Глава 7 Разработка проекта технического задания для проведения последующих ОТР на тему: «Комплекс антиоксидантах витаминов и аминокислот для профилактики и терапии опухолевых заболеваний шейки матки»
Проект технического задания для проведения последующих ОТР на тему: «Комплекс антиоксидантах витаминов и аминокислот для профилактики и терапии опухолевых заболеваний шейки матки» представлен в виде отдельного документа в составе отчетной документации
Глава 8 Подведение итогов рандомизированного контролируемого испытания эффективности комплексной терапии, включающей препараты – антиоксиданты в профилактике развития канцерогенеза у клинически здоровых женщин с риском развития рака шейки матки (диагностированная ВПЧ инфекция) и женщин с предраковыми заболеваниями шейки матки (по данным количественного ПЦР анализа и гистологическим исследованиям) (через 6 месяцев)
В качестве препарата-антиоксиданта апробирован «Immugen» IDIFARMACEUTICIS.p.A. (Италия), который является одной из последних разработок в области комбинаций антиоксидантов и аминокислот и представляет собой уникальный комплекс оптимально сочетающихся компонентов [27-31]. Препарат состоит из убихинона, витамина Е (альфа-токоферол-ацетат), фосфолипидов сои (лецитин), альфа-метионина и селена. Метионин и селен обладают антиоксидантными свойствами, снижая разрушающее действие свободных радикалов. КоэнзимQ усиливает метаболические процессы и ускоряет ранозаживление, снижает интоксикацию, улучшает общую сопротивляемость организма, является одним из основных веществ, активно противостоящих процессам старения. Фосфолипиды сои и витамин Е дополняют комплекс за счет выраженных антисклеротических и противораковых свойств. Показано эффективное действие препарата при некоторых вирусных инфекциях, папилломатозе кожи, атопическом дерматите, гнойно-воспалительных процессах мягких тканей [28-31].
Материалы и методы. В исследование были включены 250 пациенток, стратифицированных по патологии:
1 группа – 152 клинически здоровые женщины с выявленным ВПЧ высокого онкогенного риска в возрасте 25–45 лет;
2 группа – 98 пациенток с предраковыми заболеваниями шейки матки в возрасте 25–52 лет.
Все пациентки предоставили подробную информацию об имевшихся ранее случаях заболеваний, передающихся половым путем. У всех пациенток был проведен тщательный осмотр промежности, вульвы, влагалища, уретры и канала шейки матки.
Разделение участников исследования. Каждая из женщин-участниц рандомизированного исследования эффективности подключения препаратов антиоксидантов в профилактике развития канцерогенеза подписала подтверждение согласия на участие. После стратификации пациентов по патологии (см. схему 8) они были распределены случайным образом (двойное слепое рандомизированное исследование) в опытную группу или в плацебо-группу:
группа «Immugen 1» – 82 клинически здоровые женщины с выявленным ВПЧ высокого онкогенного риска в опытной группе;
группа «Плацебо 1» - 70 клинически здоровых женщин с выявленным ВПЧ высокого онкогенного риска.
группа«Immugen 2»– 50 пациенток с предраковыми заболеваниями шейки матки в опытной группе;
группа «Плацебо 2» - 48 женщин с предраковыми заболеваниями шейки матки.
Схема 8 – Разделение пациенток с риском развития рака шейки матки
(диагностированная ВПЧ-инфекция) и женщин с предраковыми
заболеваниями шейки матки в испытании эффективности
подключения препаратов-антиоксидантов.
Комплексная терапия пациенток из группы «Плацебо 1» включала «Виферон» №2 два раза в день внутри влагалищно в течение 7 дней в сочетании с индукторами интерферона (амиксин, ридостин, циклоферон). [1,11,18]. Комплексная терапия пациенток из группы «Плацебо 2» включала при большой площади поражения метод эксцизии или деструкции, в сочетании с противовирусной и иммуномодулирующей терапией (изопринозин 1000мг, 3 раза в стуки, 10 дней, свечи «Виферон» №2 два раза в день внутри влагалищнов течение 10 дней в сочетании с индукторами интерферона (амиксин, ридостин, циклоферон) [1,11,18].
В группах «Immugen 1» и «Immugen 2» дополнительно к стандартной терапии соответствующей группы добавлялся препарат Immugen по 2 капсулы 3 раза в день во время еды в течение 3 месяцев [28-31]. При оценке переносимости препарата Immugen проводился мониторинг и регистрация любых эпизодов (как общих, так и местных), которые могут быть связаны или не связаны с применением препарата. На каждую женщину, участвующую в исследовании, была заведена и тщательно заполнялась «Индивидуальная регистрационная карта» для учета общих и местных реакций. В исследование не включались больные, подвергнутые ранее любому виду противовирусной и противоопухолевой терапии, и пациентки, имеющие серьезные сопутствующие заболевания других систем организма.
