Практикум по физико-химическим методам в биологии Учебно-методическое пособие

Применение в физиологии и медицине Развитие современной биохимии, химии и физики и внедрение их результатов в медицинскую практику происходит во всё более ускоряющемся темпе. Характерной чертой современного этапа развития медицины является активное использование не только в медико-биологических экспериментах, но и в рутинной клинической практике наиболее современных методов исследования физико-химической биологии. Оптические методы анализа широко используются в биологии и медицине. Эти методы позволяют проводить анализ веществ, получать информацию о строении, структуре, состоянии и превращениях различных компонентов в химических и биолологических системах. К наиболее широко распространенным в биологии и медицине оптическим методам принадлежит спектроскопия. Областью применения является определение атомного и молекулярного состава вещества, его структуры, состояния, концентрации и др. Концентрация и свойства оптически активных молекул исследуются специальным оптическим методом - поляриметрией, основанным на измерении с помощью поляриметров угла вращения плоскости поляризации проходящего через оптически активную среду поляризованного света. Метод поляриметрии используется в медицинской практике для определения концентрации сахара в моче, углеводов в растительном сырье, концентрации и состояния белков и нуклеиновых кислот, для исследования активности ферментов, расщепляющих углеводы, и др. В медицине используется также метод рефрактометрии, основанный на измерении показателя преломления света в исследуемой среде. Он применяется для определения чистоты дистиллированной воды, концентрации сахарозы, содержания белка в сыворотке крови, анализа растворов для инъекций, препаратов лекарственных смесей, для измерения концентрации спирта в настойках. По величине показателя преломления можно определить влажность различных пищевых продуктов, содержание белка в молоке. Методы рефрактометрии используются при исследовании рефракции глаза. Существуют оптические методы, позволяющие измерить величину рассеяния света объектом (коллоидными растворами, суспензиями, различными взвесями и др.). Приборы, предназначенные для исследования светорассеяния, получили название нефелометров и турбидиметров. С помощью этих методов определяют молекулярную массу и размеры различных макромолекул (белков, нуклеиновых кислот) и частиц в коллоидных растворах, суспензиях, а также получают информацию о характере межмолекулярных взаимодействий. В медицине также применяют флуоресцентную микроскопию и флуоресцентный анализ. Так флуоресцентная ангиография - метод исследования кровеносных сосудов глаза, основанный на их контрастировании путем внутривенного введения флюоресцеина и серийного фотографирования. Применяется с целью диагностики и контроля за ходом лечения заболеваний сетчатки, зрительного нерва и сосудистой оболочки глаза. 2.1 Фотоколориметрический анализ Приборами для фотоколометрии служат фотоэлектроколориметры (ФЭК), характеризующиеся простотой оптической и электрической схем. Измеряемый диапазон оптической плотности составляет 0.05 – 3.0, что позволяет определять вещества в широком интервале содержаний от 10-6 до 50%. Для дополнительного повышения чувствительности и селективности определений существенное значение имеют подбор реагентов, образующих интенсивно окрашенные комплексные соединения с определяемыми веществами. Погрешность измерений колеблется от 5 до 0.2 % Из отечественной аппаратуры наиболее распространены следующие марки фотоколориметров: - однолучевой колориметр фотоэлектрический КФО с одним каналом - двулучевые типа ФЭК-М, ФЭК-56, ФЭК-56М. Они предназначены для определения концентрации вещества в окрашенных или коллоидных растворах в диапазоне длин волн 315-670 нм и снабжены 8 светофильтрами. Фотоколориметры КФК-3 предназначены для измерения коэффициентов пропускания и оптической плотности прозрачных твердых образцов. Спектральный диапазон работы 315-990 нм. Фотоколориметры широко применяются для проведения серийных определений концентраций веществ на предприятиях водоснабжения, химической, пищевой промышленности, медицине, фармакологии. Практическая часть. Общие указания к выполнению лабораторных работ по фотометрическим методам анализа Включить прибор за 15-20 минут до начала измерений. Отсчет по шкале прибора производить несколько раз, повторив все операции компенсации до получения воспроизводимых результатов, результат измерения сразу записать в рабочий журнал. Кюветы, в которых предстоит произвести измерения, должны быть предварительно тщательно вымыты водой, а при необходимости и спиртом. Рабочая