1.4 Схемы назначения препаратов антиоксидантов в зависимости от особенностей показателей свободно-радикального и молекулярно-генетического статуса пациента и стадии развития опухоли
В качестве препарата-антиоксиданта апробирован «Immugen» IDIFARMACEUTICIS.p.A. (Италия), который является одной из последних разработок в области комбинаций антиоксидантов и аминокислот и представляет собой уникальный комплекс оптимально сочетающихся компонентов [27-31]. Препарат состоит из убихинона, витамина Е (альфа-токоферол-ацетат), фосфолипидов сои (лецитин), альфа-метионина и селена. Метионин и селен обладают антиоксидантными свойствами, снижая разрушающее действие свободных радикалов. КоэнзимQ усиливает метаболические процессы и ускоряет ранозаживление, снижает интоксикацию, улучшает общую сопротивляемость организма, является одним из основных веществ, активно противостоящих процессам старения. Фосфолипиды сои и витамин Е дополняют комплекс за счет выраженных антисклеротических и противораковых свойств.
Перечень клинико-диагностических показателей и молекулярно-генетических, являющихся показанием для дополнения стандартной терапии препаратом Immugen, был выявлен на 2,3 этапах НИР и состоит в следующем:
При снижении уровней лигандов апоптоза sFAS, TRAIL в крови и отделяемом цервикального канала более чем на 30% от нормальных показателей (сыворотка крови: sFAS≤750,0±100,5 пг\мл при норме 1250,5 ± 135,5пг\мл; TRAIL≤ 120,0±10,0 пг\мл при норме 199,0±5,3 пг\мл в сыворотке крови; отделяемое цервикального канала - sFAS≤400,0±50,5 пг\мл при норме 750,5 ± 130,5пг\мл; TRAIL≤ 95,0±10,0 пг\мл при норме 145,0±25,0 пг\мл).
При снижении общего уровня CD95+клеток в цервикальной жидкости пациенток более чем на 35% по сравнению с показателями здоровых женщин (процент CD95+ клеток ниже 3,5±0,5% при норме 5,8±0,5%).
При снижении экспрессии генов ФНОα, sFas и TRAIL, ИЛ-2 в клетках биоптата шейки матки и в клетках крови (лейкоцитах) более чем на 30% по сравнению с показателями здоровых женщин.
При повышенных концентрациях нитрат-нитритов в биоптатах шейки матки более чем на 40% по сравнению с показателями здоровых женщин (концентрации нитрат-нитритов более 20,5±1,5 мкМ/мг при норме в 13,0±0,5мкМ/мг).
При выявленных нарушениях молекулярно-генетического статуса и свободно-радикального статуса (изменение экспрессии генов, регулирующих апоптоз, обнаружение дисбаланса радикальных и антиоксидантных показателей в биоптатах шейки матки, см. ниже) дополнительно к стандартной терапии соответствующей группы добавлялся препарат Immugen по 2 капсулы 3 раза в день во время еды в течение 3 месяцев [31]. Противопоказания: индивидуальная непереносимость компонентов продукта. Беременным и кормящим женщинам перед применением рекомендуется проконсультироваться с врачом [27,29,31].
Стандартная комплексная терапия пациенток с выявленными ВПЧ высокого онкогенного риска включала «Виферон» №2 два раза в день внутри влагалищно в течение 7 дней в сочетании с индукторами интерферона (амиксин, ридостин, циклоферон) [1,7]. Комплексная терапия пациенток с предраковыми заболеваниями включала при большой площади поражения метод эксцизии или деструкции, в сочетании с противовирусной и иммуномодулирующей терапией (изопринозин 1000мг, 3 раза в стуки, 10 дней, свечи «Виферон» №2 два раза в день внутри влагалищнов течение 10 дней в сочетании с индукторами интерферона (амиксин, ридостин, циклоферон) [1,7,18].
