Глава 4 Создание алгоритма подбора препаратов (антиоксидантов и их комплексов), регулирующих активность свободно-радикальных механизмов защиты и активность апоптоза
Впервые теоретически обоснован и апробирован алгоритм поиска и экспериментального изучения составляющих частей в комплексах антиоксидантов. В моделях in vitro и в биологическом эксперименте на модели асептического перитонита проведено сравнительное исследование антиокисдантных свойств основных компонентов комплекса натиокислантных витаминов и аминокислот.
Изучение влияния препарата Immugen на образование кислородных радикалов лейкоцитами периферической крови человека. Лейкоциты периферической крови человека выделяли по стандартной методике, основанной на центрифугировании на градиенте плотности фиколл-верографина 1.119 при 400g. Препарат Immugen (0.5-1.0мг\мл) добавляли к изолированным лейкоцитам непосредственно перед активацией ФМА. Для сравнения влияния отдельных составляющих препарата Immugen на образование свободных радикалов лейкоцитами компоненты (лецитин, убихинон, витамин Е, метионин) также добавляли к изолированным лейкоцитам непосредственно перед активацией ФМА. Хемилюминесцентный анализ проводили с использованием хемилюминометра LKB (Швеция) в стандартных условиях (см. ниже) при активации ФМА (10-5М). Для оценки генерации супероксидного радикала клетками перитонеального экссудата использовали спектрофотометрический метод, основанный на восстановлении цитохрома с (см. ниже).
Определение радикалобразующей способности нейтрофилов.
Измерение хемилюминесценции (ХЛ).
Для изучения продукции активных кислородных метаболитов традиционно используется хемилюминесцентный анализ. Измерение хемилюминесценции (ХЛ) нейтрофилов производили на хемилюминометре ПХЛ-1, а также на LKB Luminometer (model 1251, Sweden) в термостатированных при 37 0С стеклянных кюветах при постоянном перемешивании. Образец содержал 5х105клеток в 1 мл раствора Хенкса, 2х10 –5 люминола (или люцигенина). В качестве показателя степени активации фагоцитов принимали изменение амплитуды ХЛ ответа (I отн.ед.). Индекс предстимуляции иммуноцитокинами рассчитывали как отношение амплитуд ХЛ ответов стимулированных и контрольных клеток.
Измерение продукции супероксидрадикала нейтрофилами.
Для измерения концентрации супероксидрадикала, генерируемого нейтрофилами, использовали метод, основанный на реакции восстановления супероксидом цитохрома с. В работе исследовали спонтанную и индуцированную продукцию супероксидрадикала. В инкубационную смесь объемом 1 мл и содержащую 100 мкл суспензии нейтрофилов (106\мл) в растворе Хенкса (рН 7.4) и 50мкл цитохрома с (12.5мг\мл), добавляли 10мкл ФМА (10-6М). Спонтанную продукцию супероксидного радикала измеряли путем добавления 10мкл диметилсульфоксида (99%) вместо ФМА. Для выяснения вклада в реакцию восстановления цитохрома с именно супероксидного радикала в реакционную смесь добавляли 10 мкл Cu-Zn-СОД (0.5мг\мл). Приготовленные таким образом пробы инкубировали при периодическом перемешивании в течение 1 часа при 37 0С. Затем суспензии центрифугировали 10 минут при 400 g, после чего измеряли оптическое поглощение супернатанта при 550нм (А550) и выражали в нМ/мин, с учетом показателя экстинкции восстановления цитохрома с (ε = 21мМ-1 см-1).
