Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России»
Скачать 1.18 Mb.
|
2.2. Культивирование грибов2.2.1. Способы культивирования
2.2.2. Питательные средыПитательные среды стерилизовали 30 мин при 1 атм. Основные среды, используемые для выращивания светящихся грибов:
Для приготовления отвара пшеничное зерно замачивали в воде (1 кг на 2 литра), нагревали, кипятили в течение 10-15 минут, не допуская разваривания зерна, затем настаивали в течение часа при комнатной температуре. По окончании жидкость – отвар пшеничного зерна, фильтровали и стерилизовали. Перед употреблением концентрат отвара разводили в 2,5 - 3 раза.
Для приготовления субстрата опилки вымачивали в 1 - 0,5 % растворе извести в течение суток. Затем к 1 кг влажных опилок добавляли 20 г на кукурузного экстракта, 3 г сернокислого аммония, 2 г MgSO4×7H2O, и 1 г KH2PO4. Субстрат помещали в пластиковые мешки, общей массой общей массой 1 кг. 2.2.3. Определение показателей роста и свечения мицелия грибов.Влияние органических и неорганических соединений на рост мицелия грибов оценивали стандартными методами путем измерения радиальной скорости роста (Kr) колоний на поверхности агаризованой среды в период линейной фазы роста (рис.2.1.1).  Рис. 2.1.1 Фазы роста колонии гриба на поверхности агаровой среды. Культуры грибов выращивали в чашках Петри в термостате при 28оС. Для каждого варианта использовали пять чашек (пять повторностей). Колонии измеряли один раз в сутки в течение 7-10 суток подряд. По окончании каждой серии измерений определяли среднюю величину Kr, стандартное отклонение и доверительные интервалы. Затем в течение 15- 20 суток продолжали фиксировать интенсивность свечения мицелия. Интенсивность свечения оценивали в относительных единицах с помощью люминометра, а также визуально. Дополнительно учитывали плотность мицелия, выделение окрашенных экссудатов и другие проявления активности культуры гриба. 2.3. Молекулярная идентификация культуры светящихся грибовУточнение видовой принадлежности культуры, описанного ранее как Omphalotus af. Illudent, проводили метод ДНК-типирования. Область ITS1-5.8S-ITS2 (Internal Transcribed Spacer = внутренние транскрибируемые спейсеры) геномной рибосомальной ДНК амплифицировали с использованием комбинации праймеров: NS5-fw (5'-TGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3') и NS4-rev (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') [27]. ПЦР-продукты секвенировали и полученные нуклеотидные последовательности ДНК сравнивались с сиквенсами баз данных GenBank в программе BLAST. Амплифицированные ITS фрагменты ДНК использовали в для клонирования и последующего сиквенса, на основании которого был проведен филогенетический анализ полученных клонов. 2.4. Метод атомной абсорбции. (Брицке, 1982)Пробу определенного объема предварительно минерализовали смесью кислот азотной и хлорной при нагревании. Минерализат переносили в мерную колбу и в растворе определяли содержание металлов на атомно-абсорбционном спектрофотометре Квант-2а (Россия). Одновременно проводили холостое определение для выяснения чистоты реактивов. Калибровочные графики строили по растворам соответствующих солей металлов. Растворы готовили из государственных стандартных образцов. 1. Калий и натрий определяли из тех же минерализатов, но методом пламенной фотометрии на пламенном фотометре Flapho ( Карал Цейс, Германия). 2. Липиды экстрагировали смесью растворителей хлороформ-изопропанол в соотношении 1:1 по объему. Метиловый эфиры жирных кислот (МЭЖК) получали после кислотного метанолиза липидов. Метанолиз липидов проводили в смеси метанола и серной кислоты (50:1 по объему) при температуре 900 С в течение двух часов на водяной бане, используя обратный холодильник. МЭЖК анализировали на хромато-масс-спектрометре Agilent 5975Inert (Agilent, США), используя капиллярную колонку HP-FFAP длиной 30 м и внутренним диаметром 0.25 мм. Условия хроматографирования: газ-носитель – гелий, скорость 1 мл/мин; температура ввода проб – 220 0 С, начальная температура хроматографирования 1200 С, подъем температуры до 1900 С со скоростью 30 С/мин, 5 мин изотермальный режим, и далее до 2300 С со скоростью 100 С/мин и 20 мин иотермальный режим: температура интерфейса - 2400 С, температура ионного источника -1750 С; режим электронного удара при 70 eV; режим сканирования фрагментов от 45 до 450 m/z при 0.5 с/сек. Положение двойных связей в ненасыщенных ЖК устанавливали по масс-спектрам диметилоксазолиновых производных (ДМОЗ) жирных кислот. ДМОЗ были приготовлены следующим образом: 0.2 мл 2-амино-2-метил-1- пропанола было добавлено к омыленным липидам, через раствор пропускался гелий, колба плотно закрывалась и нагревалась до 1900 С в течение 2 часов. Затем к реакционной смеси добавлялось 2 мл дистиллированной воды, раствор подкисляли, ДМОЗ экстрагировали смесью гексана-ацетона (96:4 по объему). 3. Анализ аминокислот. 50 мг пробы переносили в ампулу из толстого стела 12х120 мм и добавляли 20 мл 6N HCl. Ампулу запаивали, гидролиз сухого остатка проводили в термостате при 1100С в течение 22 часов. После гидролиза содержимое ампулы охлаждали, фильтровали и переносили в выпарительную чашку. Выпаривание производили на кипящей водяной бане. Сухой остаток растворяли в 20 мл буфера рН 2.2, отбирали 1900 мкл и добавляли 100 мкл диметилсульфоксида (ДМС). 100 мкл раствора пропускали через специальный патрон для очистки раствора аминокислот от примесей. Патрон промывали 1000 мкл буфера (буфер рН2.2 + 5% (ДМС). Анализ проводили на аминокислотном анализаторе A0326V2 (Knauer, Германия). На колонку А0992-13vl наносили 20 мкл образца, разделение аминокислот проходило в градиенте температуры и элюента по прописи, предлагаемой фирмой. Задание условий хроматографирования, расшифровку хроматограмм по предлагаемому фирмой стандарту и обсчет результатов проводили по специальной программе, прилагаемой к прибору. 4. Выделение иллудина из биомассы грибов проводили по методу [28], анализ этой фракции проводили на хромато-масс-спектрометре Agilent 5975Inert (Agilent, США) на колонке HP-5S. |
Похожие:
 | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
 | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Санкт-петербургский государственный электротехнический университет «лэти» им. В. И. Ульянова (ленина) | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... «Разработка новых методов индивидуальной коррекции сводно-радикального статуса при бактериальных инфекциях» |
