Практикум по физико-химическим методам в биологии Учебно-методическое пособие
Скачать 0.85 Mb.
|
Цель — изучить устройство и работу флуоресцентного микроскопа ЛОМО. Внимательно прочитайте инструкцию к микроскопу. Внимание! Включение микроскопа производиться только преподавателем. Студенты допускаются к работе с микроскопом только после ознакомления с техникой безопасности. Работа № 9 Исследование прижизненного свечения хлорофилла. Естественным люминофором растений является зеленый пигмент хлорофилл. Хлорофилл имеет темно-красную люминесценцию, что объясняется сопряженной структурой входящего в его состав порфиринового цикла. Цель - наблюдение естественной люминесценции органических соединений. Для работы необходимо: несколько видов растений (хлорелла, элодея, листья сирени, вишни, комнатных растений), иглы, скальпель для препаровки, предметные и покровные стекла, раствор медного купороса. Ход работы: 1 Каплю взвеси одноклеточных водорослей, листок многоклеточного растения (предварительно отпрепарированный) помещают на предметное стекло, прикрывают покровным и помещают на предметный столик. Наблюдение проводят сначала на малом увеличении (объектив x10). Затем, при большом увеличении рассматривают структуру хлоропластов и отмечают особенности свечения различных объектов. Увиденное необходимо зарисовать. 2 Листок многоклеточного растения помещают на предметное стекло на него капают 1-2 капли красителя через 5 минут промывают водой. Наблюдение проводят сначала на малом увеличении (объектив x10). Затем, при большом увеличении рассматривают структуру клеток и отмечают особенности свечения различных объектов. Увиденное необходимо зарисовать. Сделать выводы. Работа № 10 Исследование свечения растворов различных органических соединений. Известно, что различные органические вещества являются естественными люминофорами. Люминесцируют органические молекулы, в состав которых входят чередующееся одинарные и двойные связи между атомами углерода. Химики часто называют эти связи сопряженными, сопряженной именуют и всю структуру этих молекул. Из природных люминесцирующих соединений встречающихся в некоторых растениях, сопряженными структурами обладают витамин А и умбеллиферон. Встречается собственная люминесценция и у некоторых белков (альбумина бычьей сыворотки, белка вируса табачной мозаики, рибонуклеазы). Одним из наиболее ярко флюоресцирующих лекарственных соединений является хинин. В кислых растворах он люминесцирует в синей области (450—475 нм). После экстракции возможна количественная регистрация многих витаминов, например витамина Е, максимум флюоресценции которого лежит в УФ-области при 330 нм. Витамин В6 имеет синюю, а витамин А — зеленую флюоресценцию. Витамины С, D, В12 и др. удается определить по вторичной люминесценции. По собственной люминесценции проводят контроль качества пищевых продуктов. Так, при длительном хранении молока и сливок рибофлавин окисляется в люмихром, что сопровождается изменением цвета флюоресценции от желто-зеленого к синему. Цель - наблюдать свечение растворов различных люминофоров. Для работы необходимо: флуоресцентный микроскоп ЛОМО, концентрированная серная кислота, 1% раствор хинина, витамин А, прокисшее молоко или сливки, дистиллированная вода, мерные цилиндры, чашки Петри или часовые стекла 6 шт. Ход работы: 1 Приготовление рабочих растворов Чашки Петри пронумеровать. В каждую чашку налить 1 мл дистиллированной воды. Затем добавить исследуемые растворы: 1 мл хинина+капля серной кислоты капля витамина А капля прокисшего молока капля свежего молока капля крови+ серная кислота 2 Исследуемые растворы последовательно ставить на предметный столик микроскопа (учитывая спектры свечения и поглощения). Зарисовать цвет увиденного свечения. Сравнить с цветом отраженного света от дистиллированной воды. Сделать выводы. Работа № 11. Знакомство с устройством и работой приборов флуоресцентного анализа на примере флуориметра «Флюорат-02» Цель — изучить устройство и работу флуориметра Внимательно прочитайте инструкцию к флуориметру «Флюорат-02». Внимание! Включение флуориметра производиться только преподавателем. Студенты допускаются к работе с флуориметром только после ознакомления с техникой безопасности. Работа №12 Определение концентрации рибофлавина с помощью флуориметра. Сущность метода основана окислении витамина марганцовокислым калием и измерении интенсивности флуоресценции при длинах, волн 360—480 нм возбуждающего и 510—650 нм излучаемого света. Цель — найти количество рибофлавина в анализируемой пробе. Для работы необходимо: флуориметр, колбы лабораторные