Роль молекул оксида азота в программированной гибели нейтрофилов при окислительном стрессе
Скачать 343.37 Kb.
|
Таблица 2 Распределение здоровых доноров и пациентов с острыми воспалительными заболеваниями в соответствии с использованными методами исследования влияния NO на реализацию апоптоза нейтрофилов в условиях окислительного стресса
Нейтрофилы выделяли из гепаринизированной венозной крови путем центрифугирования в двойном градиенте плотности Ficoll-Paque (ρ=1,077 г/см3) («GE Healthcare», Швеция) и Ficoll-урографина (ρ=1,095 г/см3) (урографин – «Schering», Россия). Клетки культивировали в полной питательной среде [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992] в стерильных пенициллиновых флаконах (для определения концентрации конечных метаболитов оксида азота, содержания белков Bcl-2, Bax, концентрации цАМФ и цГМФ в нейтрофилах) и 96-луночных круглодонных иммунологических планшетах (для определения числа аннексин-положительных клеток, концентрации внутриклеточных АФК и цитоплазматического кальция методом проточной лазерной цитометрии) в течение 18 ч при температуре 37º С и 5 % СО2. Методом лазерной проточной цитометрии с использованием цитометра Epics XL («Beckman Coulter», Франция) оценивали число аннексин-положительных клеток в культуре, содержание АФК и Са2+ в нейтрофилах. Оценка реализации программированной гибели нейтрофилов крови осуществляли с помощью набора реагентов «ANNEXIN V FITC» («Beckman Coulter», Франция) методом, основанным на способности аннексина V, меченного флуоресцеин изотиоцианатом, связываться с фосфатидилсерином, появляющимся на мембране клеток при запуске программы апоптоза [Van Engeland M. et al., 1998]. Концентрация внутриклеточных АФК определялась с помощью красителя с заблокированной флуоресценцией – дихлорфлюоресцеина диацетата («Sigma», США) [Bass D.A. et al., 1983]. Оценка концентрации ионов кальция в цитоплазме нейтрофильных лейкоцитов проводилась методом, основанным на определении интенсивности флуоресценции липофильного зонда Fluo 3 AM («MP Biomedicals TM», США), проникающего в клетку и связывающего ионы кальция [Merritt J.E. et al.,1990]. Спектрофотометрический метод определения содержания нитритов в супернатантах был основан на цветной реакции с реактивом Грисса (1 % сульфаниламид («MP», США), 0,1 % нафтилендиамин («MP», США), разведенные в 12 % уксусной кислоте) [Green L.C. et al., 1982]. Определение содержания циклических нуклеотидов цАМФ и цГМФ в нейтрофилах крови проводили с использованием метода конкурентного твердофазного радиоиммунного анализа [Yallow R.S., Berson S.A., 1970], при помощи наборов «RIA AMPc/cAMP» и «RIA сGMP» («Immunotech», Франция). Методические детали проведения радиоконкурентного анализа описаны в протоколах фирмы-изготовителя для каждого радиоиммунного комплекта. С помощью метода вестерн-блоттинга в нейтрофилах определяли содержание белков Bcl-2 и Bax [Towbin H. et al., 1979]. Клеточные экстракты получены путем лизиса клеток в фосфатно-солевом буфере, содержащем 50 мМ трис-НCl буфер (рН=6,5), 100мМ дитиотреитол, 2% SDS, 0,1% бромфеноловый синий, 15% глицерол («Helikon», США), смесь протеазных ингибиторов («Sigma», США). Белки разделяли по молекулярной массе под действием электрического поля в течение 60 мин при напряжении поля 120 В. Для последующего исследования белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану («Bio-Rad», США). Перенос белков осуществлялся электрофоретически в течение 90 мин при силе тока 60 мА. В качестве стандарта и внутреннего контроля использовали белок глицеро-3-фосфат-дегидрогеназу (антитела фирмы «Chemicon», США), выражая содержание белка Вах как отношение сигнала определяемого белка к сигналу белка глицеро-3-фосфат-дегидрогеназы в исследуемых образцах. При оценке полученных данных были использованы методы статистического описания и проверки статистических гипотез [Лакин Г.