Заключение
В последние годы установлена тесная взаимосвязь между многими патологическими состояниями (гипоксией, стрессом, воспалениями, инфарктом миокарда) и процессами усиленного образования радикалов [41,42,43,44,45,46,47,48]. В научной литературе существует устойчивое представление о том, что свободные радикалы в биологических системах представляют исключительную опасность. Однако многие нормальные физиологические процессы нуждаются в участии радикальных интермедиаторов кислорода. Так, чрезвычайно важно участие активных форм кислорода и оксида азота в процессе обезвреживания экзогенных агентов: бактерий, вирусов, простейших, грибов [49,50,51,52,53,54,55].
При стафилококковой инфекции, как при любом антигенном раздражении в макроорганизме также наблюдается всплеск защитных радикальных процессов [55]. Потеря естественной толерантности может быть обусловлена следующими факторами: во-первых, синергичными взаимоотношениями бактериальных продуктов (эндо- и экзотоксинов и др.), что может привести к еще более выраженному выбросу оксидантов фагоцитами; во-вторых, нарушением взаимоотношений нейтрофилов с тромбоцитами, способными модулировать и прекращать внеклеточный выброс АФК, индуцированный хемоаттрактантами; в-третьих, снижением антиоксидантного статуса организма, что определяет резистентность клеток и тканей к поражающему действию АФК [56,57,58,59].
Обзор имеющихся литературных данных показывает, что основной причиной низкой чувствительности стафилококков к защитному действию иммунной системы является их адаптационная способность продуцировать вещества, ингибирующие продукцию и/или активность факторов иммунитета. Так внеклеточная продукция протеина А, обнаруженная у S.aureus, снижает опсонизирующий потенциал компонентов сыворотки крови человека [12]. Стафилококки выделяют факторы, ингибирующие активацию комплемент, продукцию и активность лизоцима, а также продукцию интерферонов лимфоцитами. Адаптационные способности стафилококков позволяют им эффективно защищаться от повреждающего действия активных форм кислорода, продуцируемых фагоцитирующими клетками, стимулированными бактериальными клетками или компонентами бактериальных стенок. Известно, что первичными бактерицидными факторами, выделяемыми фагоцитами, являются перекись водорода и продукты ее свободнорадикального разложения, такие как гипохлорит и гидроксильный радикалы [24,25]. Стафилококки приспосабливаются выживать в среде с повышенной концентрацией перекиси водорода путем индукции генов раннего ответа на окислительное повреждение. Белковыми продуктами этих генов являются, среди прочих, фермент каталаза, разлагающий перекись водорода до нейтральных продуктов: воды и молекулярного кислорода, и глутатионпероксидаза (нейтрализует перекись водорода путем окисления восстановленного глутатиона). Так увеличение синтеза и активности каталазы тесно коррелирует с выживаемостью стафилококков и кишечной палочки в среде с высокой концентрацией перекиси водорода [60]. Напротив, генетически-модифицированные линии бактерии, утратившие гены, кодирующие белок каталазы, оказывались исключительно чувствительными к бактерицидному действию перекиси водорода [61].
Основные исследования механизмов борьбы с патогенами (стафилококками), ограничивались изобретением различных антимикробных веществ и воздействий (антибактериальные препараты, немедикаментозные методы). Согласно нашему предположению, одним из эффективных способов борьбы со стафилококками может быть избирательное подавление индукции бактериальных антиокислительных ферментов, либо избирательное угнетение факторов персистенции. В связи с чем, актуальным является целенаправленный поиск препаратов, угнетающих защитные ферменты бактерий. Это составит новизну и определит перспективность полученных результатов.
Однако наиболее объективным показателем эффективности фагоцитарной реакции является оценка внутриклеточногокиллинга. Полученные данные в представленной работе позволили выявить зависимость степени влияния препаратов от источника выделения штаммов S.aureus. Обнаружено, что исследованные препараты увеличивают эффективность внутриклеточного киллинга штаммов стафилококков, выделенных из зева и раневого отделяемого. При изучении влияния препаратов иммуноцитокинов на фагоцитоз бактерий, выделенных из крови, положительный эффект не зарегистрирован. Исследуемые имуноцитокины не обладали прямым антимикробным действием, так как не влияли на способность бактерий к колониеобразованию (данные не приводятся).
По нашим представления подобная разница в степени влияния иммуноцитокинов на процесс внутриклеточного киллинга бактерий различного происхождения может быть связан с персистентными характеристиками бактериальных штаммов, выделенных из разных источников.