Глава 2 Создание алгоритма и методики оценки риска развития папилломавирус ассоциированного канцерогенеза
Несмотря на широкое применение современных методов диагностики, проблема смертности от рака шейки матки остается актуальной [1,7]. Заболеваемость раком шейки матки растет и занимает второе место по распространенности среди онкологических заболеваний в мире и первое место среди причин женской смертности от рака в развивающихся странах. По данным Всемирной организации здравоохранения, в мире ежегодно регистрируется около 500 000 новых случаев и более 250 000 смертей от данного заболевания. Средний возраст больных по данным отечественной и зарубежной литературы колеблется от 38 до 50 лет. Как отмечают большинство исследователей, выявляемость начальных стадий рака шейки матки составляет от 42% до 58%. В возрасте 35-40 лет рак шейки матки является одной из основных причин смерти от злокачественных опухолей [5]. За последние десятилетия это онкологическое заболевание существенно помолодело, и его пик приходится на активный репродуктивный возраст фертильных женщин. По экспертным оценкам стоимость комплексного лечения одного случая РШМ составляет около 1,1 млн. руб. [6,32, 33].В целом проблема ранней диагностики рака шейки матки далека от разрешения.
В настоящее время результаты диагностики и прогнозирования течения папилломавирус-ассоциированной трансформации ткани шейки матки на сегодняшний день не удовлетворяют ни врача, ни пациента. Существующие на данные момент способы оценки риска развития канцерогенеза шейки матки относятся к двум группам:
Кольпоскопическое исследование, позволяющее морфологически оценить степень изменения тканей. При данном методе возможна достаточно поздняя констатация трансформации тканей шейки матки [34].
Определение инфицированности ВПЧ и типов ВПЧ (низкоонкогенные, среднеонкогенные и высокоонкогенные типы) методом ПЦР. Однако у части инфицированных женщин, в том числе высокоонкогенными типами вирусов папилломы человека инфекционное заболевание проходит латентно и со временем вирус элиминируется из организма. В то же время доказано, что ассоциация нескольких типов ВПЧ, включающая не только высокоонкогенные типы, но и другие типы ВПЧ может способствовать более быстрому развитию онкогенеза шейки матки [1,7].
Известен способ, учитывающий возможность элиминации трансформированных клеток за счет апоптоза, по патенту РФ № 2208789 (2002128701/14), описывающий прогнозирование клинического течения увеальной меланомы на основе изучения активности маркера апоптоза р53 (автор Лихванцева В.Г.). Данный способ предлагает учет данного маркера в прогнозе первичной злокачественной опухоли, занимающей первое место по частоте среди внутриглазных новообразований.
Известен способ прогнозирования клинического течения увеальной меланомы по патенту РФ № 2208790 (2002128702/14) (автор Лихванцева В.Г.), который основан на исследовании на основе активности маркера апоптоза Вax.
Недостатками вышеназванных способов прогнозирования течения онкологического заболевания является оценка отдельных показателей, при этом отсутствует системный анализ происходящих в организме процессов, влияющих на известные в данное время патогенетические звенья канцерогенеза. В вышеназванных патентах не предложены способы оценки риска развития канцерогенеза, данные методы касаются только возможностей прогнозирования течения уже сформировавшейся опухоли. Кроме того, способы прогнозирования клинического течения онкологического заболевания относятся к другой локализации онкологического заболевания и неприменимы в области гинекологии.
Задача изобретения состоит в оценке риска развития канцерогенеза шейки матки у женщин, инфицированных вирусами папилломы.
Сущность изобретения состоит в ранней оценке степени риска канцерогенеза шейки матки у женщин с выявленной методами ПЦР инфекцией, вызванной семейством вирусов папилломы.
Существенным отличием предлагаемого способа оценки степени риска развития канцерогенеза шейки матки является разных звеньев в патогенеза рака, в том числе учет типа вируса, интенсивности радикал-зависимого повреждения тканей шейки матки в процессе хронической инфекции высокого онкогенного риска и способности организма к элиминации раковых и вирус-инфицированных клеток за счет апоптоза. Преимуществом от всех известных аналогов является также возможность применения данного метода до формирования патологических процессов в тканях, что дает возможность врачам назначить профилактический курс и предотвратить развития рака шейки матки при выявленной предрасположенности или при наличии факторов риска.