Ф., 1980]. Для каждой выборки вычисляли средневыборочные характеристики: среднее арифметическое, среднее квадратичное отклонение и ошибка среднего или медиана, первый и третий квартили. Проверку нормальности распределения количественных показателей проводили с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. При соответствии нормальному закону распределения признака в исследуемых выборках проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин осуществляли с использованием t-критерия Стьюдента. В случае отсутствия согласия данных с нормальным распределением для оценки различий между зависимыми выборками применяли непараметрический критерий Вилкоксона. С помощью рангового критерия Манна-Уитни оценивали достоверность различий независимых выборок. Наличие связи между изучаемыми показателями проводили с использованием корреляционного анализа по методу Спирмена. Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Особенности программированной гибели нейтрофилов крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении Отсутствие в научной литературе данных, свидетельствующих об изменениях метаболизма нейтрофилов в зависимости от концентрации перекиси водорода in vitro, наличие различных способов индикации фенотипических проявлений апотоза и некроза определили задачу экспериментального подбора оптимальной концентрации Н2О2, способной эффективно индуцировать как развитие окислительного стресса (ОС), так и программированную гибель нейтрофильных лейкоцитов. Для моделирования окислительного стресса in vitro нейтрофилы, полученные у здоровых доноров, инкубировали с перекисью водорода в конечной концентрации 1, 5, 10 и 50 мМ. В ходе проведенного нами исследования было установлено, что Ооптимальной конечной концентрацией Н2О2, вызывающей нарастание внутриклеточной продукции АФК и индуцирующей апоптоз наибольшего числа нейтрофильных лейкоцитов, но не стимулирующей развитие некротических изменений нейтрофилов, является 5 мМ (рис 1). В ходе дальнейших исследований именно эта концентрация была использована для моделирования ОС in vitro. В ходе выполненного нами исследования, для подтверждения адекватности выбранной нами модели окислительного стресса было проведено сравнение внутриклеточного содержания АФК в условиях экспериментальной модели окислительного стресса (5 мМ Н2О2) и при остром воспалении. В данных группах количествоБыло выявлено, что содержание АФК в культуре нейтрофильных лейкоцитов лейкоцитах, полученных у больных внебольничной пневмонией (0,653(0,574–0,728) усл.ед.) и острым аппендицитом (0,673(0,561–0,690) усл.ед.)) значимо превышало контрольные величины (р<0,05) и статистически не отличалось от значений в экспериментальной модели (р>0,05). Этот факт, на наш взгляд, свидетельствует друг от друга. Отсутствие различий по уровню концентраций внутриклеточных АФК в клетках, культивируемых с 5 мМ перекисью водорода и клетках, полученных от больных с острым воспалением, свидетельствует об адекватности использованной в работе модели ОС и подобранной концентрации Н2О2 для имитации поведения нейтрофилов при развитии острого воспаления. Отсутствие различий содержания внутриклеточных АФК в нейтрофилах у больных острым аппендицитом и внебольничной пневмонией позволило нам объединить пациентов в одну клиническую группу с острым воспалительным процессом.  Рис. 1. Содержание внутриклеточных АФК, количество аннексин-положительных и некротизированных клеток в культуре нейтрофильных лейкоцитов при инкубации с разными концентрациями перекиси водорода Сходная ситуация отмечается отмечалась при сравнении количества аннексин-положительных клеток в этих экспериментальной и клинических группахах, что указывает на близкий механизм активации апоптоза нейтрофилов, культивируемых в присутствии 5 мМ перекиси водорода in vitro, и нейтрофилов, полученных у больных с острым воспалением. Число апоптотических апоптотически измененных клеток в культуре нейтрофилов, полученных у пациентов с внебольничной пневмонией (62,37(54,25–69,20)%) и у больных острым аппендицитом (57,40(51,37–62,37)%), достоверно превышает превышало контрольную величину (р<0,05) и не отличалось от его значения при экспериментальном ОС (р>0,05). Количество клеток с пермеабилизированной мембраной в культуре нейтрофилов, полученных у больных внебольничной