В группу контроля вошли 30 здоровых доноров, не имеющих антител к ВПЧ, ВПГ-1, ВПГ-2, ЦМВ в сыворотке крови и не содержащих ДНК ВПЧ, ВПГ, ЦМВ и других инфекций, передающихся половым путем в половом тракте.
Расширенная кольпоскопия проводилась с помощью кольпоскопа «Leisegang» (Германия) при увеличении в 15 раз с целью выявления и конкретизации изменений эпителиального покрова шейки матки, для документирования кольпоскопических картин использовалась видеоприставка. При оценке кольпоскопических картин использовалась международная терминология кольпоскопических терминов, принятая в 1990 г. на Всемирном конгрессе по патологии шейки матки и кольпоскопии в Риме и обновленную Международной ассоциацией по патологии шейки матки кольпоскопии в Барселоне в 2003 г. Цитологическое исследование мазков с экзо- и эндоцервикса проводилось по Папаниколау (Pap-smear-test). Изучение гистологических материалов проводилось путем создания серии срезов, окрашивания и микроскопии.
Метод качественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) для определения ДНК вирусов группы ВПЧ 16, 18, 31, 33, 35,45 проводился по следующей методике: соскоб эпителиальных клеток из цервикального канала и эктоцервикса отправлялся в лабораторию, где с помощью праймеров, позволяющих амплифицировать фрагмент ДНК всех серотипов вируса отбирались образцы, в которых был выявлен HPV. Реакцию амплификации проводили в объеме 25 мкл. В реакционную смесь последовательно вносили деионизованную воду до объема 2,5 мкл 10-кратного буфера для ПЦР (660 мМ трис-HCL, рH - 8,8; 166мМ сульфата аммония, 0,1% твин – 20, 0,001% желатин, 30 мМ хлористого магния) по 250 мкМ каждого дНТФ, по 1 пМ праймеров и 0,8 акт. единиц Тaq - полимеразы, 5 мкл рас-ра ДНК, 30 мкл минерального масла. Для положительного контроля вносили 1-5 пг ДНК HPV. Реакция проводилась в течение 35 циклов на амплификаторе Biorad при 940 С – 30 с, 600 С – 20 с, 720 С – 30 с. Продукты реакции анализировали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле.
Для определения количественного содержания геномных эквивалентов проводили ПЦР в реальном времени. В исследовании использована отечественная тест-система «Амплисенс ВПЧ ВКР скрин-титр FRT». Набор реагентов «Амплисенс ВПЧ ВКР скрин-титр FRT» позволял обнаружить ДНК ВПЧ двух основных филогенетических групп – А7 (18, 39, 45, 59 типы) и А9 (16, 31, 33, 35, 52, 58 типы), а также ДНК ВПЧ 51 (группа А5) и 56 (группа А6) типов. Результат рассчитывали в геномных эквивалентах на 105 клеток. Вирусная нагрузка менее 3 lg считалась клинически малозначимой, т.к. ассоциирована с минимальным риском их развития [39]. При вирусной нагрузке от 3 до 5 lg данные считались значимыми. При обнаружении количество вируса более 105 геномных эквивалентов, приходящихся на 105 клеток человека при установленном факте персистентного течения ВПЧ-инфекции (ВПЧ выявляется более 1 года) вирусная нагрузка считалась высокозначимой (клинически высокозначимые данные) [39]. Анализ данных проводили автоматически с использованием программного обеспечения в формате MS Excel («Microsoft», USA), Statistica 9 EN («StatSoft», USA).
Полученные клинические и лабораторные данные заносились в карты клинического наблюдения пациенток и обрабатывались статистически с применением современных методов статистического анализа медицинских исследований с использование пакета статистических программ Microsoft. Достоверность различий между группами оценивали с помощью критерия Уилкоксона для связанных величин и U-теста или t-критерия Стьюдента для несвязанных величин. Достоверным считали отличие при p<0,05. Проверки выборки на нормальность распределения проводилась по критерию согласия Пирсона хи-квадрат. В таблицах и на графиках приведены среднеарифметические значения показателей, в качестве разброса указаны среднеквадратичные отклонения.
Частота встречаемости различных генотипов ВПЧ в исследованных группах пациентов показала, что в группах Плацебо 1,2 и Immugen 1,2 распределение по генотипам ВПЧ практически не отличалось, ведущая роль в инфицировании популяции принадлежит 16,18 типам ВПЧ (рисунки 2,3).
 Рисунок 2 - Распределение генотипов ВПЧ в группах
Плацебо 1 и Immugen 1, %.
 Рисунок 3 - Распределение генотипов ВПЧ
в группах Плацебо 2 и Immugen 2, %.
Таблица 4 - Средний логарифм вирусной нагрузки на 105 клеток в группах пациенток Плацебо 1,2 и Immugen 1,2 (в зависимости от вида комплексной терапии).