Оценка риска канцерогенеза шейки матки проводится на основании исследования показателей апоптоза в крови по уровню лигандов апоптоза (sFAS, TRAIL), особенностей рецепторного фенотипа клеточных элементов цервикального канала (экспрессия рецепторов к CD95 и DR5), генетических особенностей экспрессии генов, регулирующих процессы апоптоза, а также процессов радикалообразования (активность миелопероксидазы, уровень нитрат-нитритов, общая антиоксидантная емкость ткани по реакции Фентона), измеряемых в тканях биоптата, взятых при кольпоскопии из шейки матки.
Сущность изобретения состоит в систематизации факторов риска развития канцерогенеза шейки матки.
Предлагаемый способ оценки степени риска развития канцерогенеза шейки матки включает исследование разных звеньев в патогенезе рака, в том числе учет типа вируса, интенсивности радикал-зависимого повреждения тканей шейки матки в процессе хронической инфекции высокого онкогенного риска и способности организма к элиминации раковых и вирус-инфицированных клеток за счет апоптоза. Преимуществом от всех известных аналогов является также возможность применения данного метода до формирования патологических процессов в тканях, что дает возможность врачам назначить профилактический курс и предотвратить развития рака шейки матки при выявленной предрасположенности или при наличии факторов риска.
Для оценки риска развития канцерогенеза предлагается рассчитать суммарный коэффициент риска по формуле:
K=K1+K2+K3, (1)
где K1 – коэффициент инфицированности вирусами папилломы человека.
K1=0 - в случае отсутствия ВПЧ высокого онкогенного риска (16,18 типы ВПЧ) при ПЦР исследовании цервикального эпителия.
K1=1 - в случае обнаружения ВПЧ высокого онкогенного риска (16,18 типы ВПЧ) при ПЦР исследовании цервикального эпителия.
K2 – коэффициент радикального повреждения тканей при ВПЧ.
K2=k2a+k2b+k2c, (2)
где k2a показатель активности миелопероксидазы в тканях, взятых при кольпоскопическом исследовании, k2a=0 – в случае выявления значений 0,054±0,005ммоль\грамм белка (показатель здоровой ткани доноров, n=35).
k2a=1– в случае выявления значений >0,054±0,005ммоль\грамм белка
Получение гомогенатов.
Образец ткани (биоптат) тщательно отмыть от эритроцитов (в 0,9% NaCl). К образцу весом 1-3 мг добавить 600 мкл К-фосфатного буфера и растереть в ручном гомогенизаторе Поттера до получения однородной суспензии. Гомогенат центрифугировать в течение 30 минут при 900g (3000 об/мин, центрифуга ОПН-3 без охлаждения) и для дальнейших анализов отобрать прозрачный супернатант.
Оценка содержания белка по Лоури. Для оценки содержания белка в супернатанте гомогената следует использовать метод Лоури, в качестве калибратора возможно использовать бычий сывороточный альбумин (БСА, Sigma). К 20 мкл образца добавить 180 мкл воды, инкубировать в течение 10 минут с 1 мл реактива Лоури, а затем добавить 100 мкл реактива Фолина (1:1). Через 40 минут измерить поглощение пробы при 750 нм.
Оценка активности миелопероксидазы (МПО). Активность МПО следует оценивать в супернатантах гомогенатов на основании реакции с орто-дианизидином. Аликвоты супертанатнов (50 мкл) смешать с 50 мкл Н2О и добавить 100 мкл реакционной смеси, содержащей 100мкг/мл о-дианизидина и 80 мкг/мл Н2О2 в 0,1М натрий-цитратном буфере, рН 5,5. Пробы инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре и останавить реакцию добавлением 1 мл 35%-ной ортофосфорной кислоты. Измерить поглощение проб при 560 нм и рассчитать активность МПО с использованием коэффициента экстинкции 20040 М-1см-1 (Andrews P.C., Parens C., Krinsky N.I. Comparison of myeloperoxidase with respect to catalysis, regulation and bactericidal activity// Arch.Biochem.Biophys., 1984; 228: 439-442).
