Учебно-методический комплекс рабочая программа для студентов направления 020400. 68 Биология
Скачать 327.4 Kb.
|
1 2
Разделы дисциплины и междисциплинарные связи с обеспечиваемыми (последующими) дисциплинами
1. Введение Суть генетической инженерии. Основные принципы, на которых базируется генно-инженерная технология. Основные этапы развития генетической инженерии. Схема типичного эксперимента по получению и клонированию рекомбинантных молекул ДНК. Использование методологии генетической инженерии при решении задач различных областей биологии. Использование достижений генетической инженерии в сельском хозяйстве и медицине. 2. Ферменты генетической инженерии Основные принципы организации систем рестрикции-модификации у бактерий. Классификация и номенклатура рестриктаз. Ферменты класса IIS. Изошизомеры. Гетерошизомеры. Типы сайтов рестрикции. Крупно- и мелкощепящие рестриктазы. Встречаемость тетра- и гексануклеотидов в ДНК. Фрагменты с выступающими 3’- , 5’- и тупыми концами. Изменение концов рестрикционных фрагментов ДНК. Использование линкеров и адаптеров. Единицы активности рестриктазы. Специфичность рестриктаз. Снижение специфичности рестриктаз (star-activity) и обуславливающие ее факторы. Использование рестриктаз для конструирования рекомбинантных молекул in vitro. Сайты рестрикции как генетические маркеры. Использование рестриктаз для физического картирования, анализа полиморфизма ДНК, штаммоспецифической характеристики вирусов и бактерий. Использование ДНК-метилаз в генной инженерии. ДНК- и РНК-лигазы фага Т4. Механизм реакции, осуществляемой Т4-ДНК-лигазой. ДНК-зависимые ДНК-полимеразы. Механизм синтеза ДНК. Экзонуклеазные активности ДНК-полимераз. Терминальная трансферазная активность. ДНК-полимераза I из E.coli. Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I. ДНК-полимераза фага Т4. Термостабильные ДНК-полимеразы. Применение ДНК-зависимых ДНК-полимераз. Модификация концов ДНК. Ник-трансляция. РНК-зависимые ДНК-полимеразы (обратные транскриптазы). Использование обратных транскриптаз для синтеза кДНК. Обратные транскриптазы вируса миелобластоза птиц (AMV) и вируса мышиной лейкемии Молони (M-MLV). Стратегии синтеза кДНК: со специфическими, случайными и олиго(dT)-праймерами. РНК-полимеразы фагов T3, T7, SP6. Дезоксирибонуклеазы. Рибонуклеазы. Полинуклеотидкиназа фага Т4. Щелочные фосфатазы. Терминальные трансферазы. Экзо- и эндонуклеазы. 3. Полимеразная цепная реакция и электрофорез нуклеиновых кислот Сущность метода полимеразной цепной реакции. Условия проведения реакции и компоненты реакционной смеси. История изобретения ПЦР. Накопление специфического продукта в процессе ПЦР. Факторы, влияющие на точность синтеза ДНК. Специфичность и эффективность ПЦР. Модификации метода: Hot start PCR (ПЦР с горячим стартом), Real-time PCR (ПЦР в реальном времени), асимметричная ПЦР, иммобилизованная ПЦР, Nested PCR («Гнездовая» ПЦР) и др. Флуоресцентные зонды для Real-time PCR. Требования к праймерам и зондам. Применение ПЦР в молекулярной диагностике и генной инженерии. ПЦР в выявлении мутаций. Синтез генов с помощью ПЦР. Способы получения фрагментов ДНК с делециями, вставками или точечными заменами. Метод секвенирования ДНК по Сенгеру. Секвенирование ДНК с использованием флуоресцентных дидезоксинуклеотидов. Теоретические и методологические основы электрофореза. Электрофоретическая подвижность нуклеиновых кислот. Разновидности метода и виды используемых гелей. Реакция полимеризации акриламида. Электрофорез нуклеиновых кислот в денатурирующих условиях. Маркеры размеров ДНК. Электрофорез в импульсном электрическом поле. Способы детекции макромолекул в геле после проведения электрофореза. 4. Клонирование ДНК и экспрессия клонированных генов Этапы клонирования ДНК. Методы конструирования гибридных молекул ДНК in vitro. Понятие вектора и реципиента. Требования, предъявляемые к векторным молекулам. Плазмидные векторы. Основные сведения о плазмидах. Механизмы репликации плазмид. Понятие о репликоне. Плазмидные гены устойчивости к лекарственным препаратам. Несовместимость плазмид. Плазмиды с узким и широким кругом хозяев. Плазмидые векторы клонирования в клетках E. coli. Плазмида pSC101 – первая векторная плазмида. Свойства плазмиды ColE1 и векторов на ее основе (серия векторов pBR, серия векторов pUC). Фагмиды. Векторы на основе бактериофагафага λ. Организация фаговой хромосомы. Репликация фаговой ДНК. Общие принципы конструирования векторов на основе фага. Стратегия клонирования в фаговых векторах. Векторы на основе фага М13. Преимущества и недостатки векторов на основе фага М13. Области использование векторов на основе однонитевых фагов. Инсерционные векторы и векторы с замещением. Космиды. Основные свойства космид. Принципы клонирования в космидах с одним и двумя cos-сайтами. Упаковка рекомбинантных молекул в фаговые частицы in vitro. Образование конкатамеров и роль cos-сайтов при упаковке ДНК в фаговые частицы in vitro. Преимущества и недостатки