стеклянные, водорода перекись 3 %, калий марганцовокислый 3%, серная кислота 93-95%, рибофлавин 0.01 г/л, ледяная уксусная кислота. Ход работы: Приготовление растворов. В колбу 1 наливают по 10 мл исследуемого раствора, в колбу 2 - 10 мл дистиллированной воды. В колбу 3 наливают 10 мл исследуемого раствора + 1 мл рибофлавина 0.01 г/л. Во все колбы добавляют по 1 мл ледяной уксусной кислоты, 0.5 мл раствора марганцовокислого калия, перемешивают и выдерживают 2 минуты. Затем добавляют 0.5 мл перекиси водорода опять перемешивают и выдерживают 5 минут. Затем измеряют интенсивность флуоресценции сначала раствора с добавкой рибофлавина, затем без добавки. Измерения проводят относительно пробы с дистиллированной водой. Обработка результатов Массовую долю витамина В2 вычисляют по формуле 3.3 (см. Главу 1): Сх=Сэт*Sх/(Sх+эт – Sх), где Sх — интенсивность флуоресценции раствора анализируемой пробы, Sэт+х - интенсивность флуоресценции раствора анализируемой пробы с добавкой рибофлавина, Cэт – концентрация рибофлавина в стандартной добавке. Сделать вывод Работа №13 Определение Цель - рассчитать расстояние между двумя Для работы необходимо: калькулятор с логарифмами. Ход работы: Контрольные вопросы 1 Флуоресцентный микроскоп. Устройство, особенности. 2 Использование флуоресцентного метода анализа в биологии и медицине. 3 Особенности свечения неорганических веществ. 4 Особенности свечения органических соединений. 5 Строение флуориметра. 6 История открытия и развития понятия о флуоресценции. 7 Правило Стокса. Виды люминесценции. 8 Что такое флуоресценция? 3 Электрохимические методы анализа Электрохимические методы анализа основаны на измерении и регистрации электрических параметров системы (аналитических сигналов), изменяющихся в результате протекания химических реакций. Электрохимическая система обычно состоит из электрохимической ячейки, представляющей собой единое конструктивное оформление сосуда с исследуемым раствором и электродами. Принята следующая классификация этих методов: 1 Классификация, учитывающая природу источника электрической энергии в системе. Различают две группы методов: – методы без наложения внешнего потенциала. Здесь источник электрической энергии – сама электрохимическая система (гальванический элемент). К таким методам относятся потенциометрические методы. – методы с наложением внешнего потенциала. К ним относятся: кондуктометрия, вольтамперометрия, кулонометрия, электрогравиметрия. 2 Классификация по способу применения. Различают прямые и косвенные методы. – прямые методы. Измеряют аналитический сигнал как функцию концентрации раствора и по показаниям прибора находят содержание вещества в растворе (Прямая потенциометрия, прямая кондуктометрия и т. д.). – косвенные методы – это методы титрования, в которых окончание титрования фиксируют на основании измерения электрических параметров системы (кондуктометрическое, амперометрическое титрование и т. д.). Развитию и усовершенствованию электрохимических методов анализа способствовали успехи в области электрохимии и приборостроении. Различия между электрохимическими методами анализа в основном обусловлены природой электродов и измерительными приборами. 3.1 Кондуктометрия Основатель этого метода – немецкий физик Кольрауш, который впервые в 1885 г. предложил уравнение зависимости электропроводности растворов сильных электролитов от концентрации. Электропроводность растворов обусловлена диссоциацией растворенного вещества и миграции образующихся ионов под действием внешнего источника напряжения. Движущиеся ионы в поле электрического тока испытывают тормозящее действие со стороны молекул растворителя – релаксационный эффект – и со стороны противоположно заряженных ионов –электрофоретический эффект. В результате этих торможений раствор оказывает сопротивление прохождению электрического тока. То есть электропроводность (W) – это величина обратная сопротивлению: W = 1/ R, сименс ( См = Ом-1 , обратный Ом). Зависимость электропроводности от концентрации выражается уравнением W = K S c U/ L, (8) где K – коэффициент пропорциональности; S – площадь электродов; с – концентрация ионов; U – подвижность ионов; L – расстояние между электродами. Для данной пары электродов при S, L = const получим: W = K c U (9) Различают удельную (æ, каппа) и эквивалентную электропроводность (λ). Удельная электропроводность (æ) – это электропроводность 1 см3 раствора, находящегося между электродами площадью 1 см2 каждый, расположенными на расстоянии 1 см друг от друга. Размерность: См/м. Эквивалентная электропроводность (λ) – это электропроводность 