Роль молекул оксида азота в программированной гибели нейтрофилов при окислительном стрессе

3. Молекулярные механизмы развития управления апоптоза нейтрофилов крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении ДДля определения молекулярных мишеней воздействия оксида азота при реализации программируемой программированной гибели нейтрофилов нами поставлена задача оценки необходимо проследить причинно-следственные следственных связей каскадных реакций передачи внутриклеточных сигналов. Для исследования регуляторной роли оксида азота нами изучены изменения концентрации внутриклеточных мессенджеров (цГМФ, цАМФ, Ca2+) в нейтрофильных гранулоцитах при развитии окислительного стресса. Выявление молекулярных механизмов реализации апоптотической гибели в ответ на повышение или снижение концентрации оксида азота в клетки в условиях ОС является важной теоретической и практической задачей. Данные исследования позволят сделать выводы о влиянии NO не только на апоптоз нейтрофилов периферической крови, но и предположить подобный сценарий при развитии клеточной гибели нейтрофилов в очаге воспаления. Исследование концентрации цАМФ и цГМФ в нейтрофилах у здоровых доноров, проведенное с помощью радиоиммунного метода, выявило, что данный показатель составл (114,13(101,96–120,55) нМ/106 кл) и (12,25(10,48–17,04) нМ/106 кл), соответственно. При количественной оценке содержания цАМФ и цГМФ в клетках, подвергшихся воздействию 5 мМ перекиси водорода, было установлено, что концентрация цАМФ возрастала в 1,2 раза (р<0,05), а концентрация цГМФ, напротив, снижалась в 3,0 раза (р<0,05), что приводило к существенному увеличению соотношения циклических нуклеотидов по сравнению с контрольными значениями в 3,4 раза. Определение концентрации цАМФ в нейтрофилах, полученных у больных с острым воспалением, показало, что значения данного параметра были достоверно ниже аналогичных не только в интактной культуре нейтрофильных гранулоцитов, но и в группе стресс-контроля – в 1,3 и 1,5 раза, соответственно (р<0,05). Содержание цГМФ также было ниже соответствующего параметра в контроле (р<0,05), достигая при этом уровня, близкого к таковому в случае воздействия на клетки in vitro 5 мМ перекиси водорода (рис. 2). Выраженное снижение концентрации цГМФ в нейтрофилах, полученных у больных острыми воспалительными заболеваниями, обеспечивало увеличение (в 2 раза) отношения концентраций цАМФ/цГМФ в клетке. Увеличение отношения содержания цАМФ и цГМФ при активации программированной клеточной гибели нейтрофилов, по всей видимости, носит защитно-приспособительный характер. Данные о влиянии цАМФ на апоптоз относительно малочисленны и свидетельствуют о тканеспецифическом характере регуляции программированной клеточной гибели системой циклических нуклеотидов [Chang H.S. et al., 2000; Kato T. et al., 2006]. Возможная биологическая роль повышения содержания цАМФ в нейтрофилах, полученных у больных острыми воспалительными заболеваниями, связана со способностью данного циклического нуклеотида подавлять фагоцитоз нейтрофилов макрофагами в очаге воспаления [Rossi A.G. et al., 1998]. Культивирование нейтрофилов с 500 мкМ L-аргинином в условиях окислительного стресса in vitro приводило к достоверному снижению внутриклеточного содержания цАМФ (р<0,05) и увеличению концентрации цГМФ в нейтрофилах до контрольных значений (р>0,05). Трехкратное увеличение содержания цГМФ в нейтрофильных гранулоцитах относительно базового уровня приводило к снижению отношения цАМФ/цГМФ до значений контрольной группы. Воздействие индуктора синтеза оксида азота на нейтрофилы, полученные у больных острыми воспалительными заболеваниями, не приводило к изменению концентрации цАМФ относительно собственного базового уровня (р>0,05), но сопровождалось увеличением содержания цГМФ в клетках в 2,3 раза (р<0,05), что также приводило к снижению отношения