k2b – показатель активности оксид азот-зависимого окисления тканей
k2b=0, в случае содержания нитратов и нитритов в гомогенатах тканей биоптатов 120,0±10,0 микромоль/г белка (показатель здоровой ткани доноров, n=35).
k2b=1, в случае содержания нитратов и нитритов в гомогенатах тканей биоптатов >120,0±10,0 микромоль/г белка
Оценка содержания нитратов и нитритов. 80 мкл образца внести в лунку 96-луночного планшета, затем внести по 10 мкл раствора нитрат-редуктазы и кофактора и инкубировать смесь при комнатной температуре в течение 2 часов. По окончании инкубации в каждую лунку добавить 50 мкл реактива Грисса (А), аккуратно перемешать и через 5 минут внести 50 мкл реактива Грисса (Б). Смесь перемешать, оставить на 10 минут при комнатной температуре и затем измерить поглощение при 540 нм. Для расчета концентрации нитратов и нитритов использовать калибровочную кривую, полученную по той же схеме с использованием раствора нитрата. Для проведения измерений применять набор «Nitrate/nitrite Assay Kit Colorimetric» Sigma (23479).
k2c – показатель общей антиоксидантной емкости ткани гомогената шейки матки.
k2c=0, в случае снижения хемилюминесценции (ХЛ) в реакции Фентона более (≥) чем на 50% при концентрации белка 1 мг/мл.
k2c=1, в случае снижения хемилюминесценции (ХЛ) в реакции Фентона менее чем на 50% при концентрации белка 1 мг/мл.
Оценка эффектов гомогенатов образцов в системе Фентона.
Анализ следует проводить в кювете люминометра объемом 1 мл, в режиме постоянного перемешивания и непрерывной регистрации. В среду измерений (0,01М К-фосфатный буфер, рН7,4, добавить раствор FeSO4 (17,7 мкМ), образец (20) и люминол (0,2мМ). Реакцию Фентона инициировать внесением Н2О2 (17,7 мкМ) через диспенсер и регистрировать интенсивность вспышки. Контролем являются пробы, не содержащие биологический образец.
K3 - коэффициент экспрессии генов апоптоза в тканях биопататов шейки матки (FAS, TRAIL).
K3=k3a+k3b (3)
k3a=0 – в случае выявления нормальных показателей экспрессии FAS.
k3a=1– в случае снижения уровня экспрессии FAS относительно уровня доноров более, чем на 25%.
k3b=0 – в случае выявления нормальных показателей экспрессии TRAIL.
k3b=1– в случае снижения уровня экспрессии TRAIL относительно уровня доноров более, чем на 25%.
Оценку экспрессии генов апоптоза (sFAS, TRAIL) проводят методом количественного Real-time ПЦР по технологии TaqMan с использованием прибора ICycler IQ (BioRad), в соответствии с основными рекомендациями протокола ЕАС (European Anti Cancer Program, 2003). Оценка экспрессии проводится в три этапа: на первом этапе проводят выделение РНК из тканей биоптата женщин с ВПЧ-инфекцией, предраковыми заболеваниями шейки матки и раком шейки матки.
Требования к биоптатам. Для анализа экспрессии генов можно использоваться свежие или замороженные ткани. Размер ткани должен был быть 4-5 мм - для оптимальной заморозки и пропитывания (в случае необходимости) стабилизирующим раствором RNA-later (Ambion). Обработку RNA-later следует провести сразу после взятия. Замороженный биоптат возможно хранить при температуре - 200С не более 3 месяцев. Повторное замораживание не допустимо.
Для выделения РНК из свежих или замороженных тканей используют iPrepPureLink TM Total RNA Kit , основанный на методике P. Chomczynsky, N. Sacchi (метод кислой гуанидин-тиоцинат-фенол-хлороформ-экстракции). К 10 млг гомогената образца ткани добавить 100мкл лизирующего буфера, затем центрифугировать при 12 000g 5 минут при комнатной температуре. Супернатант перенести в iPrepTM Sample Tube и произвести выделение РНК согласно инструкции к iPrepPureLink TM Total RNA Kit (Invitrogen, USA).