Эксперимент выполнялся на 40 беспородных крысах, которые были разбиты на 4 группы: 10 животным интраперитонеально вводили 20 мл стерильный физиологический раствор (группа «Контроль»); 10 животным интраперитонеально вводили 20 мл стерильного 2% раствора пептона для индукции асептического воспаления на фоне реакции на чужеродный белок (группа «Пептон»); 10 животным интраперитонеально вводили стерильный физиологический раствор на фоне перорального введения комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот Immugen (в состав входят убихинон, фосфолипиды сои, токоферол, селен и метионин), разведенного подсолнечным маслом (25мг\мл), при этом пероральное введение было начато за 7 дней до введения физиологического раствора (группа «Контроль+Комплекс»); 10 животным интраперитонеально вводили 20 мл стерильного 2% раствора пептона на фоне перорального введения антиоксидантного комплекса (группа «Пептон+Комплекс»). Эритороциты получали из гепаринизированной крови, клетки перитонеального экссудата выделяли после введения в брюшную полопсть 20 мл раствора Хенкса. Клеточный состав оценивали с помощью мазков, окрашенных по Романовскому-Гимзе, анализ фагоцитарной активности проводили по стандартной методике с использованием зимозана («Sigma»,USA). Оценивали активность аланин аминотрансферазы (АЛТ) и аспартат аминотрансферазы (АСТ) в сыворотке с использованием биохимического анализатора ASCA (США), активность глутатион-S-трансферазы (GST) эритроцитов по восстановлению 1-хлор-2,4-динитробензола (CDNB), активность супероксид дисмутазы (СОД) клеток перитонеального экссудата и эритроцитов по способности клеточных лизатов ингибировать аутоокисление адреналина. Антиокислительную активность препарата определяли по методу Клебанова Г.И. и др .Статистическая обработка полученных данных проводилась с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0 (StatSoft, USA). Достоверность различий этих показателей определялась параметрическим критерием Стьюдента.
Поскольку в состав изучаемого комплекса входят такие антиоксиданты как убихинон и витамин Е, было изучено его влияние на образование кислородных радикалов лейкоцитами периферической крови человека и процессы перекисного окисления липидов в системе in vitro. Добавление комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот к изолированным лейкоцитам или цельной крови непосредственно перед активацией ФМА (10-5М) приводило к снижению ХЛ ответа на активатор (С50=0,2мг\мл). Однако при инкубации цельной крови с препаратом (0,5-1,0мг\мл) в течение 4 часов при 370С этот эффект исчезал и величина ХЛ ответа полностью восстанавливалась.
Сравнение отдельных компонентов комплекса антиоксидантных витаминов аминокислот по способности ингибировать образование свободных радикалов in vitro показало, что максимальным эффектом обладают убихинон и витамин Е (таблица 1), тогда как метионин, напротив усиливал ХЛ ответ лейкоцитов, активированных ФМА.
Исследование влияния препарата на железо-индуцированное окисление желточных липопротеидов показало, что он обладает антиоксидантным действием (С50=4мг\мл).
Таблица 1 - Концентрации 50%-ингибирования ХЛ и восстановления цитохрома с лейкоцитами in vitro для комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот и его компонентов (мг/мл).
компоненты
|
Ингибирование восстановления цитохрома с
|
Ингибирование люминол-зависимой ХЛ
|
«Комплекс»
|
1,00
|
0,200
|
Лецитин
|
0,37
|
0,020
|
Убихинон
|
0,01
|
0,004
|
Витамин Е
|
---
|
0,008
|
Метионин
|
Не ингибирует
|
Не ингибирует
|
Таким образом, на основании исследованных свойств комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот in vitro можно предположить, что препарат выступает как ингибитор свободно-радикальных процессов.
Действие комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот исследовали в биологическом эксперименте путем интраперитонеального введения пептона. О развитии воспалительной реакции в брюшной полости судили по увеличению выхода клеток перитонеального эксудата на 2 сутки. К этому сроку острая нейтрофильная реакция уже завершается, о чем свидетельствует близкое к контрольным значениям содержание полиморфноядерных лейкоцитов в эксудате (таблица 2). Введение пептона интраперитонеально вызывало у крыс гепатотоксичекую реакцию - повышение уровня активности АСТ и АЛТ в сыворотке, особенно на 7 сутки и GST в эритроцитах (таблица 2).