цАМФ/цГМФ. Повышение содержания цГМФ, на наш взгляд, может быть напрямую связано со стимуляцией растворимой гуанилатциклазы оксидом азота [Hanafy K. A., 2001; Bian K., 2006]. Приведенная выше интерпретация результатов собственных исследований и анализ данных, полученных другими авторами, позволили высказать предположение, что Мы предполагаем, что оксид азота за счет повышения внутриклеточного содержания цГМФ снижает соотношение циклических нуклеотидов до значений близких к контрольным значениям, тем самымсамым,, стабилизируя метаболизм нейтрофилов и продлевая жизнь клетки. Культивирование нейтрофилов с 500 мкМ L-NAME в условиях окислительного стресса in vitro приводило к достоверному снижению концентрации цАМФ и цГМФ в нейтрофилах в (1,5 и 3,0 раза, соответственно) (р<0,05) (рис. 2), что, однако, сопровождалось увеличением отношения цАМФ/цГМФ в данных клетках. Воздействие ингибитора NO-синтазы на нейтрофильные гранулоциты, полученные у больных острыми воспалительными заболеваниями, сопровождалось снижением содержания цАМФ и цГМФ (в 1,4 и 1,6 раза относительно базового уровня, соответственно) (р<0,05) (рис. 2) и увеличением отношения концентраций циклических нуклеотидов. Увеличение отношения концентраций цАМФ/цГМФ, отмеченное нами в нейтрофильных лейкоцитах, культивированных в присутствии 5 мМ Н2О2 перекиси водорода и ингибитора NO-синтазы, может быть связано с токсическим влиянием Н2О2 на аденилатциклазу и гуанилатциклазу. Токсическое влияние перекиси водорода во многом усиливается при отсутствии стабилизирующего влияния оксида азота на электронно-транспортную цепь митохондрий [Beltran B. et al. 2000, 2002]. Введение L-NAME в культуральную среду приводило к росту концентрации внутриклеточных АФК и усугубло развитие ОС. Изменение баланса циклических нуклеотидов, отмеченное нами при культивировании нейтрофилов, полученных у больных острыми воспалительными заболеваниями, с селективным ингибитором NO-синтазы, происходило на фоне увеличения числа нейтрофилов, вступивших на путь апоптоза. Вероятно, что повышение отношения внутриклеточной концентрации циклических нуклеотидов при развитии программированной гибели нейтрофилов носит транзиторный характер, связанный с нормализацией клеточного метаболизма и предотвращением клеточной гибели. Как показали результаты исследования, направленного на определение концентрации кальция в цитоплазме нейтрофилов крови, значения данного показателя в интактных клетках у здоровых доноров составили (0,220(0,114–0,234)усл.ед.). Добавление в культуральную среду 5 мМ перекиси водорода приводило к двукратному повышению содержания Ca2+в нейтрофилах нейтрофилах крови ) по сравнению с соответствующим параметром в контроле (р1<0,05) (рис.2). а) б) в) г) д) е) 1 – интакные нейтрофилы 2 – нейтрофилы, культивированные с 5 мМ Н2О2 3 - нейтрофилы, культивированные с 5 мМ Н2О2 и L-аргинином 4 - нейтрофилы, культивированные с 5 мМ Н2О2 и L-NAME 5 – нейтрофилы, полученные у больных с острыми воспалительными заболеваниями 6 – нейтрофилы, полученные у больных с острыми воспалительными заболеваниями и культивированные с L-аргинином 7 – нейтрофилы, полученные у больных с острыми воспалительными заболеваниями и культивированные с L-NAME Рис 2.Нейтрофилы в стадии раннего апоптоза (а), уровень АФК (б) в нейтрофилах, концентрация метаболитов NO в среде инкубации (в), концентрация цАМФ (г), цГМФ (д) и кальция (е) в нейтрофилах По нашим данным, концентрация внутриклеточного кальция в нейтрофильных гранулоцитах, полученных у больных с острыми воспалительными заболеваниями, была достоверно в 1,9 раз ниже аналогичного показателя при индукции окислительного стресса (р<0,05) (рис. 2). Существует множество данных о взаимосвязи систем наработки и утилизации АФК с изменением уровня свободного кальция в клетке [Yermolaieva O. et al., 2000, 2003]. Повышение уровня внутриклеточного