Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России»
Скачать 1.18 Mb.
|
2.5. Регистрация свечения мицелия грибовДля измерения биолюминесценции образцов мицелия использовали кюветные люминометры (модель БЛМ 8801 и модель БЛМ 8802) отечественного производства (СКТБ «Наука», Красноярск, Россия), калиброванные по радиоактивному стандарту Гастингса-Вебера (одна люминесцентная единица составляет 108 фотонов в 1 секунду). Люминесцентные сигналы регистрировали с помощью самописца (модель 2210) фирмы «LKB» (Швеция). Для ряда исследований использовали также планшетный люминометр (модель Luminoscan Ascent) фирмы «ThermoElectron Co» (Финляндия). Для регистрации спектра люминесценции гриба N. nambi использовали спектрофлуориметр (модель Aminco-Bowman, Series 2 luminescent spectrometer) фирмы Thermo Spectronic (USA). 2.6. Влияние модельных токсикантов на биолюминесценцию грибовВ качестве модельных токсикантов использовали водные растворы солей, в том числе тяжелых металлов: Na2WO4, NiSO4, CoCl2, (NH4)2MoO4, CrSO4, ZnSO4, Li2SO4, AlCl3, MnCl2, CsCl, CdSO4*8H2O, SnCl2, HgCl2, ацетата свинца Рb(ОСОСН3)2, а также бензохинона, фенантренхинона (PNQ), 5-амино-2-3 дигидро- 1,4-фталазиндиона (A-DHFD) и 1,2-нафтохинон- 4-сульфоновой кислоты (NQ-SA) в концентрациях 10-5, 10-4, 10-3, 10-2, 10-1, и 1 мг/мл. Эксперименты по действию токсикантов проводили при наличии видимого свечения мицелия грибов рода Armillaria, выращенных на агаризованной среде Сабуро при комнатной температуре. Измерения проводили на кюветном люминометре БЛМ-8802 (Красноярск, СКТБ Наука) и на планшетном люминометре Luminoscan Ascent «ThermoElectron Co», (Финляндия). Кусочки агаризованной среды площадью около 3×3 мм2 с растущей светящейся культурой грибов помещали в лунки планшета (куда предварительно для предотвращения высыхания агара вносили 50 мкл стерильной дистиллированной воды), после чего измеряли исходную интенсивность люминесценции. После добавления 200 мкл исследуемого вещества в лунки с культурой повторно измеряли люминесценцию через 5, 10, 15, 20, 25 и 30 мин. В контрольных вариантах вносили 200 мкл дистиллированной воды. Действие токсикантов на свечение мицелия грибов N.nambi, выращенных при температуре 25-27оС на жидкой среде с картофельным отваром, регистрировали после выдерживания мицелиальной пленки в дистиллированной воде не менее 2 суток, чтобы создать условия стабильного высокого уровня свечения. Токсичность исследуемых растворов оценивали по величине биолюминесцентного индекса (BI), который рассчитывали по формуле: BI=Io/Ik, где Io – нормированное относительно исходного значение интенсивности свечения грибного мицелия в опыте, Ik – нормированное относительно исходного значение интенсивности люминесценции грибного мицелия в контроле. Нормированные значения рассчитывали по отношению к исходному свечению. Растворы исследуемых веществ считали токсичными, если отклонение величины биолюминесцентного индекса от 1 (нормированное значение контроля) превышало 20% . Раздел 3. Изучение молекулярно-клеточного механизма биолюминесценции грибов 3.1. Разработка оптимальной среды для поддержания стабильного и длительного излучения грибных систем.
Отбор, культур грибов для создания перспективных тест систем и биосенсоров включал несколько этапов. На первом этапе критерием отбора было различимое, невооруженным глазом свечение образцов мицелия или базидиом гриба (Рис. 3.1.1.).   Рис. 3.1.1. Культуры светящихся грибов при дневном свете и в темноте На этом этапе из всех доступных источников было отобрано 11 культур (8 видов): - из Коллекции культур базидиомицетов Ботанического Института им. В.Л. Комарова РАН, Санкт-Петербург: 1043 Armillaria gallica - Пермская область, Россия 0350 A. mellea – Ленинградская область, Россия 0356 A. mellea – Минская область, Беларусь 0358 A. mellea – Богемия, Чешская республика 0918 A. mellea – Иркутская область, Россия 0491 Lampteromyces japonicus, Англия - из частной коллекции Dao Thi Van (BIO-LUMI Co., Ltd., Ho Chi Minh City, Vietnam) Omphalotus af. illudent – Провинции Бинь Фыок (Binh Phuoc) и Бинь Зыонг (Binh Duong), Южный Вьетнам - из Коллекции культур Института леса СО РАН (Красноярск) Armillaria borealis. - из образцов плодовых тел светящихся грибов собранных в экспедиционной поездке по Южному Вьетнаму Roridomyces roridus Mycena sp. Filoboletus manipularis На втором этапе культуры сравнивали по интенсивности и продолжительности свечения грибного мицелия. По этим параметрам культуры Armillaria borealis и Omphalotus af. illudent имели наилучшие показатели. Таксономическое положение и фото базидиом этих видов в естественных условиях даны на рисунках 3.1.2 и 3.1.3.
Рис. 3.1.2. Внешний вид и таксономическое положение гриба Armillaria borealis Дереворазрушающий гриб Armillaria borealis (опенок осенний северный). Базидиомы диаметром 2 − 8,5 см. от желтовато-коричневого до ярко-охристого цвета. Ризоморфы дихотомически разветвленные до 3-5 мм в диаметре. Распостранен в Северной Европе, Скандинавии, России. Встречается как на лиственных, так и хвойных деревьях. Часто является возбудителем комлевой гнили растущих деревьев (англ. - butt rot): гниль, поражающая комель. Сравнительно недавно выделен в обособленный вид. Ранее его рассматривали как морфологический вариант гриба Armillaria mellea (Vahl: Fr.) Kumm. [29]. У данного вид, как и у других представителей рода Armillaria, светится только мицелий в зоне роста (обычно это край колонии). На агаровых средах колония растет относительно медленно. Линейная скорость роста составляет в среднем 0,75 мм за сутки.
Рис. 3.1.3. Внешний вид и таксономическое положение гриба Omphalotus af.illudent. Согласно описанию (Dao, 2002; 2006) плодовые тела гриба O. af. illudent встречаются на стволах погибших деревьев гевеи (Hevea brasiliensi) в Южных провинциях Вьетнама. Базидиомы этого вида белого цвета диаметром 2,5 – 5 см. Споровый порошок белого цвета. Споры имеют яйцевидную форму 1,8-2 x 1,2-1,3 μ в диаметре. Свечение наблюдается в фазе замедления или/и после прекращения роста. Светится и мицелий, и базидиомы (плодовые тела). Максимальная интенсивность свечения отмечена на питательной среде, один литр которой содержит 20 г глюкозы 50 г сухого дрожжевого экстракта, 1,6 мл 1N HCl и 15 г агара. Для выращивания гриба Dao Thi Van [30,31] рекомендует использовать более богатые питательные среды, приготовленные на основе дрожжевого сусла с добавлением глюкозы и пептона. Линейная скорость роста мицелия на этих средах составляет 3-3,5 мм за сутки. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Похожие:
 | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
 | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Санкт-петербургский государственный электротехнический университет «лэти» им. В. И. Ульянова (ленина) | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... «Разработка новых методов индивидуальной коррекции сводно-радикального статуса при бактериальных инфекциях» |