Поэтому в дальнейшем были исследованы персистентные характеристики штаммов S.aureus и корреляционные связи степени их выраженности с устойчивостью к фагоцитозу.
Обнаружено, что выявленная ранее зависимость устойчивости штаммов стафилококков к внутриклеточному киллингу от источника выделения, не связана с такими факторами персистенции как антилизоцимная, антиинтерфероновая и антикомплементарная активности, но выявлена прямая корреляционная связь между активностью каталазы и высеваемостью после фагоцитоза (к-0.9).
Для проверки этой гипотезы оценивали эффективность внутриклеточногокиллинга бактерий с различной каталазной активностью. Обнаружили, то существует корреляция между выживаемостью бактерий после фагоцитоза и их способностью разлагать перекись водород. Оценка эффективности внутриклеточного киллинга бактерий фагоцитами показала, что штаммы, активно продуцирующие каталазу, в среднем в 40% случаев не уничтожаются в фагосомах, что приводит к персистенции инфекционного агента в организме. Коэффициент корреляции между каталазной активностью штаммов и способностью их к колониеобразованию после фагоцитоза равен 0.9.
Из полученных данных мы заключили, что, возможно, именно высокий уровень каталазной активности стафилококков, выделенных из крови, определял отсутствие эффекта иммуноцитокинов при изучении внутриклеточного киллинга этих штаммов.
В качестве объекта фагоцитоза выбрали штаммы с высокой ( № 242 - 5.1 ед/20млн бактерий) и нулевой (№556 – 0.0ед/20млн бактерий) каталазной активностью. Нейтрофилы предстимулировали рекомбинантными иммуноцитокинами ИЛ-1β 100мЕ/мл) и ИНФ-γ (150 мЕ/мл) и препаратом «Cуперлимф» (10мкг/мл) в течение 3 часов и проводили оценку внутриклеточного киллингакаталазоактивного и каталазонеактивного штаммов. Обнаружено, что иммуноцитокины не изменяют эффективность фагоцитоза в случае штамма 242, обладающего выраженной каталазной активностью и значительно увеличивают эффективность внутриклеточного киллинга штамма 556, не продуцирующего этот фермент.
При оценке супероксид дисмутазной активности бактерий обнаружено, что изученные штаммы таковой не обладали (данные не приводятся).
Таким образом, повышенная устойчивость штаммов золотистого стафилококка, выделенных из крови, объясняется их высокой каталазной активностью. Для прогноза тяжести течения инфекционного процесса и подбора эффективной терапии наряду с иммунными показателями больного важное прогностическое значение имеет антиоксидантный статус бактерий. Одним из наиболее оптимальных путей борьбы с каталазоактивными микроорганизмами является поиск препаратов, ингибирующих каталазу, так как действие иммуноцитокинов, увеличивающих долю внутриклеточных активных форм кислорода, не привело к выраженному положительному результату.
Мы поставили задачу найти препарат растительного происхождения, снижающий исходную активность бактериальной каталазы. Суспензию S.aureus инкубировали с каждым препаратом и оценивали каталазную активность в отмытых бактериальных клетках йодометрическим и хемилюминесцентным методами. Параллельно определяли эффективность внутриклеточногокиллинга стафилококков нейтрофилами по способности поглощенных бактерий к колониеобразованию.
Прединкубация бактерий с фитопрепаратами в течение 1 часа не оказывала бактериостатического или бактерицидного эффекта (данные не приведены), однако, значительно снижала исходную каталазную активность стафилококков. Максимальным эффектом обладал препарат БиоРекс, снижавший каталазную активность S.aureus на 35 %. Одновременно с ингибированием каталазы происходило существенное, в 500 раз, увеличение внутриклеточного киллинга стафилококков штамма 241 (количество выживших после фагоцитоза бактерий – от 5х106кл/мл в контроле до 104кл/мл). Эффект препарата был дозозависимым.
На следующем этапе работы провели регистрацию продукции АФК лейкоцитами при активации бактериальным штаммом (№242), обработанным БиоРексом. Это привело к повышению люминольной хемилюминесценции по сравнению с контролем на 38% (контроль - штамм необработанный препаратом). Интенсивность люцигениновой ХЛ не изменялась (данные не приведены). Таким образом, эффект снижения люминольной ХЛ при активации лейкоцитов каталазоактивным штаммом, при обработке БиоРексом проявлялся значительно меньше.