кальция в нейтрофилах при воздействии 5 мМ Н2О2 объясняется стимулирующим влиянием АФК на высвобождение Ca2+ из внутриклеточных депо. В то же время ионы Ca2+ вызывают перестройку липидного матрикса мембраны митохондрии, приводящую к дезорганизации компонентов дыхательной цепи и повышению продукции АФК. Культивирование нейтрофилов с 500 мкМ L-аргинином в условиях экспериментального окислительного стресса приводило к снижению концентрации ионов кальция до контрольных значений (р>0,05). При воздействии индуктора синтеза оксида азота на нейтрофилы, полученные у больных острыми воспалительными заболеваниями, отмечалось достоверное повышение (в 1,6 раз) содержания кальция по сравнению с базовым уровнем (p<0,05). Однако концентрация внутриклеточного Ca2+ оставалась значительно ниже по сравнению с данными, полученными при культивировании нейтрофилов той же группы с селективным ингибитором NO-синтазы (р<0,05) и стресс-контролем (р<0,05) (рис. 2). Известно, что митохондрии являются основным депо кальция в клетке. Следовательно, по изменению уровня Ca2+ можно косвенно судить о митохондриальной дисфункции. Возможно, снижение содержания кальция в нейтрофилах под действием NO происходит за счет стабилизирующего влияния оксида азота на проницаемость митохондриальных мембран [Реутов В.П. и соавт., 1998; Brune B., 1999; Beltran B. et al., 2000, 2002]. Наше предположение о подавлении оксидом азота развития апоптотической программы нейтрофилов за счет снижения выхода кальция из митохондрий подтвердилось наличием обратной корреляционной связи между концентрацией метаболитов NO и концентрацией внутриклеточного кальция в клетках стресс-контроля (r=-0,79, p<0,05) и содержанием, полученных у больных острыми воспалительными заболеваниями (r =-0,57, p<0,05). Воздействие селективного ингибитора NO-синтазы на нейтрофильные гранулоциты, полученные у больных острыми воспалительными заболеваниями и в условиях экспериментального ОС, не приводило к изменению концентрации ионов кальция относительно клеток, подвергнувшихся воздействию 5 мМ перекиси водорода (р>0,05). Активные формы кислорода и кальций могут действовать совместно, индуцируя повышение проницаемости внутренней митохондриальной мембраны (образование гигантской РТР-поры). Имеются сведения о способности оксида азота предотвращать открытие гигантской поры митохондрии, блокируя тем самым выход ионов Ca2+, цитохрома с в цитоплазму и предотвращая запуск каспазного каскада [Brookes P.S. et al., 2000]. Проницаемость РТР-пор зависит от соотношения про- (Bax) и антиапоптотического (Bcl-2) белков [Ravagnan L. et al., 1999; Smaili S.S. et. al., 2000]. При оценке содержания проапоптотического белка Вах в нейтрофилах крови, проведенной методом вестерн-блоттинга, было обнаружено отчетливое его увеличение в условиях окислительного стресса in vitro, а также в случае определения этого белка в нейтрофильных лейкоцитах у больных острыми воспалительными заболеваниями. Оценка уровня Вах после воздействия L-аргинина и L-NAME на клетки здоровых доноров, культивированные при действии 5 мМ Н2О2, не выявила изменений значений указанного параметра по сравнению с аналогичным показателем в группе стресс-контроля. Исследование содержания антиапоптотического протеина Bcl-2 в нейтрофилах, проведенное методом вестерн-блоттинга, не выявило указанного белка как в условиях экспериментального стресса, так и при изучении нейтрофилов, полученных у больных с острыми воспалительными заболеваниями. Воздействие L-NAME и L-аргинина не приводило к появлению Bcl-2 в нейтрофилах в условиях окислительного стресса in vitro. Полученные результаты указывают на отсутствие влияния NO на транскрипционные регуляторные механизмы синтеза указанных протеинов. Также оксид азота не изменяет функциональные свойства Вах за счет нитрозилирования, что показано для ряда других белков, локализованных на