Далее с помощью реакции обратной транскрипции синтезировать копии ДНК на матрице мРНК. Для синтеза кДНК можно использовать комплект реагентов «Реверта-L» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, РФ). Для этого в пробирку с RT-mix внести 5мкл RT-G-mix-1, тщательно перемешать на вортексе, осадить капли с крышки кратковременным центрифугированием. К полученному раствору добавить 6 мкл ревертазы (MMlv), пипетировать 5 раз и перемешать на вортексе. Внести в микропробирки по 10 мкл готовой реакционной смеси. Использовать наконечники с аэрозольным барьером, добавить по 10 мкл РНК-пробы в пробирки с реакционной смесью. Осторожно перемешать пипетированием. Полученную в реакции обратной транскрипции кДНК для последующей постановки ПЦР, развести в 2 раза ДНК-буфером. Готовый препарат кДНК использовать либо сразу для ПЦР, либо заморозить и хранить при -680С. Не допускать хранения необработанных образцов кДНК более 3 месяцев. На последнем этапе провести полимеразную цепную реакцию на амплификаторе. ПЦР-амплификация должна была выполнена в соответствии с методикой, предложенной R.Gelder. В работе следует использовать пары праймеров для следующих генов апопотоза и цитокинов: sFAS, TRAIL. В качестве контрольного (housekeeping) гена можно использовать ген β2 микроглобулина (β2M). Экспрессия генов sFAS, TRAIL и β2 микроглобулина определяется в виде числа копий транскрипта. Количество копий в исследуемых образцах следует определять по отношению к стандартной калибровочной кривой, построение которой производится с помощью прибора Real-time ПЦР на основании серии 10-кратных разведений плазмиды с известным количеством копий в 1 мкл. Уровень экспрессии исследуемых генов следует рассчитывать относительно контроля, используя 2-ΔΔСt, метод позволяет оценить во сколько раз изменяется экспрессия изучаемого гена в пораженной ткани по сравнению с непораженной тканью. ΔΔСt рассчитать как ΔΔСt =ΔСt (пораженная ткань)- ΔСt (непораженная ткань), где каждое значение ΔСt = ΔСt (исследуемый ген)- ΔСt (β2 микроглобулин). Отрицательный контроль, необходимый для определения контаминации, должен содержать все компоненты для ПЦР кроме матрицы ДНК (ОКП). Положительный контроль используют для оценки эффективности работы реактивов, он должен содержать все компоненты для ПЦР и контрольные ДНК-матрицы (ПКП).
Чем выше суммарный коэффициент, тем выше уровень риска развития канцерогенеза шейки матки:
Если суммарный коэффициент K≤3, то уровень риска канцерогенеза низкий, если K>3, то уровень риска канцерогенеза высокий.
Методика позволяет определить степень риска развития канцерогенеза шейки матки у клинически здоровых женщин (но инфицированных ВПЧ), а также при патологии с целью прогноза заболевания и мониторинга эффективности проводимой профилактики и терапии.
Предлагаемый способ прогнозирования риска канцерогенеза шейки матки у женщин, инфицированных вирусами папилломы человека, осуществляют следующим способом:
При кольпоскопическом исследовании пациенток выявляют женщин с признаками вирусной инфекции и проводят гистологическое исследование биоптатов, а также отправляют материал на выявление ВПЧ инфекции (с определением типа вируса).
По данным ПЦР анализа с выявлением типа ВПЧ инфекции вычисляют первую составляющую суммарного коэффициента риска: K1=1 при выявлении ВПЧ высокого онкогенного риска (16,18 типы ВПЧ); K1=0 при отсутствии ВПЧ 16,18 типов.
Для вычисления коэффициента радикального повреждения тканей исследуют образцы тканей биоптатов. Биоптаты вручную гомогенизируют, определяют количество белка по Лоури и используют для исследования:
активности миелопероксидазы (k2a - k2a=0 – в случае выявления значений 0,054±0,005ммоль/грамм белка; k2a=1– в случае выявления значений >0,054±0,005ммоль/грамм белка);
концентрации нитра-нитритов в тканях (k2b=0, в случае содержания нитратов и нитритов в гомогенатах тканей биоптатов 120,0±10,0 микромоль/г белка; k2b=1, в случае содержания нитратов и нитритов в гомогенатах тканей биоптатов >120,0±10,0 микромоль/г белка).