Как видно из приведенных в таблице 3 данных, «комплекс антиоксидантных витаминов и аминокислот» существенно снижает интоксикацию, вызванную введением чужеродного белка (об этом свидетельствует снижение уровня АСТ и АЛТ, особенно на 7 сутки, в группе «Пептон+Комплекс» по сравнению с группой «Пептон»). Кроме того, препарат, увеличивая уровень активности GST на 2 сутки по сравнению с группой «Пептон», практически нормализует его к 7 суткам. Следует также отметить резкое падение уровня активности СОД эритроцитов, ведущее к дисбалансу окислительно-восстановительных процессов, которое происходит на 7 сутки. Препарат, состоящий из антиоксидантных витаминов и аминокислот, полностью предотвращает это падение (таблица 2).
Таблица 2 - Влияние комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот на свойства клеток перитонеального экссудата.
Параметр
|
дни
|
Группа
«Контроль»
|
Группа
«Контроль+Комплекс»
|
Группа
«Пептон»
|
Группа
«Пептон+ Комплекс»
|
Cуммарное количество клеток в эксудате
|
0
2
7
|
24,80,8
-----
28,33,3
|
14,51,8
-----
33,57,6
|
----
54,613,2
11,73,2
|
-----
75,59,5
10,43,3
|
Содержание
ПМЯЛ в
эксудате,%
|
0
2
7
|
7,40,4
----
19,04,7
|
10,82,5
-----
5,71,4
|
----
11,01,6
2,90,3
|
----
8,94,4
8,14,5
|
Содержание фагоцитирующих клеток в эксудате,%
|
0
2
7
|
15,70,4
-----
4,00,4
|
7,93,0
------
7,83,0
|
----
15,43,0
38,94,3
|
----
23,312,1
35,611,7
|
Индекс фагоцитоза, частиц зимозана на клетку
|
0
2
7
|
1,70,3
----
2,60,4
|
2,50,3
----
2,91,0
|
2,20,2
----
3,40,5
|
3,10,9
----
3,80,8
|
Величина ХЛ ответа клеток эксудата на ФМА,мВ
|
0
2
7
|
----
----
|
----
----
|
----
93
192
|
----
104
40216**
|
Активность СОД клеток эксудата,ед\мг белка
|
0
2
7
|
37,79,6
----
17,12,5
|
16,30,2
----
12,45,1
|
----
2,71,3
6,50,1
|
----
18,82,9*
16,35,5
|
--- - нет данных
*- р<0,05 относительно экспериментальной группы без комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот
** - р<0,01 относительно экспериментальной группы без комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот
Таблица 3 - Влияние комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот на некоторые показатели крови экспериментальных животных.
Параметр
|
Дни
|
Группа
«Контроль»
|
Группа
«Контроль+Комплекс»
|
Группа
«Пептон»
|
Группа
«Пептон+ Комплекс»
|
Активность глутатион-S-трансферазы эритроцитов, нмоль CDNB\мин.г гемоглобина
|
0
2
7
|
133,127,0
---
---
|
177,019,2
----
----
|
----
271,039,4
318,038,2
|
----
348,028,3
154,029,6
|
Активность СОД эритроцитов, ед\мг белка
|
0
2
7
|
5,21,3
----
----
|
6,85,6
----
----
|
-----
10,81,4
0,70,5
|
----
13,92,0
5,31,5
|
Активность аспартат-аминотрансферазы, ед\л
|
0
2
7
|
102,23,9
----
----
|
99,79,7
----
----
|
----
89,710,8
240,53,5
|
----
84,08,1
146,57,6
|
Активность аланин аминотрансферазы в сыворотке, ед\л
|
0
2
7
|
180,711,0
----
----
|
189,130,7
----
----
|
----
235,346,6
281,55,6
|
----
189,425,2*
191,549,0**
|
--- - нет данных
*- р<0,05 относительно экспериментальной группы без комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот
** - р<0,01 относительно экспериментальной группы без комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот
Таким образом, Immugen уменьшает токсическую и, в частности гепатотоксическую нагрузку на организм. С другой стороны, препарат не снижает выход клеток в очаг воспаления (таблица 2) и не влияет на содержание полиморфноядерных лейкоцитов и фагоцитирующих клеток в очаге. Влияние препарата на клеточную популяцию в этом случае проявляется в восстановлении способности к дыхательному взрыву (7 сутки, группа «Пептон+Комплекс»). При этом препарат восстанавливает до нормальных значений уровень СОД-активности клеток перитонеального эксудата, тогда как в группе «Пептон» эти значения ниже контрольных. Следует также отметить и тенденцию к повышению индекса фагоцитоза в группах животных, принимавших «комплекс антиоксидантных витаминов и аминокислот» (как на фоне перитонита, так и в контрольных группах) (таблица 3).
