьего сывороточного альбумина в течение ночи при +4°С. Затем мембрану отмывали отмывающим буфером (10 мМ Трис-НС1, рН 7,4, 0,05% Tween-20) и инкубировали в растворе антител к NF-kB (mouse antiNF-кВ р65, Pharmingen) 2 ч при комнатной температуре при покачивании. По окончании инкубации мембрану отмывали и добавляли раствор коныогата с перокеидазой хрена (antimouse Ig-HRP, Pharmingen) на 1 ч при комнатной температуре при покачивании. После отмывки мембрану окрашивали субстратной смесью с хлоронафтолом. Результаты Как видно из рисунка 6, в пробах, где проводилась стимуляция препаратом «GA-40» обнаруживаются полосы соответствующие молекулярной массе 65 kDa и сходные с положительным контролем, прилагающимся к антителам к NF-kB. Причем в спонтанных пробах подобные полосы значительно меньшей интенсивности. Основываясь на этих результатах можно сделать вывод, что добавление препарата «GA-40» к клеткам линии 11937 вызывает отсоединение ингибирующей субъединицы от комплекса NF-kB р50-р65, вследствие чего р65 -субъединица мигрирует в ядро, где и была детектирована в результате эксперимента.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Целью данной работы было исследование возможных механизмов действия препарата «GA-40». В предыдущем исследовании было установлено, что средняя и большая доза препарата вызывают значительное повышение продукции ФНО-альфа. Многие исследования описывают участие киназ семейства РКС и ТРК, как моноцит/макрофаг передающих сигнал молекул, необходимых для продукции цитокинов в ответ на ЛПС. Мы предположили, что РКС и ТРК могут также участвовать в GA-40-опосредованном клеточном сигналинге при индуцировании этим препаратом синтеза ФНО-a. Для определения сигнальных компонентов, вовлеченных в GA-40-опосредованную продукцию ФНО-a мононуклеарами крови человека, мы исследовали вклад РКС и ТРК, используя фармакологические ингибиторы стауроспорин и геништейн соответственно. Стауроспорин и геништейн ингибируют продукцию ФНО-а, активированную исследуемым препаратом GA-40. Это может свидетельствовать о том, что РКС и ТРК вовлекаются в регуляцию цитокиновой продукции индуцированной GA-40. Среди РКС выделяют как Са2+-зависимые так и Са2+-независимые киназы. К первому типу относят традиционные РКС - α, β1, β2 и γ, которые для активации требуют Са2+ в присутствии фосфатидилсерина - фосфолипида, входящего в состав клеточной мембраны. Данный класс киназ активируется диацилглицеролом (ДАГ) и форболовыми эфирами. Ко второму типу принадлежат новые РКС (δ,ε,η,θ), которые активируются ДАГ, форболовыми эфирами или фосфатидилсерином, но являются Са2+-независимыми. Кроме того, атипичные РКС (ζ,λ,μ,τ) - зависят от фосфатидилсерина, но не активируются Са2+, ДАГ или форболовыми эфирами. Следующим этапом исследования стала оценка влияния «GA-40» на накопление внутриклеточного кальция для исключения той или иной группы РКС. Препарат не вызвал повышения внутриклеточного кальция в клетках периферической крови и значительно подавил этот показатель в лимфоцитах и нейтрофилах, активированных ионофором Са2+ - А23187. Возможно, «GA-40» препятствует чрезмерной активации клетки снижая внутриклеточную мобилизацию Са2+ или действие препарата на клетку осуществляется Са2+ -независимым путем, т.е. в процесс вовлекаются, вероятнее всего, РКС из группы новых или атипичных, независящие от Са2+ и активируемые фосфатидилсерином. Учитывая тот факт, что в активации клетки под действием препарата «GA-40» задействованы РКС, связанные с фосфатидилсерином, можно предположить, что тестируемый препарат взаимодействует с мембраной клетки. Взаимодействие может быть либо рецепторным, либо с фосфолипидами, гликопротеинами (Kilpatrick DC., 1999) или другими компонентами клеточной мембраны. Вопрос рецепции растительных белков еще является открытым, но нельзя исключить участия паттерн-распознающих рецепторов в этом процессе, возможно участие Т-клеточного рецептора (Kilpatrick DC, 1999). Из данных литературы известно, что внутриклеточные сигнальные пути, связанные с активацией РКС приводят к активации ядерного фактора NF-kB (Ярилин А.А., 1999). ЫР-кВ - ядерный транскрипционный фактор, который играет ключевую роль в функционировании иммунной системы. К активации NF-kB приводят цитокиновые сигналы (ФНО-альфа, ИЛ1), активация Т-клеточного и В-клеточного рецепторов, CD40-рецептора, кроме того, некоторые нерецепторные сигналы также могут вызывать активацию NF-kB (кислородный взрыв, УФ-облучение (Caammand J, Hunter С.А., 2002)). Учитывая полученные данные относительно участия РКС и индукции цитокинового ответа препаратом «GA-40» NF-kB представляется наиболее вероятной мишенью действия «GA-40». Экспериментальные данные подтвердили это предположение. NF-kB состоит из двух субъединиц с молекулярными массами 50 и 65 kDa, связанных ингибирующей субъединицей IkB. Этот комплекс постоянно находится в цитоплазме клетки. При поступлении активирующего сигнала IkB отсоединяется и освобожденные субъединицы мигрируют в ядро, где связывается со специфическими последовательностями промотерных зон генов-мишеней (Hayden М.S., 2004). В ядерных экстрактах клеток человеческой моноцитарной линии U937, инкубированных в присутствие 100 мкг/мл препарата обнаружена р65-субъединица NF-kB. Этот факт позволяет с большой долей вероятности предположить, что конечным этапом сигналинга, индуцированного «GA-40» является активация транскрипционного фактора NF-kB. NF-kB регулирует экспрессию цитокинов, факторов роста и ферментов участвующих в формировании активных форм кислорода. Активация «кислородного взрыва» в