После сравнения частот аллелей и генотипов маркера Asp299Gly гена TLR4 в группах, разделенных по степени тяжести БА, была обнаружена выраженная ассоциация данного маркера с тяжестью течения БА у русских индивидов г. Москвы. Снижение частоты встречаемости аллеля Asp и генотипа Asp/Asp было отмечено в группе больных со средней и тяжелой степенью астмы, а аллеля Gly и генотипов Asp/Gly и Gly/Gly – в группе больных с легким течением БА. Различия в частотах аллелей являлись статистически достоверными, носительство минорного аллеля Gly связано с более тяжелым течением атопической БА (OR=2,12, 95% CI [1,08–4,18]), а аллеля Asp – с легким течением астмы (OR=0,47, 95% CI [0,24–0,93]) (Табл. 9).
Таблица 9.
Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера Asp299Gly гена TLR4 у больных с атопической БА разной степени тяжести.
Аллели и генотипы
|
Частота аллелей и генотипов
|
p
|
OR и 95% CI
|
БА легкой степени тяжести
|
БА средней и
тяжелой степени тяжести
|
Аллель Asp
|
0,948
|
0,895
|
0,035
|
0,47 [0,24–0,93]
|
Аллель Gly
|
0,052
|
0,105
|
2,12 [1,08–4,18]
|
Генотип Asp/Asp
|
0,903
|
0,833
|
> 0,05
|
-
|
Генотип Asp/Gly
|
0,089
|
0,123
|
> 0,05
|
-
|
Генотип Gly/Gly
|
0,008
|
0,044
|
> 0,05
|
-
|
Несмотря на то, что в некоторых работах была установлена ассоциация маркера Asp299Gly с БА (Fageras et al, 2004), в большом количестве исследований было показано отсутствие ассоциации (Raby et al, 2002; Noguchi at Al, 2004; Eder et al, 2005). Таким образом, наши результаты согласуются с данными большинства других исследователей. Только в одной работе исследовалась ассоциация маркера с тяжестью БА, однако ассоциации обнаружено не было, но была показана ассоциация генотипов Asp/Gly и Gly/Gly с тяжестью атопии (Yang et al, 2004).
Выявленная ассоциация полиморфного маркера Asp299Gly гена TLR4 с тяжестью течения БА подтверждает теорию о том, что при нарушении взаимодействия человека с микробным антигеном усиливается развитие аллергии и БА. Известно, что данный маркер ассоциирован c уменьшением клеточной экспрессии TLR-4 с последующим прекращением взаимодействия TLR-4 с ЛПС. Вероятно, ухудшение взаимодействия TLR-4 с ЛПС в большей степени влияет на прогрессию атопической БА, а не на возникновение данного заболевания.
Исследование ассоциации полиморфных маркеров C(–318)T и A(+49)G гена CTLA4 с атопической БА.
Ген CTLA4 расположен на хромосоме 2q33 и кодирует антиген 4, ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами. Это Т-клеточный рецептор, трансмембранный гликопротеин, экспрессирующийся в течение 2-3 дней после активации Т-лимфоцитов. Через CTLA-4 подается сигнал к подавлению активации Тh2 клеток, что приводит к смещению баланса в сторону развития ответа по Th1-зависимому типу (Oosterwegel et al, 1999).
Рис. 5. Полиморфные маркеры гена CTLA4.
В данной работе мы исследовали ассоциацию с БА двух полиморфных маркеров гена CTLA4. Полиморфный маркер C(–318)T представляет собой однонуклеотидную замену C → T в положении –318 промоторной области гена, другой маркер A(+49)G – однонуклеотидную замену A → G в положении +49 в экзоне 1, приводящую к аминокислотной замене треонина на аланин в положении 17 полипептидной цепи (Рис. 5). В нескольких исследованиях было установлено, что аллель T маркера C(–318)T ассоциирован с повышенной промоторной активностью гена (Wang et al 2002). Показано, что носительство аллеля Т приводит к повышению экспрессии CTLA-4 на поверхности активированных клеток и повышению уровня мРНК CTLA-4 в нестимулированных клетках, что подтверждает потенциальную роль данной замены в регуляции экспрессии гена (Ligers et al, 2001). В других исследованиях было установлено, что CTLA-4 ингибирует образование Th2-клеток из наивных хелперов (Th0), поэтому аллель Т можно рассматривать как защитный фактор против заболеваний с аллергической компонентой. У носителей аллеля Thr полиморфного маркера A(+49)G была обнаружена повышенная экспрессия CTLA-4 на поверхности активированной Т-клетки (Ligers et al, 2001). Также известно, что генотип Ala/Ala ассоциирован с уменьшением экспрессии CTLA-4 на поверхности Т-клеток с последующим ослаблением функции CTLA-4 (Kouki et al, 2000).
При изучении распределения аллелей и генотипов отмечено преобладание содержания аллеля С и генотипа СС полиморфного маркера C(–318)T в обеих группах (Табл. 10). Наблюдалось увеличение частоты встречаемости аллеля С и гомозиготного генотипа СС в группе больных БА по сравнению с контрольной группой и одновременное снижение частоты встречаемости аллеля Т и генотипов СТ и ТТ в этой же группе. При этом статистически достоверных различий в частотах выявлено не было, что говорит об отсутствии ассоциации данного маркера с развитием атопической БА.