На основании полученных данных можно утверждать, что при пероральном применении Immugen уменьшает общую интоксикацию организма. Он также действует как регулятор свободно-радикальных процессов в организме, восстанавливая уровень активности СОД макрофагов и эритроцитов и способность фагоцитов к осуществлению дыхательного взрыва, что имеет особое значение при инфекционной патологии, в частности при вирусассоциированной патологии шейки матки. Мы предлагаем при скрининге возможных новых комплексов антиоксидантов использование схожих с вышеперечисленными методиками для выявления воздействия на основные звенья патологического процесса.
Подбор антиоксидантов в терапии женщин с патологией шейки матки следует провести в виде последовательности следующих действий (схема 5):
Определить длительность инфицирования: в случае выявления ВПЧ инфекции более 1 года назад, следует дополнить комплексную терапию препаратами, состоящими из убихинона, токоферола, селена и метионина.
Провести цитологическое исследование: при наличии воспалительного типа мазка следует дополнить комплексную терапию препаратами, состоящими из убихинона, токоферола, селена и метионина.
Провести кольпоскопическое исследование, при выявлении патологически измененных очагов тканей шейки матки, провести гистологическое исследование.
Следующие виды кольпоскопических заключений (диагнозов) основанием для подключения в комплексную терапию препаратов, состоящих из убихинона, токоферола, селена и метионина: койлоцитоз, утолщение многослойного плоского эпителия, гиперкератоз, паракератоз, CIN I, CIN II.
Провести исследование прооксидантно-антиоксидантной системы в тканях шейки матки при исследовании биоптатов. Оценить активность миелопероксидазы, содержания нитратов и нитритов в гомогенатах тканей биоптатов и общей антиоксидантной емкости ткани гомогената шейки матки по следующим методикам:
Получение гомогенатов.
Образец ткани (биоптат) тщательно отмыть от эритроцитов (в 0,9% NaCl). К образцу весом 1-3 мг добавить 600 мкл К-фосфатного буфера и растереть в ручном гомогенизаторе Поттера до получения однородной суспензии. Гомогенат центрифугировать в течение 30 минут при 900g (3000 об/мин, центрифуга ОПН-3 без охлаждения) и для дальнейших анализов отобрать прозрачный супернатант.
Оценка содержания белка по Лоури. Для оценки содержания белка в супернатанте гомогената следует использовать метод Лоури, в качестве калибратора возможно использовать бычий сывороточный альбумин (БСА, Sigma). К 20 мкл образца добавить 180 мкл воды, инкубировать в течение 10 минут с 1 мл реактива Лоури, а затем добавить 100 мкл реактива Фолина (1:1). Через 40 минут измерить поглощение пробы при 750 нм.
Оценка активности миелопероксидазы (МПО). Активность МПО следует оценивать в супернатантах гомогенатов на основании реакции с орто-дианизидином. Аликвоты супертанатнов (50 мкл) смешать с 50 мкл Н2О и добавить 100 мкл реакционной смеси, содержащей 100мкг/мл о-дианизидина и 80 мкг/мл Н2О2 в 0,1М натрий-цитратном буфере, рН 5,5. Пробы инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре и останавить реакцию добавлением 1 мл 35%-ной ортофосфорной кислоты. Измерить поглощение проб при 560 нм и рассчитать активность МПО с использованием коэффициента экстинкции 20040 М-1см-1.