1 н раствора электролита, измеренная при расстоянии L = 1 см. Размерность: См*г*экв-1*см2. Зависимость æ и λ выражается уравнением н=λ 1000 æ, (10) где н – нормальная концентрация. Таким образом, в кондуктометрии аналитическим сигналом является электропроводность. Различают: прямую кондуктометрию и кондуктометрическое титрование. Прямая кондуктометрия Измеряют электропроводность исследуемого раствора и по градуировочному графику, построенному в тех же условиях для стандартных растворов, определяют концентрацию исследуемого раствора. Метод нашел ограниченное применение, так как он неселективен, т. е. электропроводность – величина аддитивная, обусловленная присутствием всех ионов. Тем не менее, метод используется для непрерывного контроля производства: качества пищевых продуктов, определения влажности различных материалов (бумаги, газов, зерна, текстильных материалов) и широко применяется для определения общего солевого состава воды (речной, минеральной, дистиллированной); для определения растворимости малорастворимых электролитов; определения констант диссоциации электролитов в том числе комплексных соединений (Кн). Нередко его сочетают с другими методами, такими как потенциометрия, рефрактометрия, хроматография. Однако сложности зависимости электропроводимости от концентрации существенно отражаются на этом методе. С ростом концентрации электропроводность вначале растет, а при более высоких концентрациях (> 3 н) резко уменьшается. Этот метод применим для анализа разбавленных растворов. Кондуктометрическое титрование Точку эквивалентности определяют по резкому излому кривой зависимости электропроводности от объема титранта. При этом могут быть использованы все типы реакций (нейтрализации, осаждения, комплексообразования), при которых достаточно резко изменяется электропроводность. Для получения резкого излома на кривой титрования следует учитывать эффект разбавления. Его сводят к минимуму, титрованием больших объемов (100 см3) исследуемого вещества концентрированным раствором титранта из микробюретки (2 – 5 см3). Для получения надежных результатов следует учитывать различные факторы, влияющие на электропроводность (константа диссоциации, подвижность ионов, ионная сила раствора и т. д.). При правильном подборе титранта и растворителя создают благоприятные условия кондуктометрического титрования. Достоинства: возможность раздельного определения смесей кислот и оснований, титрование мутных и окрашенных растворов при точности 2 %. 3.2.Кулонометрия Высокую чувствительность и точность анализа обеспечивают методы прямой кулонометрии и кулонометрического титрования. В основе метода – определение концентрации исследуемого вещества путем регистрации количества электричества, затраченного на электролиз вещества при потенциале электрода, равном потенциалу выделения анализируемого вещества. В соответствии с объединенным законом М. Фарадея масса (m, г) и количество электричества (Q, кулон) находятся в зависимости, выраженной уравнением m = Q n M F, (11) где M – молярная масса вещества, г/моль; n – число электронов, участвующих в реакции; F – число Фарадея, равное 96487 Кл/моль. Кулонометрический анализ проводится как при контролируемом потенциале рабочего электрода, так и при контролируемом токе прошедшего через электролитическую ячейку. При этом важно, чтобы все электричество тратилось на основной электрохимический процесс, и более точно проводить определение количества электричества (Q). 3.3 Потенциометрия Метод известен с 90-х гг. XIX в., однако признан как аналитический метод анализа только в 20-х гг. XX в. Потенциометрический метод, основанный на измерении электродвижущих сил (ЭДС) обратимых гальванических элементов, используют для определения содержания веществ в растворе и измерения различных физико–химических величин. В потенциометрии обычно применяют гальванический элемент, включающий два электрода, которые могут быть погружены в один и тот же раствор (элемент без переноса) или в два различных по составу раствора, имеющих между собой жидкостной контакт (цепь с переносом). Электрод, потенциал которого зависит от активности (концентрации) определяемых ионов в растворе, называется индикаторным. Для измерения потенциала индикаторного электрода в раствор погружают второй электрод, потенциал которого не зависит от концентрации определяемых ионов. Такой электрод называется электродом сравнения. Величину ЭДС можно рассчитать по разности потенциалов этих электродов. Зависимость величины электродного потенциала (ЭП) от активности ионов в растворе выражается уравнением Нернста