пневмонией (5,50(4,30–6,50) %), статистически превышало (p<0,05) контрольную величину; значения данного параметра в культуре нейтрофильных лейкоцитов, выделенных из крови у больных острым аппендицитом (4,20(3,80–5,70)%), оставалось в пределах контрольных величин (р>0,05). В нашем проведенном нами исследовании влияние АФК на развитие апоптоза нейтрофилов подтверждается подтверждалось наличием положительной корреляции между увеличением внутриклеточного уровня АФК и возрастанием количества аннексин-положительных клеток в культурах нейтрофилов, полученных у здоровых доноров при индукции ОС 5 мМ Н2О2 (r=0,89, p<0,05), а также в клетках, полученных у больных острыми воспалительными заболеваниями (r=0,71, p<0,05). 2. Влияния оксида азота на апоптоз нейтрофилов крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении Известно, что оксид азота является, с одной стороны, одним из компонентов окислительного стресса, с другой – важнейшим медиатором клеточного метаболизма [Зенков Н.К., и соавт., 2001 Tuteja N. et al., 2004]. Для установления роли NO в механизмах регуляции апоптоза нейтрофилов при окислительном стрессе в параллельных экспериментах клетки культивировали в присутствии индуктора или ингибитора NO-синтазы. Изучение концентрации конечных метаболитов NO в среде инкубации нейтрофилов показало, что под действием 5 мМ Н2О2 происходит статестически значимое увеличение продукции оксида азота по сравнению с интактной культурой (p<0,05), что в целом согласуется с данными литературы [Thomas S. R., 2002] (рис. 2). Оценка концентрации метаболитов оксида азота в культуре нейтрофилов, полученных у пациентов с острым воспалением, выявила увеличение значений исследованного показателя в 1,5 раза по сравнению с таковыми в интактной культуре клеток у здоровых доноров (р<0,05) и в 1,3 раза по сравнению со стресс-контролем (р<0,05) (рис. 2). Было установлено, что при культивировании нейтрофилов в присутствии L-аргинина способствует повышению концентрации метаболитов NO достоверно повышается. Культивирование нейтрофильных лейкоцитов с L-NAME приводило к снижению концентрации метаболитов оксида азота при экспериментальном ОС до контрольных значений. При работе с нейтрофилами, полученных у больных острыми воспалительными заболеваниями, воздействие ингибитора NO-синтазы приводило к снижению концентрации метаболитов NO до базового уровня, характерного для клеток при остром воспалении. Данный факт свидетельствует о запуске как ферментативного, так и неферментативного механизмов наработки оксида азота, нечувствительных к воздействию L-NAME, в условиях воспалительного процесса [Реутов В.П. и соавт., 1998; Меньщикова Е.Б. и соавт., 2000; Beltran B. et al. 2000, 2002]. В результате проведенного исследования было установлено, что L-аргинин не влияет на содержание АФК в цитозоле нейтрофилов ни при ОС in vitro, ни у пациентов с острыми воспалительными заболеваниями. Увеличение уровня АФК отмечалось лишь при добавлении ингибитора NO-синтазы в условиях экспериментального окислительного стресса (р<0,05). При оценке количества апоптотически измененных клеток оказалось, что L-аргинин эффективно снижал число аннексин-положительных нейтрофилов в культурах с моделированием ОС in vitro до уровня, не отличавшегося от контрольных значений (р>0,05). Исследование чувствительности нейтрофилов крови, полученных у больных с острым воспалением, к воздействию индуктора синтеза оксида азота не позволило выявить изменений количества апоптозных клеток по сравнению с культурой нейтрофилов, полученных у больных острыми воспалительными заболеваниями, не подвергавшейся воздействию L-аргинина (рис. 2). Предположение о влиянии оксида азота на развитие апоптоза нейтрофилов подтверждается существованием обратной зависимости, выявленной при проведении корреляционного анализа, между концентрацией метаболитов NO в нейтрофилах и числом аннексин-положительных клеток в культурах нейтрофилов у здоровых доноров при индукции ОС 5 мМ Н2О2 (r =-0,83, p<0,05) и в клетках, полученных у больных острыми воспалительными заболеваниями (r =-0,59, p<0,05). Воздействие