Оценка содержания нитратов и нитритов. 80 мкл образца внести в лунку 96-луночного планшета, затем внести по 10 мкл раствора нитрат-редуктазы и кофактора и инкубировать смесь при комнатной температуре в течение 2 часов. По окончании инкубации в каждую лунку добавить 50 мкл реактива Грисса (А), аккуратно перемешать и через 5 минут внести 50 мкл реактива Грисса (Б). Смесь перемешать, оставить на 10 минут при комнатной температуре и затем измерить поглощение при 540 нм. Для расчета концентрации нитратов и нитритов использовать калибровочную кривую, полученную по той же схеме с использованием раствора нитрата. Для проведения измерений применять набор «Nitrate/nitrite Assay Kit Colorimetric» Sigma (23479).
Оценка эффектов гомогенатов образцов в системе Фентона. Анализ следует проводить в кювете люминометра объемом 1 мл, в режиме постоянного перемешивания и непрерывной регистрации. В среду измерений (0,01М К-фосфатный буфер, рН7,4, добавить раствор FeSO4 (17,7 мкМ), образец (20) и люминол (0,2мМ). Реакцию Фентона инициировать внесением Н2О2 (17,7 мкМ) через диспенсер и регистрировать интенсивность вспышки. Контролем являются пробы, не содержащие биологический образец.
Показаниями для поключения в комплексную терапию препаратов, состоящих из убихинона, селена, метионина, токоферола являются следующие параметры прооксидантно-антиоксидантного статуса:
активности миелопероксидазы >0,054±0,005ммоль/грамм белка;
содержание нитратов и нитритов в гомогенатах тканей биоптатов >120,0±10,0 микромоль/г белка;
снижение хемилюминесценции (ХЛ) в реакции Фентона менее чем на 50% при концентрации белка 1 мг/мл.
При подборе препаратов антиоксидантов оптимальным является сочетание регуляторного, антиоксидантного и противовирусного действия.
Длительность инфицирования ВПЧ
Наличие воспалительного типа мазка при цитологическом исследовании цервикального канала
Наличие патологических изменений при гистологическом исследовании тканей шейки матки
Выявленный дисбаланс между повышенными показателями радикалообразования в тканях биопатата шейки матки и сниженной антиоксидантной емкостью ткани шейки матки
     
Более 1 года
+
+
+
   
Менее 1 года
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Комплекс антиоксидантных витаминов и аминокислот, обладающий регуляторным действием на свободно-радикальные процессы в тканях и противовирусным действием
Мониторинг показателей (1 раз в 6 месяцев)
Схема 5 - Основные клинико-лабораторные показания для подключения антиоксидантов в комплексную терапию пациенток с патологией ШМ.
Предложение на разработку и освоение метода идентификации генетических маркеров, имеющих прогностическую ценность в диагностике злокачественных новообразований, а также маркеров, позволяющих оценит эффективность профилактики и терапии с учетом индивидуальных генетических особенностей пациентов, с целью рационального выбора стратегии лечения
В настоящее время использование в медицине новых методов, как исследования ДНК, молекулярно-цитогенетический анализ, хромато-масс-спектрометрия, высокоэффективная хроматография и многих других, позволило установить генетическую природу и предрасположенность к их развитию множества болезней человека [33]. Исследование генетических механизмов широко распространенных болезней особенно важно, так как эта патология вносит основной вклад не только в структуру заболеваемости, но и смертности пациентов.