E = E0 + (R T/ nF) ln a(c f), (12.1) где Е0 – стандартный электродный потенциал; R – универсальная газовая постоянная ( R = 8.314Дж/мольК); Т – абсолютная температура; n – число электронов (е), участвующих в реакции; c – концентрация, моль/дм3; f – коэффициент активности. Так как в потенциометрии используются разбавленные растворы, где f=1, то активность (а) заменяют на концентрацию (с). Если перейти от ln к lg, то при T = 298 K (25 °С) уравнение (12.1) запишется так: E = E0 + 0,059 nlg c (12.2) Электроды В потенциометрическом методе анализа используют два основных класса электродов: – электроды, на межфазных границах которых протекают реакции с участием электронов, так называемые электронообменные (электроды первого, второго рода и окислительно-восстановительные); – электроды, на межфазных границах которых протекают ионообменные реакции. Такие электроды называют мембранными, или ионообменными, их называют также ионоселективными. Обратимые электроды – электроды, у которых скачки потенциалов зависят от концентрации в соответствии с термодинамическими уравнениями. На обратимых электродах быстро устанавливается равновесие, и скачки потенциалов остаются неизменными во времени. При прохождении электрического тока скачки потенциалов не должны значительно изменяться; а после выключения тока быстро должно устанавливаться равновесие. Электроды, не удовлетворяющие этим требованиям, называются необратимыми. В потенциометрии используют обратимые электроды. Электроды I рода – электроды, находящиеся в равновесии с катионами, одноименными с металлом, и обратимые по отношению к ним. Простейший электронообменный электрод – металлическая пластинка, погруженная в раствор или расплав электролита Zn/Zn2+; Cu/Cu2+ и т. д. В качестве электрода сравнения используют стандартный водородный электрод (СВЭ) –электрод I рода – Pt(H2)/2H+. Его потенциал определяется величиной pH и при комнатной температуре равен: E = E0 + 0,059lg[H+ ] = −0,059pH (12.3) Стандартный водородный электрод (СВЭ) неудобен в работе, его заменяют электродами II рода – насыщенным каломельным электродом (н.к.э.) и хлорсеребряным (х.с.э.). Электроды II рода – электроды, состоящие из металлической пластинки, покрытой малорастворимой солью этого металла, и обратимые по отношению к анионам соли. Ag +/AgCl /Cl- Hg /Hg Cl /Cl− х.с.э. н.к.э. Концентрация Cl− поддерживается на определенном уровне путем добавления раствора хорошо растворимой соли с тем же анионом (чаще KCl). Отличительной особенностью электродов сравнения, применяемых в аналитической практике, является простота изготовления (доступность), воспроизводимость потенциала и низкий температурный коэффициент. Этим требованиям отвечают х.с.э. и н.к.э. Хлорсеребряный электрод ( х.с.э.) – электрод, чувствительный к анионам Cl−, которые образуют осадки с катионами металла электрода (Ag+). Он представляет собой серебряную проволоку, покрытую равномерным слоем AgCl, который хорошо проводит электрический ток. Проволоку погружают в насыщенный раствор КСl. В растворе устанавливается равновесие AgCl(тв) + e → Ag(тв) + Cl− , т.е. его потенциал определяется концентрацией Cl− – ионов. Потенциал данного хлорсеребряного электрода равен +0.201 В. При концентрации КСl 0.1 н он равен +0.29 В, а при 1.0 н – 0.24 В. Насыщенный каломельный электрод ( н.к.э.) изготовлен на основе металлической ртути и каломели Hg2Cl2.Электрохимическое уравнение, характеризующее поведение электрода, описывается полуреакцией Hg 2 Cl2 + 2e → 2Hg + 2Cl− . Так же, как и в случае х.с.э. потенциал зависит от концентрации Cl− –ионов. При использовании в качестве электролита насыщенного раствора КСl, потенциал электрода равен +0.244 В. Для 1 н раствора KCl E = 0.280 В; для 0.1 – 0.334 В. Ионоселективные электроды – это электроды, обратимые по катионам или анионам, сорбируемыми твердой или жидкой мембраной. Они делятся на группы: – стеклянные электроды; – твердые электроды с гомогенной или гетерогенной мембраной; – жидкостные электроды (на основе ионных ассоциативов, хелатов металлов или нейтральных лигандов); – газовые электроды; – электроды для измерения активности (концентрации) биологических веществ. Мембранные электроды имеют форму пластинок из ионообменного материала, контактирующих с двумя растворами электролита МХ1(с1)/мембрана/ МХ2(с2). Среди ионоселективных электродов наибольшее применение получил стеклянный электрод, предназначенный для измерения рН. Стеклянный электрод – это несколько условное название несложной системы, включающей небольшой сосуд из изолирующего стекла, к нижней части которого припаян шарик