L-NAME на нейтрофильные лейкоциты, полученные у больных с острыми воспалительными заболеваниями, сопровождалось увеличением числа аннексин-положительных клеток в 1,2 раза по сравнению с базовым уровнем (р<0,05) (рис. 2). Подводя итог, можно сделать вывод о протекторной роли NO в регуляции программированной клеточной гибели нейтрофилов в условиях ОСокислительного стресса. Однако полученные результаты не позволяют однозначно ответить на вопрос, является ли оксид азота протекторным агентом непосредственно или стимулятором механизмов, защищающих клетку от повреждения. Установление молекулярных механизмов реализации апоптотической гибели в ответ на повышение или снижение концентрации оксида азота в клетке в условиях окислительного стресса является важной теоретической и практической задачей. Исследования в этом направлении позволят не только сделать выводы о влиянии NO на апоптоз нейтрофилов в условиях экспериментального окислительного стресса, но и предположить схожие механизмы участия оксида азота в развитии гибели нейтрофилов в очаге воспаления. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Похожие:
 | Роль молекул оксида азота в программированной гибели нейтрофилов при окислительном стрессе Работа выполнена в гоу впо «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному... | | Зависимость заболеваний сердечно-сосудистой системы от содержания вредных веществ в воздухе Из рис. 1 видно, что при 1,5 резко увеличивается выброс оксида углерода и углеводородов, при 1,5 повышается содержание в... |
 | К. Н. Зеленин Военно-медицинская академия, Санкт-Петербург Рассматриваются вопросы химии и практических приложений оксида азота(II). Обсуждаются различные аспекты участия этого вещества в... | | Регуляция I и II типов программированной клеточной гибели т-лимфоцитов... Работа выполнена в нил биохимии нуклеиновых кислот кафедры биохимии фгаоувпо «Казанский (Приволжский) федеральный университет», г.... |
| Лазебная Е. О. Реадаптация личности при посттравматическом стрессе Лазебная Е. О. Реадаптация личности при посттравматическом стрессе. – М.: Ноу впо “Институт психоанализа”, 68 с | | Способ получения мембран на основе оксида алюминия Способ получения мембран на основе оксида алюминия осуществляют следующим образом. Подготовленный образец алюминия подвергают первичному... |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цель: рассмотреть генетическую связь соединений азота, охарактеризовать положение азота в таблице Менделеева, рассмотреть состав... | | Продукция оксида азота мононуклеарами крови у больных лекарственно-чувствительным... У больных лекарственно-устойчивым тл до и после проведения курса интенсивного лечения секреция no• моноцитами крови снижалась и увеличивалась... |
| Рефератов по дисциплине «экология» Искусственное загрязнение. Оксиды азота. Методы снижения образования оксидов азота | | "Роль биологического азота в азотном балансе почв" В практической части представлены результаты опыта по учету численности микроорганизмов в дерново-подзолистой почвы |
| Механизмы гибели клеток при действии оливомицина и его производных | | Рекомендации по подавлению чувства тревоги при выступлении Ему важно, как воспримут его и его речь. Оказаться в таком положении – это большой стресс, а инстинкт говорит нам, что при стрессе... |
| Темы рефератов по дисциплине Строение вещества для группы ах-07-1 Татевский В. М. Строение молекул и физико-химические свойства молекул и веществ. М.: Изд. Московского университета, 1993 | | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цель: Проследить связь важнейших соединений азота, роль аммиака, азотной кислоты в окислительно-восстановительных процессах, специфические... |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цели урока изучить нахождение азота в природе и его свойства, вскрыть причинно-следственные связи “строение–свойства” и “свойства–применение”,... | | Тематическое планирование Физика 8 класс Примеры тепловых и электрических явлений. Повторение понятий: механическое движение, траектория, пройденный путь, скорость. Особенности... |