Доказана существенная роль генетических факторов в возникновении эссенциальной гипертонии, сахарного диабета, бронхиальной астмы, атеросклероза, многих врожденных пороков развития и др [34]. Большинство этих заболеваний имеют мультифакториальную природу, т.е. проявления клинических симптомов возникают только в результате совместного действия некоторого числа генетических и средовых факторов. Каждая нозологическая форма болезни с наследственным предрасположением на самом деле генетически гетерогенная группа. Отдельные болезни (например, гипертоническая болезнь, ишемическая болезнь сердца, язвенная болезнь желудка, сахарный диабет и др.) представляют собой не одну болезнь, а группу болезней с одинаковым конечным проявлением. Но, чем выше наследственная предрасположенность и больше вредных воздействий среды, тем выше вероятность заболеть тем или иным заболеванием.
При папилломавирус-ассоциированном поражении шейки матки есть два основных аспекта патогенеза: микробный (вирусный) и иммунный (включающий активность компонентов врожденного и приобретенного иммунитета). Поскольку опухолевый рост при инфицировании вирусами, изменяющими генотип клетки, является результатом дисбаланса между пролиферацией клеток и апоптозом, клинический интерес представляет прежде всего возможность использовать стимуляцию апоптоза в процессах лечения. Воздействие на программу клеточной гибели - перспективное направление лекарственного лечения. Важными физиологическими регуляторами апоптоза являются свободные радикалы. При нарушении адекватного соотношения окислительных и антиокислительных процессов происходит избыточное накопление свободных радикалов, приводящее к повреждению нуклеиновых кислот, индукции хромосомных аберраций, нарушениям регуляции клеточной пролиферации и апоптоза, играющих важную роль в злокачественной трансформации клеток и опухолевой прогрессии [9].
На основе полученных в ходе НИР результатов представлены предложения для разработки и освоения метода идентификации генетических маркеров, имеющих прогностическую ценность в диагностике злокачественных новообразований, а также маркеров, позволяющих оценит эффективность профилактики и терапии с учетом индивидуальных генетических особенностей пациентов, с целью рационального выбора стратегии лечения.
Нами выделены несколько 2 группы показателей, являющихся основными при составлении прогноза течения заболевания и мониторинга эффективности терапии:
1 группа – группа показателей, демонстрирующих процесс апоптоза (уровень лигандов апоптоза на клетках цервикального канала - FAS, TRAIL, TNF; экспрессия рецепторов апоптоза (CD95, DR5) на клетках цервикального канала, экпрессия генов, кодирующих процессы программированной смерти зараженных вирусов клеток).
2 группа – показатели, радикального поражения тканей шейки матки, включающие исследование показателей кислородных и азотных радикалов в биоптатах шейки матки (нитротирозин, общая антиоксидантная активность тканей, каталаз и глутатион-пероксидаза тканей).
В дальнейших разработках предлагается исследовать особенности нитрозильного окисления, позволяющие более детально понять участие радикалов в канцерогенезе. Полученные данные по активности нитрозильного окисления могут служить также одним из основных параметров для оценки эффективности терапии, так как доказана роль третичных радикалов азота в раковых заболеваниях различной локализации [35].
Одним из перспективных направлений дальнейших исследований является подбор неинвазивных, но демонстративных показателей тканевой защиты.
Следует изучить эффективность вторичной профилактики у пациенток с генетической предрасположенностью, выявленной при оценке экспрессии генов, кодирующих противовирусный и противовопухолевый иммунитет.
Глава 5 Создание алгоритма оценки эффективности вакцинации женщин разных возрастных групп
Первичные меры по предупреждению рака шейки матки осуществляются посредством предупреждения и контроля генитальной инфекции онкогенными типами ВПЧ. Имеющая государственное значение стратегия популяризации здорового образа жизни с информированием населения о предупреждении инфекций, передающихся половым путем, может оказаться эффективной в предупреждении генитальной ВПЧ-инфекции. Принимая во внимание широкую распространенность папилломавирусной инфекции среди населения, доказанную этиологическую роль ВПЧ в развитии РШМ, чрезвычайно значение имеет разработка средств вакцинопрофилактики этой инфекции [36].
