Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России»
Скачать 1.18 Mb.
|
Раздел 1. Описание проблемы и пути решения.
Биолюминесценция - способность живых организмов излучать видимый свет, весьма широко распространенное природное явление. При изучении светящихся организмов достигнуты существенные результаты в понимании механизмов светоизлучения: охарактеризована структурно-функциональная организация нескольких люминесцентных систем, из некоторых светящихся организмов выделены и ферменты (люциферазы), катализирующие реакции преобразования энергии химических связей субстратов (люциферинов) в кванты видимого света, определены их первичная и пространственная структуры, определены структуры некоторых субстратов. С помощью методов молекулярной биологии и генной инженерии выделены, клонированы и экспрессированы в клетках-реципиентах гены ряда люцифераз, что открыло возможности получения надежных источников сырья для выделения этих ферментов в больших количествах. Это интенсифицировало изучение физико-химических свойств светоизлучающих ферментов и механизма их действия и стимулировало поиск вариантов их практического использования. Как сами светящиеся организмы, так и люциферазы являются весьма перспективными биомаркерами для высокочувствительных методов микроанализа, используемых при решении широкого спектра биологических, биотехнологических и медицинских задач. В биолюминесцентном анализе широко используются генетически модифицированные бактерии, несущие lux-гены светящихся бактерий и других светящихся организмов [1-3]. Однако с помощью бактериальных биотестов не всегда можно оценить воздействие веществ на эукариотические организмы и обнаружить токсичные вещества в воздушной среде. Разработка и использование биотестов более высоко организованных видов (дрожжи, черви, грибы), несущих гены люминесцентной системы, открывает новые перспективы развития биолюминесцентного анализа. Способностью излучать видимый свет обладают некоторые высшие грибы - известно около 80 светящихся видов [4-7], которые обнаружены в разных регионах Земного шара (Северная и Южная Америка, Европа, Азия, в том числе в Сибири, Австралия, Африка, Бразилия). Длительное свечение грибов (от нескольких дней до нескольких недель) в широком температурном диапазоне (4 до 500С [8]), наличие воздушного мицелия делают перспективным создание на их основе новых биолюминесцентных биотестов непрерывного действия, которые могут быть использованы для обнаружения токсичности, в том числе и в воздушной среде. До настоящего времени лишь несколько групп исследователей во всем мире (в Германии, Англии и Бразилии) предприняли попытки использования светящихся грибов в качестве потенциальных объектов для создания биотестов. Например, светящиеся грибы A. mellea, Micena citricolor и Gerronema viridilucens были использованы для разработки тестов на токсичность [9-11]. Weitz с соавторами [12] проводили исследование биотестов на основе светящихся грибов для определения токсичности 3,5 – дихлорфенола (ДХФ), пентахлорфенола (ПХФ) и солей тяжелых металлов (меди и цинка). Соли цинка ингибировали свечение мицелия A. mellea. При воздействии 3,5-ДХФ, ПХФ и меди на Armillaria mellea и Mycena citricolor наблюдалось уменьшение интенсивности люминесценции мицелия, причем мицелий A. mellea был существенно менее чувствителен к 3,5 ДХФ, чем мицелий M. citricolor. Показатель ЕС50 для 3,5-ДХФ, ПХВ и меди (но не цинка) для светящихся грибов был того же порядка, что и у бактериальных биотестов. Близкие результаты были получены на рекомбинантных бактериальных биотестах Pseudomonas fluorescens 8866 Tn luxCDABE при воздействии этих же токсичных веществ [13], а также на дрожжевых и нематодных рекомбинантных биотестах [14,15]. Однако, культура A. mellea была более чувствительна к меди, чем P. fluorescens 8866 и P. putida F1, тогда как M. citricolor оказалась менее чувствительной. Известны успешные попытки получить рекомбинантные светящиеся грибы для создания биосенсора на токсичность веществ. Подходящими видами для этих целей признаны Neurospors sp и Aspergillus sp., у которых получены люминесцирующие или флюоресцирующие нити грибов [16]. Люминесцирующие белки включают люциферазу Gaussia и обелин, а кодирующий ген находится в этих объектах под индуцибельным промотором или усилителем чувствительности к тест-веществу. Генетически модифицированные биолюминесцентные грибы Aspergillus awamori с геном рекомбинантного экворина были использованы для определения ионов кальция [17]. Чуть позже Mendes&Stevani [10] показали возможность использовать в качестве тест-объекта для определения токсичности ионов металлов (Pb(II), Cd(II), Al(III)) бразильский светящийся гриб Gerronema viridilucens. Сравнение чувствительности люминесценции светящихся грибов и рекомбинантных бактериальных люминесцентных биотестов к различным токсическим веществам (ТВ) показало, что культура грибов A. mellea была более чувствительной к меди, чем бактериальные культуры P. fluorescens 8866 и P. putida F1, в то время как культура гриба M. citricolor оказалась менее чувствительной к этому ТВ [9,13]. Светящийся глобулярный мицелий A. mellea и Mycena citricolor был использован в качестве тест-объектов британскими и новозеландскими исследователями [9,10,13]. При использовании биотестов на основе светящихся грибов для определения токсичности фенолов и солей тяжелых металлов показано, что для светящихся грибов падение люминесценции на 50 % (ЕС50) после действия фенолов и меди было того же порядка, что и для бактериальных биотестов [10]. Известны успешные попытки получить рекомбинантные светящиеся грибы Neurospora sp., and Aspergillus sp, содержащие гены люциферазы веслоногого рачка рода Gaussia и фотопротеина обелина для создания биосенсора [18]. Генетически модифицированные биолюминесцентные грибы Aspergillus awamori с геном рекомбинантного экворина были использованы для определения изменения концентрации ионов кальция под воздействием различных ТВ [19]. Несмотря на значительное число работ, посвященных исследованиям люминесценции высших грибов, механизмы их свечения пока остаются не расшифрованными, в отличие от биолюминесцентной системы бактерий. Противоречивы мнения относительно структурно-функциональной организации люминесцентных систем светящихся высших грибов и структуре люцифераз и люциферинов светящихся грибов [5,10-26]. Изучение именно этих вопросов представляет не только фундаментальный академический интерес, но и имеет очевидное практическое значение для использования светящихся грибов для биолюминесцентной аналитики. Исходя из этого, значительное внимание на данном этапе работы было уделено также изучению биохимических аспектов люминесценции светящегося гриба Neonothopanus nambi, как основного объекта исследований. |
Похожие:
 | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
 | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Санкт-петербургский государственный электротехнический университет «лэти» им. В. И. Ульянова (ленина) | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... «Разработка новых методов индивидуальной коррекции сводно-радикального статуса при бактериальных инфекциях» |