Так как предстимуляция иммуноцитокинами нейтрофилов не приводила к увеличению эффективности фагоцитоза каталазоактивных штаммов, для нас представляло интерес выяснить, измениться ли действие иммуноцитокинов на нейтрофилы при фагоцитозе бактерий, обработанных БиоРексом. Эксперименты ставились с двумя штаммами S.aureus, в разной каталазной активностью (242 штамм с активностью каталазы в 5.1±0.1 ед/20 млн бактерий, 556 штамм с нулевой активностью каталазы).
При фагоцитозе нейтрофилами здоровых доноров бактерий штамма №242, предстимуляция ни одним из препаратов иммуноцитокинов не приводит к заметному эффекту. Обработка штамма 242 фитопрепаратом БиоРекс приводит к проявлению эффекта предстимуляции иммуноцитокинами при фагоцитозе этих бактерий. Процент выживших стафилококков уменьшается при предстимуляции ИЛ-1β до 5.6±0.2 (контроль -9.3±0.2); при предстимуляции ИНФ-γ до 4.7±0.2 (контроль - 9.1±0.2); при предстимуляции «Суперлимфом» до 4.2±0.2 (контроль - 8.9±0.2). Снижение активности каталазы бактерий этого штамма приводит к достоверному увеличению эффективности фагоцитоза (p<0.05). Другая картина получена в случае выбора объектом фагоцитоза штамма №560. Процент выживших бактерий штамма 560 с нулевой активностью фермента одинаков в случае обработанных и необработанных БиоРексом бактерий. Полученные результаты доказывают роль каталазы бактерий как фактора персистенции и демонстрируют значение поиска препаратов, ингибирующих этот фермент.
Таким образом, фитопрепарат на основе папайи может рассматриваться как непрямой антибиотик, ослабляющий адаптационные\приспособительные возможности стафилококков. Перед апробированием эффективности местного действия Биорекса при гнойно-воспалительных заболеваниях мы оценили наличие и выраженность антиоксидантных свойств препарата БиоРекс в модельных (Фентон, ксантин-ксантиноксидаза) и клеточных системах (цельная кровь).
БиоРекс обладает способностью ингибировать продукцию супероксид аниона, гидроксиланиона и уменьшать ХЛ цельной крови доноров. Антиоксидантными свойствами в данных системах обладали все изучаемые составные части БиоРекса, но наиболее ярко они были выражены у листьев папайи и цветов папайи. Таким образом, препарат БиоРекс обладает комплексом свойств, необходимых для лечения гнойно-воспалительных процессов: является антиоксидантным препаратом, что способствует ранозаживлению и ингибирует каталазу стафилококков, что делает бактерии более уязвимыми для иммунной системы.
Клиническую эффективность комплексной терапии с использованием препарата БиоРекс оценивали в трех балльной системе. К 3-4 дню при терапии Биорексом значительно уменьшалась отечность и гиперемия слизистых, уменьшались размеры миндалин. При этом отмечалось быстрое исчезновение болезненности при глотании, чувство саднения в глотке.
Ко 2-3 дню при местной терапии БиоРексом совместно с антибактериальной и дезинтоксикационной терапией значительно уменьшилась выраженность гноетечения и отека. При этом отмечалось быстрое очищение раны от некротизированных тканей и уменьшение размеров инфильтрата. Ранняя грануляция и эпителизация раны. Достоверность отличий между группами БиоРекс и Плацебо на 3,5,7,14 сутки р<0,05.
Таким образом, основные выводы по третьему этапу работ следующие:
При оценке роли факторов персистенции (антилизоцимная, антикомплементрная, антиинтерфероновая, каталазная, супероксид дисмутазная активности), влияющих на устойчивость штаммов Staphylococcusaureus при фагоцитозе нейтрофилами, выявлено, что основным защитным фактором бактерий в процессе фагоцитоза является продукция каталазы.
Эффективность предстимулирующего действия препаратов иммуноцитокинов (ИЛ-1β, ИФН-γ, естественный комплекс цитокинов) на процесс внутриклеточного киллинга стафилококков нейтрофилами зависит от каталазной активности штаммов Staphylococcusaureus: активирующее действие иммуноцитокинов на фагоциты проявляется только на каталазнеактивных штаммах.
Антиоксидантный фитопрепарат – ферментированная папайя –увеличивает эффективность внутриклеточного киллинга стафилококков нейтрофилами как больных, так и здоровых лиц, за счет способности снижать активность бактериальной каталазы. Антибактериальные свойства фитопрепарата являются основой для эффективного его применения при локальных гнойно-воспалительных процессах.
|