Определения общей антиоксидантной емкости ткани гомогената шейки матки (k2c=0, в случае снижения хемилюминесценции (ХЛ) в реакции Фентона более (≥) чем на 50% при концентрации белка 1 мг/мл; k2c=1, в случае снижения хемилюминесценции (ХЛ) в реакции Фентона менее чем на 50% при концентрации белка 1 мг/мл).
Вычисляют вторую составляющую суммарного риска K2=k2a+k2b+k2c, демонстрирующей активность радикальной нагрузки в тканях шейки матки.
Проводят оценку экспрессии генов апоптоза генов sFAS и TRAIL методом количественного Real-time ПЦР по технологии TaqMan с использованием прибора ICycler IQ (BioRad), в соответствии с основными рекомендациями протокола ЕАС (European Anti Cancer Program, 2003). По результатам вычисляют третью составляющую суммарного коэффициента риска - K3=k3a+k3b (k3a=0 – в случае выявления нормальный показателей экспрессии генов FAS, k3a=1– в случае снижения уровня экспрессии FAS относительно уровня доноров более, чем на 25%; k3b=0 – в случае выявления нормальный показателей экспрессии TRAIL, k3b=1– в случае снижения уровня экспрессии TRAIL относительно уровня доноров более, чем на 25%).
Вычисляют суммарный коэффициент риска развития рака шейки матки у пациентки K=K1+K2+K3.
При выявлении значений выше 3, пациентку выделяют в группу риска и назначают курс терапии ВПЧ инфекции и профилактики рака шейки матки.
Пример 1. Пациентка 35 лет. Диагноз – ВПЧ инфекция 16,18 типа. Проведено исследование радикальной нагрузки в ткани шейки матки и оценка экспрессии генов апоптоза (FAS, TRAIL). Суммарный коэффициент риска=5. Больная отнесена в группу высокого риска развития канцерогенеза. Назначены укороченные интервалы между визитами к врачу. Назначена противовирусная терапия и иммунотерапия.
Пример 2. Пациентка 38 лет. Диагноз – ВПЧ инфекция 10,13 типа. Проведено исследование радикальной нагрузки в ткани шейки матки и оценка экспрессии генов апоптоза (FAS, TRAIL). Суммарный коэффициент риска=2. Больная отнесена в группу низкого риска развития канцерогенеза. Больной предложены визиты к врачу 1 раз в год. Наблюдение на протяжении 8 лет не выявило патологий шейки матки.
Таким образом, предлагаемый способ оценки риска развития канцерогенеза шейки матки позволяет прогнозировать течение заболевания и своевременно назначать адекватное лечение.
Медико-технические требования к методам идентификации генетических маркеров, имеющих прогностическую ценность в диагностике злокачественных образований, а также маркеров, позволяющих оценить эффективность профилактики и терапии с учетом индивидуальных генетических особенностей с целью выбора рационального выбора стратегии лечения
1. Наименование и область применения.
1.1. Наименование: методы идентификации генетических маркеров, имеющих прогностическую ценность в диагностике злокачественных образований, а также маркеров, позволяющих оценить эффективность профилактики и терапии с учетом индивидуальных генетических особенностей с целью выбора рационального выбора стратегии лечения
1.2. Область применения: онкогинекология, молекулярная биология.
2. Цель и назначение разработки.
2.1. Основная цель разработки и ожидаемый медицинский, техническийэкономический или социальный эффект при использовании: повышение эффективности ранней диагностики риска канцерогенеза шейки матки, а также эффективности профилактики и терапии папилломавирус-ассоциированного рака шейки матки.
В результате реализации проекта очевидна его бюджетная эффективность, так как экономия средств, в результате внедрения соответствующих технологии, программ, методик и алгоритмов значительно превосходит затраты, связанные с реализацией данного проекта. Повышение эффективности оценки риска, прогнозирования течения и профилактики папилломавирус-ассоциированного канцерогенеза шейки матки позволит значительно сократить объемы бюджетных средств, выделяемых учреждениям здравоохранения для лечения заболевания. Это позволит в свою очередь использовать освобождаемые бюджетные средства на закупку современного оборудования и материалов, с целью предоставления качественных медицинских услуг.