космидной системы. Векторы специального назначения. Прокариотические и эукариотические векторы экспрессии; их структурная организация. Интегративные и челночные (бинарные) векторы. Принципы клонирования фрагментов ДНК. Увеличение эффективности клонирования путем подбора оптимального молярного соотношения концов вектора и клонируемого фрагмента. Клонирование фрагментов в определенной ориентации. Лигирование фрагментов ДНК с «тупыми» концами. Лигирование фрагментов ДНК с «липкими» концами, образуемыми разными рестриктазами. Гибридные сайты. Клонирование без лигирования вектора и вставки. Введение рекомбинантных ДНК в клетки бактерий. Особенности трансформации у разных видов бактерий. Трансформация клеток E.coli. Трансформация плазмидными ДНК клеток бацилл. Электропорация. Способы введения ДНК в культивируемые клетки животных. Методы отбора и анализа рекомбинантных молекул ДНК. Методы отбора, основанные на фенотипическом различии рекомбинантных и нерекомбинантных клонов. Клонирование с инсерционной инактивацией. Ген lacZ E.coli как маркер при клонировании. Метод прямой селекции рекомбинантных клонов по комплементации. Векторы прямой селекции рекомбинантных клонов. Методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот. ПЦР в селекции рекомбинантных клонов. Методы на основе рестрикционного анализа. Системы экспрессии генов в бактериальных клетках. Проблемы экспрессии чужеродных генов в клетках бактерий. Клетки дрожжей как экспрессирующие системы. Системы экспрессии, основанные на культуре клеток животных. Бесклеточные системы синтеза белка. 5. Анализ геномов и экспрессии генов Цели и задачи геномики. Функциональная геномика. Генетические и физические карты генома. Построение генетических карт сцепления. Использование хромосомных аберраций для построения карт сцепления. Цитогенетический и псевдогенетический анализ структуры генома. Флуоресцентная гибридизация in situ. Сравнительная геномная гибридизация. Физические карты низкого разрешения: хромосомные карты; EST-маркеры (маркеры экспрессирующихся последовательностей) и их использование для построения карт кДНК. Физические карты генома высокого разрешения. Построение карт высокого разрешения. Концепция STS-маркеров (сайты, привязанные к последовательностям). Рестрикционный анализ. «Прогулки и прыжки» по хромосомам. Стратегия секвенирования больших геномов. ДНК-диагностика и генотипирование. Использование микросателлитных последовательностей для идентификации личности человека. Исследование экспрессии генов на уровне транскрипции. Транскриптом. Дифференциальный дисплей (DD). Анализ репрезентативных различий РНК (RDA). Серийный анализ экспрессии генов (SAGE). Супрессорная вычитающая гибридизация. Использование микроматриц и микрочипов нуклеиновых кислот для крупномасштабного профилирования экспрессии генов. Изменение уровней экспрессии генов с использованием нуклеиновых кислот. Антисмысловые РНК и олигонуклеотиды. Природные антисмысловые РНК. Механизм ингибирующего действия антисмысловых нуклеиновых кислот: участие РНКазы H, дезаминирование остатков аденина; РНК-интерференция. Рецепторная и ферментативная активность нуклеиновых кислот. Олигонуклеотидные аптамеры и методы их получения. Нуклеозимы: рибозимы и дезоксирибозимы. Природные РНК, обладающие нуклеазной активностью. Искусственные рибозимы-эндонуклеазы. Нуклеозимы, обладающие РНК-лигазной активностью. Минизимы и максизимы. Аптазимы. Подходы к использованию нуклеозимов для лечения вирусных и онкологических заболеваний. 6. Трансгенные животные и растения Феномен трансгенеза. Способы получения трансгенных животных. Прямая инъекция ДНК в пронуклеусы оплодотворенных яйцеклеток. Использование эмбриональных стволовых клеток. Применение рекомбинантных вирусов для заражения эмбриональных клеток зародыша. Векторы, используемые для доставки трансгенов в организм млекопитающих: ретровирусные и аденовирусные векторы. Факторы, оказывающие влияние на экспрессию трансгенов в организме трансгенных животных. Направленная активация и инактивация генов in vivo: генные нок-ин’ы и нокауты. Современные методы инактивации генов с применением энхансерных, генных и промоторных ловушек. Регулируемая экспрессия трансгенов в организме животных. Трансгенные растения. Эмбриональные стволовые клетки растений. Основные этапы получения трансгенных растений. Культура каллуса и суспензионные культуры клеток. Получение протопластов. Фитогормоны, используемые для регенерации растений. Соматический эмбриогенез. Методы, используемые для трансформации объектов растительного происхождения. Системы контроля экспрессии рекомбинантных генов у растений. Агробактериальная инфекция. Ti-плазмиды и T-ДНК. Трансгенные хлоропласты. Преимущества использования хлоропластов для экспрессии трансгенов. Клонирование многоклеточных организмов. Этапы клонирования. Методы введения ядер соматических клеток в яйцеклетки. Причины низкой эффективности клонирования. Стадии клонирования млекопитающих.