Таблица 10.
Распределение аллелей и генотипов полиморфных маркеров C(–318)T и A(+49)G гена CTLA4 в группах с наличием (БА+) и отсутствием (БА–) атопической БА.
|
Частота аллелей и генотипов
|
p
|
«БА+»
|
«БА–»
|
C(–318)T
|
Аллель С
|
0,890
|
0,853
|
>0,05
|
Аллель T
|
0,110
|
0,147
|
Генотип СС
|
0,788
|
0,716
|
>0,05
|
Генотип СT
|
0,205
|
0,275
|
>0,05
|
Генотип TT
|
0,007
|
0,009
|
>0,05
|
A(+49)G
|
Аллель Thr
|
0,644
|
0,649
|
>0,05
|
Аллель Ala
|
0,356
|
0,351
|
Генотип Thr/Thr
|
0,385
|
0,410
|
>0,05
|
Генотип Ala/Thr
|
0,517
|
0,478
|
>0,05
|
Генотип Ala/Ala
|
0,098
|
0,112
|
>0,05
| В обеих группах отмечено преобладание содержания аллеля Thr и генотипа Ala/Thr маркера A(+49)G (Табл. 10). При исследовании распределения аллелей и генотипов данного полиморфного маркера между группами отмечено увеличение частоты встречаемости аллеля Ala и гетерозиготного генотипа Ala/Thr в группе больных с одновременным снижением частоты встречаемости аллеля Thr и гомозиготных генотипов Thr/Thr и Ala/Ala в этой же группе. Данные различия не являются статистически достоверными, что свидетельствует об отсутствии ассоциации полиморфного маркера A(+49)G гена CTLA4 с развитием атопической БА.
Также не было выявлено ассоциации маркеров гена CTLA4 с тяжестью течения БА.
Для оценки комбинированного вклада рассматриваемых маркеров гена CTLA4 в патогенез астмы нами был проведен анализ частот гаплотипов в группе больных атопической БА и группе здорового контроля. Наиболее частым гаплотипом в обеих группах был гаплотип дикого типа – С–Thr (Табл. 12). Можно отметить повышение частоты гаплотипов C–Ala и T–Thr у больных БА по сравнению со здоровым контролем, а также уменьшение частоты встречаемости гаплотипов C–Thr и T–Ala в группе больных БА. Только для гаплотипа T–Ala была обнаружена ассоциация с БА. Данный гаплотип связан с пониженным риском развития БА (ОR=0,081, 95% CI [0,01–0,647]).
Таблица 12.
Распределение частот встречаемости гаплотипов гена CTLA4 в группах с наличием (БА+) и отсутствием (БА–) атопической БА.
Гаплотипы
|
Частота гаплотипов
|
p
|
OR и 95% CI
|
«БА+»
|
«БА–»
|
C–Thr
|
0,536
|
0,548
|
>0,05
|
-
|
C–Ala
|
0,349
|
0,308
|
>0,05
|
-
|
T–Thr
|
0,111
|
0,101
|
>0,05
|
-
|
T–Ala
|
0,004
|
0,043
|
0,01
|
0,08 [0,01–0,65]
| Ассоциации гаплотипов гена CTLA4 с тяжестью течения БА обнаружено не было.
Полученные результаты согласуются с данными других исследователей. В трех работах, в которых изучались польская, японская и корейская популяции, также не было найдено ассоциации данных маркеров (по отдельности) с атопической БА (Nakao et al, 2000; Yasek et al, 2006; Lee et al, 2002). Однако корейскими учеными установлена ассоциация аллеля T маркера C(–318)T с тяжестью течения БА (Lee et al, 2002). В этой же работе была найдена ассоциация гаплотипа C–Ala по маркерам C(–318)T и A(+49)G с атопической БА (OR=0,702) (Sohn MH et al, 2007). Нами же получена ассоциация гаплотипа T–Ala c развитием БА (OR=0,081). Это можно объяснить тем, что частоты встречаемости аллелей и генотипов маркера A(+49)G широко варьируют в различных популяциях. Так, для корейцев было получено следующее распределение частот генотипов – Ala/Ala – 55-57%, Ala/Thr – 27-34%, Thr/Thr – 9-17% (Lee et al, 2002), которое сильно отличается от распределения частот генотипов у людей русского происхождения. Такая разница в частотах может влиять на различный вклад полиморфного маркера в генетическую предрасположенность к БА в зависимости от популяции.
Исследование ассоциации полиморфных маркеров rs324396 (С/Т) и rs740347 (G/C) гена GPRA с атопической БА.
GPRA (G protein-coupled receptor for asthma susceptibility) – ген рецептора G-белка, открытый позиционным клонированием. Данный ген ассоциирован с развитием БА и повышенным уровнем общего IgE (Laitinen et al, 2004). Рецептор GPRA относят к классу А семейства трансмембранных рецепторов, сопряженных с G-белком (GPCRs) (Vendelin et al, 2005).