Применение результатов позволит повысить продолжительность жизни, значительно улучшить демографическую ситуацию в регионе и Российской Федерации, так же будет способствовать повышению уровня жизни населения.
2.2. Непосредственное функциональное назначение: использование в лечебно - диагностическом процессе в области онкогинекологии в соответствии с методикой диагностических исследований, лечебных воздействий, хирургических вмешательств, вспомогательных операций.
2.3. Возможности разрабатываемых методов, расширяющие целевое назначение и обеспечивающие преимущества по сравнению с существующими аналогами: в методах идентификации проводится оценка риска канцерогенеза шейки матки, которая проводится на основании исследования показателей апоптоза в крови по уровню лигандов апоптоза (sFAS, TRAIL), особенностей рецепторного фенотипа клеточных элементов цервикального канала (экспрессия рецепторов к CD95 и DR5), генетических особенностей экспрессии генов, регулирующих процессы апоптоза, а также процессов радикалообразования (активность миелопероксидазы, уровень нитрат-нитритов, общая антиоксидантная емкость ткани по реакции Фентона), измеряемых в тканях биоптата, взятых при кольпоскопии из шейки матки. Существенным отличием предлагаемых методов идентификации генетических маркеров, имеющих прогностическую ценность в диагностике злокачественных образований, а также маркеров, позволяющих оценить эффективность профилактики и терапии с учетом индивидуальных генетических особенностей с целью выбора рационального выбора стратегии лечения является учет разных звеньев в патогенеза рака, в том числе учет типа вируса, интенсивности радикал-зависимого повреждения тканей шейки матки в процессе хронической инфекции высокого онкогенного риска и способности организма к элиминации раковых и вирус-инфицированных клеток за счет апоптоза.
3. Медицинские требования.
3.1. Требования к выполнению функциональных задач в лечебно-диагностическом процессе. Методы идентификации генетических маркеров, имеющих прогностическую ценность в диагностике злокачественных образований, а также маркеров, позволяющих оценить эффективность профилактики и терапии с учетом индивидуальных генетических особенностей, с целью выбора рационального выбора стратегии лечения могут быть использованы в клинических учреждениях гинекологического, онкологического профиля при лечении пациентов с патологией шейки матки; для проведения опытно-технологических работ в научно-исследовательских организациях РАН, РАМН и профильных министерств, а также в фирмах-производителях наукоемкой продукции, направленных на создание технологий конструирования лекарственных средств, фармацевтической промышленности.
3.2. Требования к способам и средствам отражения. Методы идентификации генетических маркеров, имеющих прогностическую ценность в диагностике злокачественных образований, а также маркеров, позволяющих оценить эффективность профилактики и терапии с учетом индивидуальных генетических особенностей, с целью выбора рационального выбора стратегии лечения должны быть отражены в полном объеме с описанием алгоритмов и методик.
3.3. Специальные медицинские требования, определяемые назначением и принципом действия – не выставляются.
4. Медико-технические требования к материалам исследования:
Для анализа экспрессии генов могли использоваться свежие или замороженные ткани. Размер ткани должен был быть 4-5 мм - для оптимальной заморозки и пропитывания (в случае необходимости) стабилизирующим раствором RNA-later (Ambion). Обработку RNA-later проводили сразу после взятия.
Замороженный биоптат следует хранить при температуре - 200С не более 3 месяцев. Повторное замораживание было не допустимо.
Готовый препарат кДНК использовали либо сразу для ПЦР, либо замораживали и хранили при -680С. Не допускали хранения необработанных образцов кДНК более 3 месяцев.
Замороженные образцы сыворотки иди отделяемого цервикального канала замораживать однократно, хранить не более 1,5 месяцев при температуре - 200С. Разведенные растворы для ИФА исследований хранить в холодильнике не более 14 дней.
5. Дополнительные требования – не предъявляются.
|