митохондриальных мембранах [Alonso D. et al., 2002; Daniel P.T. et al., 2003]. В целом, в проведенном нами исследовании был освещен и конкретизирован ряд вопросов, затрагивающих взаимосвязь внутриклеточных сигнальных путей, участвующих в реализации программированной гибели нейтрофилов в условиях окислительного стресса. При этом важная роль в системе вторичных мессенджеров, обеспечивающих нормальную жизнедеятельность и функционирование клетки, принадлежит оксиду азота. Дальнейшая идентификация молекулярных мишеней действия оксида азота позволит создать картину регуляции клеточных функций, что в конечном итоге будет способствовать разработке подходов управления программированной гибелью клетки при широком спектре патологических процессов, сопровождающихся развитием окислительного стресса. ВЫВОДЫ Окислительный стресс, как индуцированный in vitro, так и развивающийся при остром воспалении, сопровождается увеличением продукции нейтрофильными лейкоцитами оксида азота. Оксид азота обладает ингибирующим влиянием на развитие программированной гибели нейтрофилов: культивирование нейтрофильных лейкоцитов с L-аргинином приводит к блокированию развития апоптоза в условиях экспериментального окислительного стресса. Нарушение реализации программированной гибели нейтрофильных лейкоцитов при экспериментальном окислительном стрессе не связано с влиянием молекул оксида азота на баланс про- и антиапоптотических белков. Блокирующее влияние оксида азота на апоптоз нейтрофилов в условиях окислительного стресса in vitro опосредуется через снижение внутриклеточной концентрации ионов кальция и цАМФ, увеличение содержания в клетках цГМФ. Влияние молекул оксида азота на развитие программированной гибели нейтрофильных лейкоцитов при остром воспалении имеет однонаправленный характер с экспериментальной моделью окислительного стресса и сопряжено с увеличением содержания в клетке цГМФ. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Жаворонок Т.В., Носарева О.Л., Помогаева А.П., Бутусова В.Н., Стариков Ю.В. Нарушение физиологического баланса в системе прооксиданты-антиоксиданты при остром воспалении // Тезисы V Сибирского физиологического съезда. – г. Томск, 29-30 июня, 1 июля 2005г. – Бюллетень сибирской медицины. – 2005. – №6, Приложение 1.– С. 174. Жаворонок Т.В., Петина Г.В., Степовая Е.А., Стариков Ю.В., Агеева Т.С., Чудакова О.М., Рязанцева Н.В. Дезадаптивные изменения структурно-метаболических свойств нейтрофилов при острой пневмонии // Материалы научных конференций, симпозиумов, школ, проводимых в ТГУ. – Вестник ТГУ. – 2006. – № 21. – С. 34-35. Жаворонок Т.В., Агеева Т.С., Петина Г.В., Степовая Е.А., Стариков Ю.В., Рязанцева Н.В., Заводовская В.Д., Стракевич Е.Е. Функциональная активность нейтрофилов и оценка окислительной модификации белков при внебольничной пневмонии в зависимости от характера легочного инфильтрата // Материалы XVI Национального конгресса по болезням органов дыхания. – г. Санкт-Петербург, 14-17 ноября 2006. – Санкт-Петербург, 2006. – С. 27. Жаворонок Т.В., Степовая Е.А., Рязанцева Н.В., Петина Г.В., Соколович А.Г., Стариков Ю.В., Дума М.А., Иванов В.В., Горемыкин К.В., Чудакова О.М. Нарушение окислительного метаболизма при острых воспалительных заболеваниях // Клиническая лабораторная диагностика. – 2006. – № 12. – С. 10-14. Zhavoronok T.V., Stepovaya Ye.A., Petina G.V., Starikov Yu.V., Ryazantseva N.V., Ageeva T.S. Evaluation of neutrophilic and erythrocytic proteins’ oxidative modification in oxidative stress conditions // Abstracts 16th ERS Annual Congress - Munich, Germany, 2-6 September 2006. – European Respiratory Journal. – 2006. – Vol. 28. – Supplement 50. – P. ls. Zhavoronok T.V., Stepovaya Ye.A., Ryazantseva N.V., Petina G.V., Starikov Yu.V., Ageeva T.S. Influence of oxidative stress on redox-state and peripheral blood heterophilic leukocytes apoptotic program realization // European journal of natural history. – 2007. – N6. – P. 63-64. Zhavoronok T.V., Starikov Y.V., Ageeva T.S., Ryazantseva N.V., Stepovaya E.A., Bychkov V.A., Mishustin S.P. The effect of NO synthesis modulations on calcium accumulation and neutrophil apoptosis during the community-acquired pneumonia // Abstracts 17th ERS Annual Congress. – Stockholm, Sweden, 15-19 September 2007. – European Respiratory Journal. – 2007. – Vol. 30. – Supplement 51. – P. 34s. Агеева Т.