из специального электродного стекла. Такой электрод снабжен токоотводом. В качестве внутреннего стандартного раствора в стеклянном электроде используют 0,1 М раствор хлористоводородной кислоты обычно с добавкой хлорида натрия и калия. Можно использовать также какой-либо буферный раствор с добавкой хлоридов или бромидов. Токоотводом служит хлорсеребряный электрод, представляющий собой серебряную проволоку, покрытую хлоридом серебра. К токоотводу припаивают изолированный, экранированный провод. Стеклянный электрод обычно используют в паре с хлорсеребряным электродом сравнения. Применяемую при этом электрохимическую цепь можно записать следующим образом: Ag, AgCl/ HCl(0,1M)// стекло// исследуемый раствор// KClнас /AgCl, Ag стеклянный электрод хлорсеребряный электрод Потенциал стеклянного электрода обусловлен обменом ионов щелочных металлов, находящихся в стекле с ионами водорода из раствора. Энергетическое состояние ионов в стекле и растворе различно. Это приводит к тому, что ионы водорода так распределяются между стеклом и раствором, что поверхности этих фаз приобретают противоположные заряды между стеклом и раствором возникает разность потенциалов, значение которой зависит от рН раствора. В лабораторной практике стеклянные электроды применяют, как правило, для измерения рН. Перед началом работы стеклянные электроды следует выдержать некоторое время в 0.1 М растворе НСl. Ни в коем случае нельзя вытирать стеклянный шарик, так как это может разрушить гелиевую поверхность электрода. Категорически запрещается царапать поверхность электрода острыми предметами, так как толщина стеклянного шарика составляет десятые доли миллиметра и это выведет из строя чувствительный элемент. |
Похожие:
 | Учебно-методическое пособие тгту: 2014. 80 с А. Ю. Потлов, С. Г. Проскурин, С. В. Фролов, Методы автоматизированной обработки медико-биологических сигналов и данных. Компьютерный... | | Учебно-методическое пособие по самостоятельной работе Специальность... Большой практикум. Раздел «Свободнорадикальные процессы в биологических системах»: Учебно-методическое пособие по самостоятельной... |
| Практикум для студентов 1 курса чебоксары, 2009 Данное методическое пособие по биологии «Практикум для 1 курса» составлено в соответствии с действующей рабочей программой для средних... | | Учебно-методический материал по физико-химическим основам получения... |
| Учебно-методическое пособие Тольятти 2011 удк ббк ахметжанова Г.... Учебно-методическое пособие предназначено для студентов магистров, обучающихся на педагогическом факультете тгу по направлению «Педагогика».... | | Учебно-методическое пособие по дисциплине «пропедевтика внутренних болезней» Учебно-методическое пособие предназначено для студентов 3 курса медико-профилактического факультета кгму |
| Учебно-методическое пособие дисциплины «Введение в профессию» Учебно-методическое пособие одобрено (рассмотрено) на заседании кафедры «Финансы и кредит» | | Учебно-методическое пособие дисциплины «Введение в профессию» Учебно-методическое пособие одобрено (рассмотрено) на заседании кафедры «Финансы и кредит» |
| Учебно-методическое пособие по дисциплине «пропедевтика внутренних... Учебно-методическое пособие предназначено для студентов 2-3 курсов лечебного факультета кгму | | Учебно-методическое пособие дисциплины «Управление взаимоотношениями с клиентами» Учебно-методическое пособие разработано на основании гос впо по направлению 080200. 62 «Менеджмент» от 20. 05. 2010 №544 |
| Учебно-методическое пособие по дисциплине «формирование здорового образа жизни у детей» Учебно-методическое пособие предназначено для студентов 1-3 курсов педиатрического факультета кгму | | Учебно-методическое пособие по дисциплине «пропедевтика внутренних... Учебно-методическое пособие предназначено для студентов 2-3 курсов педиатрического факультета кгму |
| Учебно-методическое пособие Учебно-методическое пособие предназначено для студентов дневной, вечерней и заочной форм обучения | | Учебно-методическое пособие для студентов биологических и экологических специальностей Балашов П49 Полевые практики по биологии и экологии : учеб методич пособие для студентов фак-та экологии и биологии / М. А. Занина, С. В.... |
| Учебно-методический комплекс по «экономической теории» Часть3 «макроэкономика»... «Макроэкономика»: учебно методическое пособие. – Иркутск: Изд-во бгуэп, 2010. – с | | Учебно-методическое пособие по дисциплине «финансовые рынки» Учебно-методическое пособие содержит программу курса, методические указания по структуре и содержанию контрольной работы, список... |