группа
|
N, (число больных)
|
Средний логарифм вирусной нагрузки на 105 клеток
|
Достоверность различий р между показателями до начала терапии и показателями спустя 6 месяцев
|
До начала терапии
|
Через 6 месяцев
|
Плацебо 1
|
70
|
4,6±0,6
|
3,7±0,4
|
р=0,057
|
Плацебо 2
|
48
|
5,4±0,5
|
4,5±0,4
|
р=0,061
|
Immugen 1
|
82
|
4,6±0,5
|
2,8±0,41
|
р=0,031
|
Immugen2
|
50
|
5,6±0,6
|
3,0±0,51
|
р=0,034
|
1 – достоверность p<0,05 по сравнению с предыдущим периодом исследований.
Данные по изменению вирусной нагрузки в зависимости от проводимой терапии, представлены в таблице 4. Достоверно значимое снижение вирусной нагрузки произошло только при подключении в комплексную терапию препарата Immugen, что в соответствии с другими источниками [30] доказывает возможность применения этого препарата при различных вирусных заболеваниях.
Гистологический контроль тканей, взятых при кольпоскопии (через 6 месяцев).
При исследовании групп женщин Плацебо 1 и Immugen 1 (клинически здоровые женщины с выявленными ВПЧ высокого онкогенного риска), то есть без выявленной патологии генитальной системы, биопсия не проводилась. Участницы рандомизированного исследования прошли гинекологический осмотр и кольпоскопию, в результате которой у 1 (1,2 %) женщины из группы Immugen 1 (через 6 месяцев) были признаки кандидоза, у 2 (2,8 %) женщины из группы Плацебо 1 были выявлены признаки неспецифического кольпита.
До начала терапии пациентки из группы Плацебо 2 с предраковыми заболеваниями шейки матки прошли гинекологический осмотр, кольпоскопическое исследование и по показаниям было проведено гистологическое исследование биоптатов шейки матки. Наиболее частым гистологическим признаком диагнозом был койлоцитоз (см. таблица 5). Достаточно часто обнаруживались утолщение многослойного плоского эпителия (45,8 %) и гиперкератоз (39,6 %). Практически у любой женщины (47 из 50 пациенток в группе Immugen 2 и 47 из 48 женщин в группе Плацебо 2) встречалось сочетание 2 и более признаков патологии при гистологическом анализе. При цитологическом исследовании в 100 % случаев выявлялся воспалительный тип мазка.
Таблица 5 – Частота встречаемости различных гистологических диагнозов
в группе пациенток с предраковыми заболевания шейки матки при первичном обследовании до начала комплексной терапии.
Гистологическое заключение (диагноз)
|
Группа Плацебо 2 (n=48)
|
Группа Immugen 2
(n=50)
|
Койлоцитоз
|
72,9 % (35 пациенток)
|
76,0 % (38 пациенток)
|
Утолщение многослойного плоского эпителия
|
45,8 % (22 пациентки)
|
52,0 % (26 пациентки)
|
Гиперкератоз, паракератоз
|
39,6 % (19 пациенток)
|
40,0 % (20 пациенток)
|
CIN I
|
31,2 % (15 пациенток)
|
32,0 % (16 пациенток)
|
CIN II
|
10,4 % (5 пациенток)
|
80 % (4 пациенток)
|
Сочетание 2 и более признаков патологии
при гистологическом анализе
|
97,9 % (47 пациенток)
|
94,0 % (47 пациенток)
|
На фоне комплексной терапии после эксцизии пораженного участка и дальнейшей терапии применением антиоксидантного препарата Immugen через 6 месяцев обнаружено улучшение состояния ткани шейки матки, что выявлялось в постановке диагноза «вариант нормы» в 100 % случаев, в связи с чем повторный гистологический анализ со взятием биоптата не проводился. При цитологическом исследовании воспалительный тип мазка был выявлен в 32,0 % случаев (16 женщин).
В группе Плацебо 2 в 2 % случаев (1 пациентка) был обнаружен койлоцитоз, в 6% (3 пациентки) утолещение многослойного эпителия. При цитологическом исследовании воспалительный тип мазка был выявлен в 39,6% случаев (19 женщин).
Таким образом, в соответствии с целью исследования в результате проведенной работы был решен ряд теоретических и практических задач по изучению аспектов оптимизации терапии пациенток с предраковой патологией шейки матки с помощью препаратов антиоксидантов. Оптимальным в терапии вирус-ассоциированных заболеваний, таких как предраковые и раковые заболевания шейки матки является наличие комбинированного антиоксидантного и противовирусного эффекта. Преимуществом от всех известных аналогов является также возможность применения данного метода до формирования патологических процессов в тканях, что дает возможность врачам назначить профилактический курс и предотвратить развитие рака шейки матки при выявленной предрасположенности или при наличии факторов риска.
|