В результате альтернативного сплайсинга образуется несколько изоформ GPRA. На данный момент обнаружено 7 альтернативных вариантов, из них две изоформы длинные, изоформа GPRA-A и GPRA-B, остальные – короткие (Laitinen et al, 2004; Vendelin et al, 2005). Изоформа GPRA-A, также известная как GPRA154 и VRR1, в основном экспрессируется в гладкомышечных клетках дыхательных путей, как у больных БА, так и у здоровых индивидов. Изоформа GPRA-B экспрессируется в большом количестве в эпителиальных и гладкомышечных клетках дыхательных путей больных БА, в отличие от здоровых людей. Таким образом, предполагают, что изоформа GPRA-B играет роль в функционировании эпителия дыхательных путей, (Davies et al, 2002), а также может вносить вклад в развитие бронхиальной гиперреактивности (Postma et al, 2005).
Ген GPRA локализован на хромосоме 7p14. Ряд однонуклеотидных маркеров в гене GPRA показал выраженную ассоциацию с БА, бронхореактивностью и повышенным уровнем IgE в разных европейских популяциях (Laitinen et al, 2004; Kormann et al, 2005; Melen et al, 2005). При исследовании ассоциации 133 кб геномного сегмента, захватывающего ДНК с интрона 2 до интрона 5 гена GPRA, обнаружили, что интрон 2 наиболее сильно ассоциирован с БА. Нами были изучены два полиморфных маркера в интроне 2. Первый маркер rs324396 гена GPRA представляет собой однонуклеотидную замену С → Т, второй маркер rs740347 – однонуклеотидную замену G → С.
Таблица 13.
Распределение аллелей и генотипов полиморфных маркеров rs324396 и rs740347 гена GPRA в группах с наличием (БА+) и отсутствием (БА–) атопической БА.
Аллели и генотипы
|
Частота аллелей и генотипов
|
p
|
OR и 95% CI
|
«БА+»
|
«БА–»
|
|
rs324396
|
Аллель C
|
0,639
|
0,708
|
0,02
|
0,73 [0,56–0,95]
|
Аллель Т
|
0,361
|
0,292
|
1,37 [1,05–1,78]
|
Генотип CC
|
0,376
|
0,504
|
0,004
|
0,59 [0,42–0,84]
|
Генотип CT
|
0,526
|
0,407
|
0,008
|
1,61 [1,14–2,29]
|
Генотип TT
|
0,098
|
0,089
|
> 0,05
|
-
|
rs740347
|
Аллель G
|
0,876
|
0,906
|
> 0,05
|
-
|
Аллель C
|
0,124
|
0,094
|
Генотип GG
|
0,766
|
0,826
|
> 0,05
|
-
|
Генотип CG
|
0,220
|
0,161
|
> 0,05
|
-
|
Генотип CC
|
0,014
|
0,013
|
> 0,05
|
-
| В обеих группах отмечено преобладание содержания аллеля С маркера rs324396. В группе больных БА чаще встречался гетерозиготный генотип СТ, а в группе здорового контроля – гомозиготный генотип СС (Табл. 13). При исследовании распределения частот аллелей и генотипов данного полиморфного маркера между группами отмечено увеличение частоты встречаемости аллеля Т и генотипов СТ и ТТ в группе больных с одновременным снижением доли аллеля С и генотипа СС в этой же группе по сравнению с группой здорового контроля. Данные различия носят статистически достоверный характер и свидетельствуют об ассоциации гена GPRA с развитием атопической БА у русского населения г. Москвы. При этом носительство аллеля Т и гетерозиготного генотипа СT связано с увеличением риска развития БА (OR=1,37, 95% CI [1,05–1,78] и OR=1,61, 95% CI [1,14–2,29], соответственно). Аллель С и генотип СС, напротив, являются протективными (OR=0,73 95% CI [0,56–0,95] и OR=0,59 95% CI [0,42–0,84], соответственно).
В обеих группах отмечено преобладание содержания аллеля G и генотипа GG полиморфного маркера rs740347. Гомозиготный генотип CC встречался в обеих группах примерно с одинаковой частотой (1,3-1,4%) (Табл. 13). При исследовании распределения аллелей и генотипов данного полиморфного маркера в группах отмечено увеличение частоты встречаемости аллеля C и генотипа CG с одновременным уменьшением частоты гомозиготного генотипа GG в группе больных по сравнению с группой здорового контроля. Данные различия не являются статистически достоверными, что свидетельствует об отсутствии ассоциации данного маркера с развитием атопической БА.
Таблица 15.
Распределение частот встречаемости гаплотипов гена GPRA в группах с наличием
Гаплотипы
|
Частота гаплотипов
|
p
|
OR и 95% CI
|
«БА+»
|
«БА–»
|
C–G
|
0,550
|
0,617
|
> 0,05
|
-
|
C–C
|
0,081
|
0,087
|
-
|
T–G
|
0,328
|
0,291
|
> 0,05
|
-
|
T–C
|
0,041
|
0,005
|
0,008
|
9,47 [1,21–73,94]
| |