1. Семинар «История и методология генетической инженерии» Обсуждаемые темы: 1. История развития генетической инженерии. 2. Основные принципы генно-инженерной методологии. 3. Области практического применения генетической инженерии. 2. Семинар «Ферменты генетической инженерии» Обсуждаемые темы: 1. Функциональные свойства эндонуклеаз рестрикции. 2. Особенности использования эндонуклеаз рестрикции в генетической инженерии. 3. Разнообразие, свойства и возможности применения ДНК-зависимых ДНК-полимераз. 4. Обратные транскриптазы, их функциональные особенности и применение. 5. Прочие ферменты, используемые в молекулярном клонировании. 3. Семинар «ПЦР и электрофорез» Обсуждаемые темы: 1. Сущность метода полимеразной цепной реакции. 2. Разновидности метода полимеразной цепной реакции. 3. Области применения ПЦР. 4. Сущность электрофоретических методов. 5. Способы детекции макромолекул в геле после проведения электрофореза. 4. Семинар «Клонирование ДНК» Обсуждаемые темы: 1. Методы конструирования гибридных молекул ДНК. 2. Структура и свойства плазмидных векторов. 3. Особенности использования фаговых векторов. 4. Космиды и векторы специального назначения. 5. Методы введения рекомбинантных ДНК в реципиентные клетки. 6. Методы отбора и анализа рекомбинантных молекул ДНК. 7. Системы экспрессии генов. 5. Семинар «Анализ геномов и генной экспрессии» Обсуждаемые темы: 1. Методы построения генетических карт сцепления. 2. Физические карты генома низкого и высокого разрешения. 3. ДНК-диагностика и генотипирование. 4. Методы исследования экспрессии генов на уровне транскрипции. 5. Антисмысловые технологии, аптамеры, нуклеозимы. 6. Семинар «Трансгенные организмы» Обсуждаемые темы: 1. Способы получения трансгенных животных. 2. Направленная активация и инактивация генов in vivo. 3. Особенности получения трансгенных растений. 4. Клонирование многоклеточных организмов.
II. Ферменты генетической инженерии. Темы рефератов: 1. Эндонуклеазы рестрикции. 2. Метилазы. 3. ДНК-лигазы. 4. РНК-лигазы. 5. ДНК-зависимые ДНК-полимеразы. 6. ДНК-зависимые РНК-полимеразы. 7. Обратные транскриптазы. 8. Рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы. 9. Полинуклеотидкиназы. 10. Фосфатазы. III. Полимеразная цепная реакция и электрофорез нуклеиновых кислот. Электронный практикум: Дизайн праймеров и зондов для ПЦР. IV. Клонирование ДНК и экспрессия клонированных генов. Электронный практикум: Выбор и обоснование подхода к клонированию конкретного гена. Вопросы к зачету:
Мультимедийные средства обучения (презентации и видеофильмы по темам: электрофорез, блоттинг, полимеразная цепная реакция, трансформация микроорганизмов, секвенирование нуклеиновых кислот, принципы клонирования генов, технология ДНК-чипов), проблемные и исследовательские методы, специализированные программы.
9.1. Основная литература: 1. Льюин Б. Гены. – М.: Бином. Лаборатория знаний, 2012. – 896 с. 2. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. – Новосибирск: Сибирское университетское издательство, 2004. – 496 с. 9.2. Дополнительная литература: 1. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. – М.: Мир, 2002. – 585 с. 2. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика: учеб. пособие для студентов ун-тов, обуч. по напр. 510600 - Биология и биолог. спец. – Новосибирск: Сибирское университетское издательство, 2003. – 479 с. 3. Клаг У.С., Каммингс М.Р. Основы генетики: курс лекций. – М.: Техносфера, 2009. – 896 с. 4. Сингер М., Берг П. Гены и геномы: В 2-х т. – М.: Мир, 1998. 9.3. Программное обеспечение и интернет-ресурсы: 1. Программа Vector NTI Advance 9.1. 2. Программа GeneRunner 3.05. 3. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 4. http://highwire.stanford.edu/ 5. http://molbiol.ru/
Дисциплина обеспечена компьютерными презентациями, составленными автором, видеофильмами. На факультете имеется для проведения занятий 3 мультимедийные аудитории, есть специализированные лаборатории: центр микроскопии (№408), оснащенный электронным микроскопом LSM 510-мета, фазово-контрастным микроскопом Axioimager А1; лаборатория молекулярной генетики (№309), оснащенная высокоэффективным жидкостным хроматографом, оборудованием для проведения ПЦР и протеомных исследований; лаборатория популяционной генетики (№111), оснащенная приборами для проведения электрофореза и цитогенетических исследований. | ||||||||||||||||||||||||||||||
1 2