С., Жаворонок Т.В., Тетенев Ф.Ф., Кривоногов Н.Г., Рязанцева Н.В., Завадовская В.Д., Степовая Е.А., Дубоделова А.В., Петина Г.В., Стариков Ю.В., Даниленко В.Ю. Внебольничные пневмонии: клинико-сцинтиграфическая характеристика и окислительный дисбаланс клеток // Клиническая медицина. – 2007. – № 7. – С. 43-48. Тетенев Ф.Ф., Агеева Т.С., Жаворонок Т.В., Кривоногов М.Г., Дубоделова А.В., Петина Г.В., Стариков Ю.В., Рязанцева Н.В., Степовая Е.А. Дополнительные возможности диагностики внебольничной пневмонии // Сибирский медицинский журнал. – 2007. – Т.68, №1. – С. 54-57. Жаворонок Т.В., Петина Г.В., Стариков Ю.В., Агеева Т.С., Степовая Е.А. Тиол-дисульфидная составляющая редокс-регуляции нейтрофилов при внебольничных пневмониях // Материалы II Конгресса терапевтов «Новый курс: консолидация усилий по охране здоровья нации». – г. Москва, 7-9 ноября 2007. – Москва, 2007. – С. 75-76. Жаворонок Т.В., Петина Г.В., Агеева Т.С., Стариков Ю.В., Рязанцева Н.В., Степовая Е.А., Бычков В.А. Окислительный метаболизм и апоптоз нейтрофильных лейкоцитов при внебольничной пневмонии // Материалы XVII Национального конгресса по болезням органов дыхания – г. Казань, 2-5 октября 2007. – Казань, 2007. – С. 128. Жаворонок Т.В., Стариков Ю.В., Рязанцева Н.В., Степовая Е.А., Бычков В.А., Петина Г.В. Механизмы реализации апоптотической программы нейтрофилов при ингибировании и активации синтеза NO в условиях окислительного стресса in vitro // Материалы Международного междисциплинарного симпозиума «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине». – г. Судак, Украина, 17–28 сентября 2007. – Судак, 2007. – С. 46-48. Жаворонок Т.В., Петина Г.В., Стариков Ю.В., Степовая Е.А., Рязанцева Н.В., Агеева Т.С. Оценка окислительной модификации белков и метаболический статус нейтрофилов при внебольничной пневмонии в зависимости от характера легочного инфильтрата // Материалы Всероссийской конференции «Национальные дни лабораторной медицины России 2007». – г. Москва, 10-12 октября 2007. – Клиническая лабораторная диагностика. – 2007. – №9. – С. 85. Стариков Ю.В., Бычков В.А. Влияние оксида азота на реализацию программированной клеточной гибели нейтрофильных лейкоцитов в условиях окислительного стресса in vitro // Материалы Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины». – г. Абакан, 17-19 мая 2007. – Абакан, 2007. – С. 27–29. Жаворонок Т.В., Степовая Е.А., Рязанцева Н.В., Петина Г.В. Стариков Ю.В., Агеева Т.С. Окислительный метаболизм клеток в дебюте внебольничной пневмонии // Материалы XХ Съезда физиологического общества имени И.П. Пирогова – г. Санкт-Петербург, 4-8 июня 2007.– Санкт-Петербург, 2007. – С. 226-227. Стариков Ю.В., Бычков В.А. Влияние оксида азота на апоптоз нейтрофилов в условиях окислительного стресса in vitro // Материалы VII Конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». – г. Томск, 17-18 мая 2007. – Томск, 2007. – С. 200-201. Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Часовских Н.Ю., Старикова Е.Г., Кайгородова Е.В., Стариков Ю.В., Жукова О.Б. Модуляция апоптоза мононуклеаров в условиях окислительного стресса // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2008. – Т. 145, №3. – С. 251-254. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АФК – активные формы кислорода ОС – окислительный стресс цАМФ – циклический аденозин-3',5'-монофосфат цГМФ – циклический гуанозин-3',5'-монофосфат L-NAME – NG-нитро-L-аргинин метиловый эфир Bax – проапоптотический белок (ассоциированный с Bcl-2 белок X) Bcl-2 – антиапоптотический белок (белок лейкемии В-клеток-2) NO – оксид азота Автор выражает благодарность профессору кафедры биохимии и молекулярной биологии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава д-ру мед. наук, профессору Т.С. Федоровой, канд. мед. наук, заведующей лабораторией клинической иммунологии ГУЗ ЦМСЧ № 81 ЗАТО Северск Т.Т. Радзивил, канд. мед. наук, доценту кафедры биохимии и молекулярной биологии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава Т.В. Жаворонок, д-ру мед. наук, заведующей Межкафедральной научно-образовательной лаборатории молекулярной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава Л.С. Литвиновой за проявленный интерес к работе, ценные теоретические и методические советы, а также за помощь в организации проведения исследований.

Похожие:

	Роль молекул оксида азота в программированной гибели нейтрофилов при окислительном стрессе Работа выполнена в гоу впо «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному...		Зависимость заболеваний сердечно-сосудистой системы от содержания вредных веществ в воздухе Из рис. 1 видно, что при   1,5 резко увеличивается выброс оксида углерода и углеводородов, при   1,5 повышается содержание в...
	К. Н. Зеленин Военно-медицинская академия, Санкт-Петербург Рассматриваются вопросы химии и практических приложений оксида азота(II). Обсуждаются различные аспекты участия этого вещества в...		Регуляция I и II типов программированной клеточной гибели т-лимфоцитов... Работа выполнена в нил биохимии нуклеиновых кислот кафедры биохимии фгаоувпо «Казанский (Приволжский) федеральный университет», г....
	Лазебная Е. О. Реадаптация личности при посттравматическом стрессе Лазебная Е. О. Реадаптация личности при посттравматическом стрессе. – М.: Ноу впо “Институт психоанализа”, 68 с		Способ получения мембран на основе оксида алюминия Способ получения мембран на основе оксида алюминия осуществляют следующим образом. Подготовленный образец алюминия подвергают первичному...
	Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цель: рассмотреть генетическую связь соединений азота, охарактеризовать положение азота в таблице Менделеева, рассмотреть состав...		Продукция оксида азота мононуклеарами крови у больных лекарственно-чувствительным... У больных лекарственно-устойчивым тл до и после проведения курса интенсивного лечения секреция no• моноцитами крови снижалась и увеличивалась...
	Рефератов по дисциплине «экология» Искусственное загрязнение. Оксиды азота. Методы снижения образования оксидов азота		"Роль биологического азота в азотном балансе почв" В практической части представлены результаты опыта по учету численности микроорганизмов в дерново-подзолистой почвы
	Механизмы гибели клеток при действии оливомицина и его производных		Рекомендации по подавлению чувства тревоги при выступлении Ему важно, как воспримут его и его речь. Оказаться в таком положении – это большой стресс, а инстинкт говорит нам, что при стрессе...
	Темы рефератов по дисциплине Строение вещества для группы ах-07-1 Татевский В. М. Строение молекул и физико-химические свойства молекул и веществ. М.: Изд. Московского университета, 1993		Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цель: Проследить связь важнейших соединений азота, роль аммиака, азотной кислоты в окислительно-восстановительных процессах, специфические...
	Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цели урока изучить нахождение азота в природе и его свойства, вскрыть причинно-следственные связи “строение–свойства” и “свойства–применение”,...		Тематическое планирование Физика 8 класс Примеры тепловых и электрических явлений. Повторение понятий: механическое движение, траектория, пройденный путь, скорость. Особенности...