длина кюветы оговаривается методикой. Кювету можно брать только за боковые грани. Заполнение кюветы производится до уровня риски на боковой грани. Перед помещением кюветы в прибор ее необходимо тщательно обсушить снаружи фильтровальной бумагой и отполировать мягкой тканью грани, через которые будет проходить световой поток. При приготовлении растворов необходимо строго следовать предлагаемой методике. При приготовлении анализируемого раствора в мерной колбе его объем необходимо доводить до метки дистиллированной водой и тщательно перемешать. Объемы растворов можно измерять пипеткой, мерным цилиндром, используя для каждого раствора свою пипетку или цилиндр. Работа № 2 Знакомство с устройством и работой приборов для фотоколометрического анализа на примере КФК-2 Цель – ознакомиться с устройством фотоколориметра КФК-2. 1. Назначение КФК-2 (рис. 3) предназначен для измерения в отдельных участках диапазона длин волн 315-980 нм, выделяемых светофильтрами, коэффициентов пропускания и оптической плоскости жидкостных растворов и твердых тел, а так же определения концентрации веществ в растворах методом построения градуировочных графиков. КФК-2 позволяет производить измерения коэффициентов пропускания рассеивающих взвесей, эмульсий и коллоидных растворов в проходящем свете. 2. Принцип действия Принцип измерения коэффициента пропускания состоит в том, что на фотоприемник направляются поочередно световые потоки полный F0λ и прошедший через исследуемую среду Fλ и определяется отношение этих потоков. Отношение потоков есть коэффициент пропускания τ исследуемого раствора: (5) На колориметре это отношение определяется следующим образом. Вначале в световой поток помещают кювету с растворителем или концентрационным раствором. Изменением чувствительности колориметра добиваются, чтобы отсчет по шкале коэффициентов пропускания колориметра n 1 был равен 100. Таким образом, полный световой поток F0λ условно принимается за 100%. Затем, в световой поток помещают кювету с исследуемым раствором. Полученный отсчет n 2 по шкале коэффициентов пропускания колориметра будет соответствовать Fλ. Следовательно, коэффициент пропускания исследуемого раствора в % будет равен n 2, то есть Τ 100%= n 2 (6) Оптическая плотность Д определяется по формуле: (7) 3. Порядок работы включить колориметр в сеть за 15 мин до начала измерений. установить нужный цветной светофильтр. установить чувствительность (1,2,3). перед измерением открыть крышку фотоприемника и проверить установку «0» (слева на шкале). закрыть крышку кюветного отделения и ручками чувствительность и установка «100» грубо и плавно установить отсчет 100 (справа по шкале). Ручка чувствительности может быть в одном из трех положений (1,2,3). В световой пучок поместить кювету с контрольным раствором и провести все операции пунктов 4-5. заменить кювету с контрольным раствором на кювету с исследуемым раствором. Снять показания 3-4 раза и учесть среднее значение. При переключении светофильтров чувствительность должна быть «1», а «100» грубо – в крайнем левом положении. Рисунок 3 - Вид колориметра спереди регистрирующий прибор со шкалой, оцифрованной в коэффициентах пропускания Т и оптической плотности Д, 2-блок питания, 3-ручка установки светофильтра, 4-ручка переключения кювет в световом пучке, 5-ручка переключения чувствительности, 6-ручка установки и регулировки чувствительности, 7-крышка кюветного отделения. Работа № 3 Фотоколориметрическое определение содержания железа методом сравнения. Цель: 1 Ознакомиться с определением содержания вещества методом сравнения. 2 Определение содержания железа в исследуемом растворе. Для работы необходимо: прибор — ФЭК, стандартный раствор с содержанием железа 0.1 мг/мл, азотная кислота, сульфосалициловая кислота либо роданид калия, дистилированная вода, мерные цилиндры, стаканы. Ход работы: 1 Выбор светофильтра. Максимальное изменение оптической плотности на единицу концентрации в соответствии с законом Бугера-Ламберта-Бера наблюдается при длине волны, соответствующей максимальному значению коэффициента поглощения. Определить требуемую область длин волн можно из справочной литературы или экспериментально, измерив значения оптической плотности поглощающего раствора при различных длинах волн. При работе с ФЭК для выделения нужных областей спектра используют светофильтры. Максимум пропускания светофильтра совпадает с максимумом поглощения определяемого вещества. Поэтому наиболее подходящим для фотометрирования считается тот светофильтр, при использовании которого получено максимальное значение величины оптической плотности анализируемого раствора. Измерение абсорбции эталонного раствора железа необходимо проводить не по