Отчет о научно-исследовательской работе разработка методов оценки риска, прогнозирования течения и профилактики папилломавирус-ассоциированного канцерогенеза
Скачать 4.96 Mb.
|
Глава 6 Создание модели для контроля эффективности препаратов антиоксидантов в комплексной терапии женщин с риском развития опухолевых заболеваний, предопухолевыми заболеваниями шейки матки и преинвазивным раком шейки матки путем определения в тканях биоптата шейки матки пероксининитритаИзвестно, что при хронических вирусных и бактериальных инфекциях в ответ на длительный контакт с инфекционным агентом происходит формирование пула праймированных макрофагов, продуцирующих повышенные количества свободных радикалов кислорода и азота [38]. В литературе описаны факты корреляции радикалообразования и онкогенеза в разных тканях [39]. Однако большая часть исследований касается изучения процессов радикалообразования клетками крови [38,39], в тоже время оптимальным было бы исследование радикалообразования непосредственно в тканях шейки матки (ШМ). В связи с этим на 2 этапе НИР нами были исследованы концентрации нитрат-нитритов (стабильных продуктов оксида азота, преоксинитрита) в тканях пациенток исследуемых групп: клинически здоровых женщин, но инфицированных ВПЧ высокого онкогенного риска; женщин с предраковыми и раковыми заболеваниями ШМ (см. отчет по второму этапу НИР). Нами было доказано, что концентрации нитрат-нитритов коррелируют с тяжестью поражения ткани шейки матки и, следовательно, могут служить дополнительным критерием как в диагностике, так и в мониторинге эффективности терапии женщин с риском развития канцрогенеза ШМ, предраковыми или раковыми заболеваниями ШМ. Пероксинитрит – анион, имеющий формулу ONOO−. Он образуется в результате реакции перекиси водорода с нитрит-ионом [40]:  (5)Пероксинитрит является сильным окислителем. Благодаря своим свойствам он способен вызывать повреждения широкого спектра молекул в клетке, в том числе ДНК и белков. Образование пероксинитрита in vivo происходит в результате взаимодействия супероксид-иона и оксида азота:  (6)Так как пероксинитрит является короткоживущим анионом, о его возможной концентрации судили по суммарной концентрации стабильных метаболитов нитратов и нитритов в ткани биоптата (мкМ) спектрофотометрически с использованием реактива Гриса (Nitrate/Nitrite Colorimetric Assay Kit) (Cayman, USA). Для этого в каждую пробу добавляли разбавленную в два раза буфером (Аssay buffer) гомогенизированную ткань, 10 мкл энзимного кофактора и 10 мкл нитрат-редуктазы. Инкубировали 1 час при комнатной температуре и вносили 50 мкл реактива Гриса R1 и 50 мкл реактива Гриса R2. Инкубировали 10 минут при комнатной температуре, измеряли оптическую плотность при 540 нм. Требования к биоптатам: для исследования могут использоваться свежие или замороженные ткани. Размер ткани должен был быть 3-4 мм. Замороженный биоптат хранили при температуре -200С не более 3 месяцев. Повторное замораживание было не допустимо. Критерии оценки были выведены из полученных ранее концентраций нитрат-нитритов при исследовании женщин из разных групп (рисунок 1).  NO2/NO3, мкМ/мг         Рисунок 1 – Концентрация нитрат-нитритов (мкМ/мг) в тканях биоптатов шейки матки женщин с диагностированной папилломавирусной инфекцией разного онкогенного риска, с предраковыми заболеваниями шейки матки, с раком шейки матки. Концентрации нитрат-нитритов в пределах 8-14 мкМ/мг характерны для нормальных тканей (биоптаты ШМ здоровых женщин). При исследовании эффективности комплексной терапии проводилось исследование с разницей в 6 месяцев (до и после проведенной терапии) (схема 7). Исследование концентраций нитрат-нитритов биоптаты шейки матки до начала терапии  Назначение комплексной терапии  Повторное исследование концентраций нитрат-нитритов биоптаты шейки матки после проведено терапии терапии 6 месяцев    Достоверно значимое снижение показателей нитрат-нитритов в биоптатах шейки матки, нормализация Достоверно значимое снижение показателей нитрат-нитритов в биоптатах шейки матки, нормализация пока не достигнута Нет достоверных изменений показателей нитрат-нитритов в биоптатах шейки матки    Терапия эффективна Терапия недостаточна эффективна, требуется увеличение длительности приема Терапия не эффективна, требуется подбор другого препарата Схема 7 - Модель для контроля эффективности препаратов антиоксидантов в комплексной терапии женщин с риском развития опухолевых заболеваний, предопухолевыми заболеваниями шейки матки и преинвазивным раком шейки матки путем определения в тканях биоптата шейки матки пероксининитрита. Необходимое оборудование
Реактивы:
Материал для исследования – биоптаты. Требования к материалам - для исследования могут использоваться свежие или замороженные ткани. Размер ткани должен был быть 3-4 мм. Замороженный биоптат хранили при температуре -200С не более 3 месяцев. Повторное замораживание было не допустимо. Методы исследования и последовательность диагностических мероприятий 1. Получение гомогенатов. Образец ткани (биоптат) тщательно отмывали от эритроцитов (в 0,9% NaCl) . К образцу весом 1-3 мг добавляли 600 мкл К-фосфатного буфера и растирали в ручном гомогенизаторе Поттера до получение однородной суспензии. Гомогенат центрифугировали в течение 30 минут при 900g (3000 об/мин, центрифуга ОПН-3 без охлаждения) и для дальнейших анализов отбирали прозрачный супернатант. 2. Оценка содержания белка по Лоури. Для оценки содержания белка в супернатанте гомогената использовали метод Лоури, в качестве калибратора использовали бычий сывороточный альбумин (БСА, Sigma). К 20 мкл образца добавляли 180 мкл воды, инкубировали в течение 10 минут с 1 мл реактива Лоури, а затем добавляли 100 мкл реактива Фолина (1:1). Через 40 минут измеряли поглощение пробы при 750 нм. 3. Оценка содержания нитратов и нитритов. 80 мкл образца вносили в лунку 96-луночного планшета, затем вносили по 10 мкл раствора нитрат-редуктазы и кофактора и инкубировали смесь при комнатной температуре в течение 2 часов. По окончании инкубации в каждую лунку добавляли 50 мкл реактива Грисса (А), аккуратно перемешивали и через 5 минут вносили 50 мкл реактива Грисса (Б). Смесь перемешивали, оставляли на 10 минут при комнатной температуре и затем измеряли поглощение при 540 нм. Для расчета концентрации нитратов и нитритов использовали калибровочную кривую, полученную по той же схеме с использованием раствора нитрата. Для проведения измерений применяли набор “Nitrate/nitrite Assay Kit Colorimetric” Sigma (23479). Критерии оценки: Концентрации нитрат-нитритов в пределах 8-14 мкМ/мг характерны для нормальных тканей (биоптаты ШМ здоровых женщин). В группу среднего риска входят пациентки в случае содержания нитратов и нитритов в гомогенатах тканей биоптатов от 30,0±10,0 до 120,0±10,0 микромоль/г белка. В группу высокого риска входят пациентки в случае содержания нитратов и нитритов в гомогенатах тканей биоптатов >120,0±10,0 микромоль/г белка. Критерий оценки эффективности терапии препаратами антиоксидантами (см. схему 7):
|
Похожие:
 | Отчет о научно-исследовательской работе «Разработка методов оценки... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования | | Отчет о научно-исследовательской работе «Разработка методов оценки... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования |
| Отчет о научно-исследовательской работе разработка методов макроэкономической... «Разработка методов макроэкономической оценки расходов федерального бюджета», шифр темы 0111-03-09 | | Отчет о научно исследовательской работе план ниокр фонда социального... «Разработка Концепции оценки профессионального риска причинения вреда жизни и здоровью работника с учётом индивидуально накопленной... |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... «Разработка новых методов индивидуальной коррекции сводно-радикального статуса при бактериальных инфекциях» | | Отчет №3 о научно-исследовательской работе по теме: «Грид-технологии» Разработка методов эффективного решения задач обработки, хранения, передачи и защиты информации |
| Отчет о научно-исследовательской работе по теме «Разработка принципов... «Российский научно-исследовательский институт культурного и природного наследия имени Д. С. Лихачева» | | Отчет о научно-исследовательской работе Гост 32-2001. Межгосударственный стандарт. Система стандартов по информации, библиотечному и издательскому делу. Отчет о научно-исследовательской... |
| Отчет о научно-исследовательской работе Межгосударственный стандарт (гост 32-2001). Отчет о научно-исследовательской работе. Структура и правила оформления (редакция 2005... |  | Общие положения отчет Отчет о научно-исследовательской работе (нир) документ, который содержит систематизированные данные о научно-исследовательской работе,... |
| Отчет о научно-исследовательской работе Разработка критериев оценки качества очистки внутренних поверхностей трубопроводов систем теплоснабжения жилого фонда г. Красноярска... | | Отчет о научно-исследовательской работе по программе фундаментальных... Институт химии твердого тела и механохимии Сибирского Отделения Российской академии наук |
| Отчет о научно-исследовательской работе Анализ возможности использования международных стандартов оценки при разработке российских федеральных стандартов оценки | | Реферат Отчет о научно-исследовательской работе состоит Отчет о научно-исследовательской работе состоит из 33 рисунков, 8 разделов, 12 подразделов, 9 формул, 31 источника. Общий объем 48... |
| Отчет о научно-исследовательской работе по теме: «Разработка научно... «Институт законодательства и сравнительного правоведения при Правительстве Российской Федерации» (ИЗиСП) | | Отчет о научно-исследовательской работе на тему: «Разработка модифицированных... «Разработка модифицированных методов выделения гуминовых веществ для получения биологических препаратов на основе вермикомпоста» |