Первая профилактическая вакцина (4-валентная вакцина против вируса папилломы человека 6, 11, 16 и 18-го типов) зарегистрирована начиная с июня 2006 г. более чем в 60 странах мира, включая страны Евросоюза и Россию, и внесена в Национальный календарь вакцинации уже более 20 стран мира [8]. Она относится к классу генно-инженерных вакцин и представляет собой смесь ВПЧ-подобных частиц типов 6,11,16 и 18. Длительность защиты по результатам проведенных исследований составляет на сегодня 5 лет, но уже получены свидетельства наличия клеток иммунологической памяти, что позволяет рассчитывать на длительность защиты на несколько десятилетий. На основании результатов ряда международных контролируемых клинических исследований и эпидемиологических данных были определены основные возрастные группы, которым рекомендована иммунизация: девочки и мальчики от 9 до 17 лет и молодые женщины от 18 до 26 лет. Разработанная схема вакцинации предусматривает введение трех доз: вторая доза вводится через 2 месяца после первой, а третья - через 6 месяцев после первой (схема 0-2-6). Выполнение полного курса вакцинации обеспечивает защиту против вирусов 6, 11,16 и 18-го типов на уровне 99-100%. В РФ и странах Евросоюза стране применяется и 2-валентная вакцина (против ВПЧ 16-го и 18-го типов).
Действие вакцины было в основном изучено у молодых женщин (17- 22 лет), которые не были инфицированы ни одним из четырех типов ВПЧ. В то время как основной контингент женщин с предраковыми и раковыми поражениями, ассоциированными с папилломавирусной инфекцией варьирует с 32-45 лет. Оценка эффективности вакцинации против вирусов папилломы основных онкогенных серотипов женщин разных возрастов позволит расширить группы первичной профилактики и предотвратить развитие канцерогенеза в более позднем возрасте. Данной НИР предусматривается оценка эффективности вакцинации женщин двух возрастных групп – 25-35 лет и 36-40лет, не охваченных в ранее проведенных исследованиях и наиболее подверженных опухолевым заболеваниям шейки матки (работы иностранного партнера по НИР). Разработанный и представленный алгоритм оценки эффективности вакцинации создан в соавторстве и иностранным партнером - коллективом IDI Farmaceutici (Рим, Италия). Алгоритм состоит из следующих этапов:
1.Подбор групп, подлежащих вакцинации.
Однородность групп исследования (критерии включения и исключения из групп исследования).
Критерии включения:
Возраст больных 1 группа от 25 до 35 лет, 2 группа от 36-40лет.
Предоставление письменного информированного согласия пациентки на обследование и вакцинацию.
Все пациентки детородного возраста должны соблюдать меры контрацепции на период вакцинации.
Не иметь посторонних сексуальных связей (допускается единственный половой партнер с доказанным отсутствием ДНК ВПЧ анализах крови и отделяемого уретры).
Критерии исключения:
Беременные или кормящие грудью женщины.
Наличие ВПЧ.
Медицинские противопоказания к иммунизации (наличие иммунодефицитных состояний).
Психические заболевания или другие нарушения, влияющие на способность адекватно дать согласие.
Женщины, имеющие аллергические реакции на любой ингредиент вакцины.
Женщины, ранее страдающие злокачественными новообразованиями.
Женщины, ведущие беспорядочную половую жизнь
Исключали женщин, ранее получавших иммунодепрессанты, стероиды или противовирусные препараты.
Женщин, злоупотреблявших алкоголем или наркотиками.
Предыдущая вакцинация против любого инфекционного агента не менее чем за 6 мес. до настоящего исследования.
Текущие острые инфекционные и неинфекционные заболевания, включая период реконвалесценции, менее одного месяца с момента клинического выздоровления.
Системные заболевания соединительной ткани
Наличие декомпенсированных заболеваний, которые могут повлиять на проведение исследования (декомпенсированная патология сердечно–сосудистой системы, больные с острой почечной или печеночной недостаточностью).