отношению к воде, а по отношению к смеси всех реактивов, кроме стандартного раствора. Для приготовления эталонного раствора №1 в мерный цилиндр налить 10 мл стандартного раствора. Добавить 10 мл азотной кислоты концентрацией 4 моль/л и 10 мл роданида калия либо сульфосалициловой кислоты. Довести содержимое до 100 мл дистилированной водой и тщательно перемешать. Раствор сравнения готовить в цилиндре вводя реактивы в той же последовательности к дистилированной воде. Измерить оптическую плотность эталонного раствора по отношению к раствору сравнения последовательно при всех светофильтрах, используя кюветы с рабочей длиной 10 мм. Полученные результаты измерений представить в виде графика “Зависимость величины оптической плотности от длины волны”. На основе анализа полученных данных следует выбрать светофильтр и приступить к дальнейшим измерениям. 2 Определение железа в исследуемом растворе. Приготовить эталонный раствор № 2 с содержанием стандартного раствора 20 мл по описанной выше схеме. Получить у лаборанта анализируемый раствор добавить в него реактивы по описанной выше схеме. Измерить оптическую плотность для анализаруемого и эталонного растворов. Результаты занести в таблицу 2. Таблица 2 Результаты измерений оптической плотности. Эталонный раствор №1 Эталонный раствор №2 Содержание железа в эталонных растворах Сэт, мг Оптическая плотность эталонных растворов А Отношение Сэт/А Рассчитать среднее отношение Сэт/А. Вычислить содержание железа в исследуемом растворе Сх, используя формулу 2 (см. Главу 1). Сделать выводы. Работа № 4 Определение содержания меди методом калибровочного графика Цель: 1 Ознакомиться с алгоритмом построения фотомметрической методики с использованием метода калибровочного графика. 2 Фотоколориметрическое определение содержания меди. Для работы необходимо: прибор — ФЭК, раствор медного купороса с содержанием меди 1 мг/мл, дистилированная вода, мерные цилиндры, стаканы. Ход работы: 1 Приготовление эталонных растворов Для построения калибровочного графика необходимо приготовить 4-5 эталонных растворов. Для этого имеющийся исходный раствор медного купороса разбавляют в 10, 5, и 2 раза. 2 Выбор светофильтров Для выбора светофильтра для последующей работы используют раствор с минимальным содержанием меди. Раствором сравнения в этой работе является вода. Измерения проводят также как описано в предыдущей работе. По результатам строят график и выбирают подходящий светофильтр. 3 Построение калибровочного графика Производиться измерение оптической плотности четырех имеющихся эталонных растворов. Результаты фотометрирования записываются в рабочий журнал, затем по ним строиться калибровочный график в координатах оптическая плотность – концентрация меди. Масштаб графика должен соответствовать точности измерений. Затем получить у лаборанта или преподавателя анализируемый раствор и измерить его оптическую плотность, используя тот же раствор сравнения что и при построении калибровочного графика. Определить по графику содержание меди в анализируемом растворе. Сделать вывод. Работа № 5 Наблюдение закона Бугера-Ламберта-Бера и отклонений от него. Цель: Проверить соблюдение закона Бугера-Ламберта-Бера Для работы необходимо:прибор — ФЭК, раствор перманганата калия 1, 0.1, 0.01, 0.001%, дистилированная вода, мерные цилиндры, стаканы. Ход работы: 1 Выбор светофильтра Для выбора светофильтра для последующей работы используют раствор с минимальным содержанием перманганата калия с длиной кюветы 50 мм. Раствором сравнения в этой работе является вода. Измерения проводят также как описано в работе 2. По результатам строят график и выбирают подходящий светофильтр. 2 Проверка закона Бугера-Ламберта-Бера Измерить оптическую плотность имеющихся растворов начиная с самой маленькой концентрации и длиной кюветы 50 мм. Если при увеличении концентрации наблюдаются максимальные значения оптической плотности и нет дальнейших изменений. Применить для измерения кювету с меньшей длиной. По результатам построить график зависимости оптической плотности от концентрации вещества (для каждой длины кюветы). Сделать вывод о виде отклонения от закона Бугера-Ламберта-Бера. 2.2 Спектрометрия Ультрафиолетовая спектроскопия (УФ) (400-200K нм) находит применение для анализа продуктов нефтехимии. В других областях она используется редко из-за перекрывания полос поглощения и малой специфичности. Неограниченные возможности не только для качественного анализа, но и для определения строения молекул вновь синтезированных веществ, имеет спектроскопия в ИК области. В основе метода – неповторимость ИК спектра соединения. Спектры каждого соединения имеют так называемые характеристические полосы поглощения при