клетке говорит об увеличении бактерицидного потенциала клетки, активации ряда сигнальных молекул, запускающих защитные механизмы иммунной системы. Внутриклеточное увеличение уровня перекиси водорода в свою очередь является ключевым для активации ряда сигнальных молекул [Junn et al., 2000; Kim et а1., 2001; Koh et а1., 2001]. Добавление препарата к лейкоцитам в максимальной из тестируемых концентраций вызвало достоверное снижение внутриклеточной перекиси водорода. Возможно, этот эффект связан с антиоксидантным действием препарата и подтверждает результаты, полученные в предыдущих исследованиях (влияние на хемилюминесценцию лейкоцитов). Либо, препарат включает другие сигнальные пути, подавляющие чрезмерную активацию клеток. Активация NF-kB выражается также в активации макрофагов и дендритных клеток их способности поглощать, разрушать патогены и представлять на своей поверхности чужеродный антигенный материал. Для эффективной презентации чужеродного пептида и активации Т-клеток необходимо представление антигенного материала в составе главного комплекса гистосовместимости второго класса (HLA) и экспрессия костимуляторных молекул (CD40, CD80/86). Препарат «GA-40» в концентрации 100 мкг/мл при суточной инкубации практически не оказал влияние на экспрессию данных молекул макрофагами человека. Однако это не означает отсутствие активации макрофагов, возможно, активируются другие неисследованные факторы либо на поверхности макрофагов не представлены структуры, взаимодействующие с «GA-40». Таким образом, можно наметить некоторые этапы активации клетки под действием препарата «GA-40». Препарат «GA-40» взаимодействует преимущественно с какими-то мембранными структурами (рецепторы - лектиновые, Т-клеточный рецептор, фосфолипиды, гликопротеины или другие структуры клеточной мембраны). В результате происходят изменения структуры фосфатидилсерина и активация Са2+ -независимой протеинкиназы С из класса новых или атипичных и тирозиновых протеинкиназ. Протеинкиназный путь приводит к активации транскрипционного фактора NF-kB и его транслокацию в ядро. Активация NF-kB выражается в повышении продукции ФНО-альфа. Нельзя исключить включение других сигнальных путей и их взаимодействие, так как наблюдается неоднозначный эффект препарата на клетки (подавление продукции перекиси водорода, отсутствие повышения экспрессии костимуляторных молекул макрофагами). | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Похожие:
 | Диссертации: “Анализ разнообразия антитело-образующих клеток в иммунном ответе на овальбумин” Высшее образование: биолог, специальность “Микробиология” 1989, Биологический факультет мгу им. М. В. Ломоносова, Москва | | Перечень научно-исследовательских, опытно-конструкторских и технологических... Изучение закономерностей дифференцировки стволовых и прогениторных клеток из различных источников в условиях in vitro и in vivo и... |
| Перечень электронных образовательных ресурсов, разработанных учителем... Увеличительные приборы. Строение светового микроскопа и правила работы с ним. Лабораторная работа «Приготовление препарата клеток... | | Отчет о результатах клинического исследования, проведеного по ограниченной... «Открытое исследование по изучению эффективности и переносимости препарата лома люкс псориаз, раствор для внутреннего применения... |
| «Влияние различных веществ на рост и развитие растений» Целью исследования является накопление и обработка данных о влиянии солей тяжёлых металлов на рост и развитие растений, а так же... | | Жцк g1-рост, синтез (2n2c), s-репликация ДНК (2n4c), G2-накопление... Методы иссл. In vivo (вживл камер), in vitro (культуры тканей, культивир гиб-ридизация), прижизн окрашив, гист препараты (срез, пленка,... |
| Влияние микрогравитации на межклеточное взаимодействие иммунокомпетентных... | | Влияние антиоксидантного витаминного препарата на нарушения обмена... Работа выполнена на кафедре биологической химии гбоу впо «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения... |
 | Исследовательская работа по физике на тему: Звук. Влияние звука на... Целью семинара является обсуждение и проработка лучших мировых практик и современных моделей реализации проектного подхода в инженерном... | | Реферат по теме: «Вселенная: происхождение и исследование» Вселенную до конца изучить невозможно. Во Вселенной насчитывается миллиарды галактик, образующих сгущения, слои и цепочки, разделённые... |
| Биологические науки влияние условий культивирования и фазы роста... Геологическая съемка, поиски и разведка месторождений твердых полезных ископаемых | | Тематическое планирование уроков музыки по курсу «Музыкальная культура Тверского края» 8 класс Знание: 1- влияние различных предпосылок на формирование особенностей и культурных тра диций народов Верхневолжья с VII –iх в.: (Образование... |
| Способ криосохранения клеток морских беспозвоночных Дмсо. Способ позволяет повысить степень сохранности клеток морских беспозвоночных без нарушения их функциональной активности после... | | Реферат по проекту «Исследование языковой компетенции и «языкового самоощущения» «Исследование языковой компетенции и «языкового самоощущения» различных слоев российского общества»рук. Л. А. Вербицкая |
| Современные подходы в лечении диабета 2 типа Основным преимуществом инкретинов перед устаревшими стимуляторами инсулиновой секреции является их положительное влияние на численность... | | Исследование цветовой гаммы исследование естественного освещения... Исследование процентного соотношения кабинетов с люминесцентными и электрическими лампами |