2. Основные требования, предъявляемые к клиническим и лабораторным исследованиям эффективности вакцинации, сводятся к следующему:
В алгоритме (см. схему 6) предусматривается исследование на 3 уровнях: Клинический уровень, включающий цитологический мониторинг и гистологический мониторинг, вирусологический мониторинг и иммунологический мониторинг. При этом важно обращать внимание на:
Стандартность взятия и хранения клинических проб.
Короткий промежуток времени, в течение которого исследуются все сыворотки.
Стандартность вакцин, применяемых в исследовании.
Необходима высокая чувствительность иммунологического теста для определения антител.
Необходима высокая чувствительность методов определения наличия ДНВ ВПЧ в клиническом материале.
Изучение иммунологической эффективности вакцин проводится путем сопоставления титров специфических антител, в сыворотке крови привитых до и в разные сроки после иммунизации, а также путем сравнения этих результатов с данными уровня антител, полученными в те же сроки при обследовании лиц, которым вводили плацебо или препарат сравнения. Плацебо помещают в точно такие же ампулы или флаконы, как и изучаемую вакцину. При этом схема иммунизации, дозировка и место введения препарата должны быть такими же, как и в группе испытуемых.
Основные параметры иммунологического контроля – это уровень защитных антител Защитный уровень антител устанавливается заранее в опытах с однонаправленным препаратом.
Основным параметром вирусологического контроля является наличие ДНК ВПЧ в образцах, взятых из групп вакцинированных женщин. Исследование проводится методом ПЦР.
В дальнейшем эффективность вакцинации можно оценивать путем наблюдения за возникающими на протяжении выбранного отрезка времени случаями заболеваний в опытной и контрольной группах (прогностический подход). С этой целью организуется постоянное медицинское наблюдение за контингентом привитых, позволяющее своевременно выявить и диагностировать все случаи болезни вплоть до бессимптомных форм. Когда речь идет о контролируемом эпидемиологическом опыте, срок наблюдения должен быть достаточным для определения длительности иммунитета, формирующегося у привитых изучаемой вакциной. При наличии соответствующей документации защитный эффект вакцинации может быть оценен и ретроспективно, т. е. на основе уже имеющейся информации о заболеваемости привитых и непривитых лиц. Сбор и обобщение данных позволят установить причины заболеваемости среди привитых, т. е. оценить возможность реализации защитных свойств вакцины при массовом ее применении.
Основными параметрами клинического контроля эффективности массовой иммунизации служат показатели не только заболеваемости, но и смертности; изменения в характере очаговости, сезонности и цикличности, возрастной структуре болеющих, а также клиническом течении соответствующего вакцине инфекционного заболевания, которые учтены за достаточно длительный период времени до и после проведения прививок.
Выбранные сроки наблюдения (1,2,6 месяцы, 1,3,5,6,10,15 лет) не зависят от возрастной группы исследованных женщин, но связаны с сроками вакцинации и временным характером поражения тканей шейки матки [1,7,8,36].
Отбор женщин в группы согласно протоколу и критерием включения и исключения из группы
Подписывание протокола согласия с женщинами на проведение вакцинации протии ВПЧ
Оценка эффективности вакцинации проводится по тем направлениям
Клинический контроль (цитологический мониторинг, гистологический мониторинг)
Вирусологический мониторинг
(анализ на ДНК ВПЧ при ПЦР исследовании )
Иммунологический мониторинг (анализ с определением титров ат к ВПЧ)
Сроки наблюдения*:
1,2,6 месяцы
1,3,5,6,10 ,15 лет
(* пояснения в тексте)
Критерии эффективности вакцинации универсальны и не зависят от возраста женщин:
Отсутствие клинических признаков патологии шейки матки
Отсутствие ДНК ВПЧ в образцах
Серопозитивность женщин на весь период наблюдения
  
Схема 6 - Алгоритм оценки эффективности вакцинации женщин разных возрастных групп.
|