определенных длинах или частотах, которые отвечают конкретным атомным связям или функциональным группировкам. Так, характеристическая полоса поглощения OH –группы проявляется при различных частотах в соединениях: – карбоновые кислоты (мономеры) – 1380 1280K см–1; – карбоновые кислоты (димеры) – 3100 2500K см–1; – первичные спирты 3400 3200K см–1. То есть по частоте характеристической полосы можно судить не только о наличии определенной функциональной группы, но и принадлежности вещества к тому или иному классу соединений. Как правило, отсутствие в ИК спектре данной полосы, указывает на то, что соответствующей группы в исследуемом веществе нет. Но нет правил без исключения. Например, колебания ― C ≡C ― связи в молекулах с высокой симметрией (например, если связь находится в центре молекулы) не проявляются. Иногда искомая полоса перекрывается за счет примесных соединений, или происходит совпадение частот характеристических полос различных функциональных групп. В этом случае следует прибегнуть к другим методам анализа. В настоящее время опубликованы атласы и таблица ИК спектров свыше 20 тыс. соединений, что облегчает проведение анализа. Из аппаратуры отечественного производства наиболее распространены неавтоматические однолучевые спектрофотометры типа СФ-16 и СФ-26, а также автоматические регистрирующие спектрофотометры СФ-10 и СФ-40. Для анализа органических соединений методом ИК-спектроскопии достаточно широко используются зарубежные спектрофотометры (например «Specord» производства Карл Цейс). Для расшифровки структуры молекул органических соединений разработаны автоматизированные системы, основанные на использовании микросхем, в память которых заложены спектры поглощения большого числа соединений. Практическая часть Работа № 6 Знакомство с устройством и работой приборов спектрометрического анализа на примере CФ-26

Похожие:

	Учебно-методическое пособие тгту: 2014. 80 с А. Ю. Потлов, С. Г. Проскурин, С. В. Фролов, Методы автоматизированной обработки медико-биологических сигналов и данных. Компьютерный...		Учебно-методическое пособие по самостоятельной работе Специальность... Большой практикум. Раздел «Свободнорадикальные процессы в биологических системах»: Учебно-методическое пособие по самостоятельной...
	Практикум для студентов 1 курса чебоксары, 2009 Данное методическое пособие по биологии «Практикум для 1 курса» составлено в соответствии с действующей рабочей программой для средних...		Учебно-методический материал по физико-химическим основам получения...
	Учебно-методическое пособие Тольятти 2011 удк ббк ахметжанова Г.... Учебно-методическое пособие предназначено для студентов магистров, обучающихся на педагогическом факультете тгу по направлению «Педагогика»....		Учебно-методическое пособие по дисциплине «пропедевтика внутренних болезней» Учебно-методическое пособие предназначено для студентов 3 курса медико-профилактического факультета кгму
	Учебно-методическое пособие дисциплины «Введение в профессию» Учебно-методическое пособие одобрено (рассмотрено) на заседании кафедры «Финансы и кредит»		Учебно-методическое пособие дисциплины «Введение в профессию» Учебно-методическое пособие одобрено (рассмотрено) на заседании кафедры «Финансы и кредит»
	Учебно-методическое пособие по дисциплине «пропедевтика внутренних... Учебно-методическое пособие предназначено для студентов 2-3 курсов лечебного факультета кгму		Учебно-методическое пособие дисциплины «Управление взаимоотношениями с клиентами» Учебно-методическое пособие разработано на основании гос впо по направлению 080200. 62 «Менеджмент» от 20. 05. 2010 №544
	Учебно-методическое пособие по дисциплине «формирование здорового образа жизни у детей» Учебно-методическое пособие предназначено для студентов 1-3 курсов педиатрического факультета кгму		Учебно-методическое пособие по дисциплине «пропедевтика внутренних... Учебно-методическое пособие предназначено для студентов 2-3 курсов педиатрического факультета кгму
	Учебно-методическое пособие Учебно-методическое пособие предназначено для студентов дневной, вечерней и заочной форм обучения		Учебно-методическое пособие для студентов биологических и экологических специальностей Балашов П49 Полевые практики по биологии и экологии : учеб методич пособие для студентов фак-та экологии и биологии / М. А. Занина, С. В....
	Учебно-методический комплекс по «экономической теории» Часть3 «макроэкономика»... «Макроэкономика»: учебно методическое пособие. – Иркутск: Изд-во бгуэп, 2010. – с		Учебно-методическое пособие по дисциплине «финансовые рынки» Учебно-методическое пособие содержит программу курса, методические указания по структуре и содержанию контрольной работы, список...