Скачать 2.29 Mb.
|
3.4. Изучение каталитических свойств липаз в комплексах с синтетическими полимерами Белковые молекулы (в том числе и ферменты) являются полиамфолитами, поскольку в их состав входят как положительно (лизин, аргинин, гистидин), так и отрицательно заряженные аминокислоты (аспарагиновая и глутаминовая кислота). В этой связи в нейтральных средах на поверхности белковой глобулы присутствуют как положительные, так и отрицательные заряды. Такое строение белковых молекул обуславливает возможность их взаимодействия с ионогенными веществами, в том числе полиэлектролитами различной природы. Результатом подобных взаимодействий является образование нековалентных белок-полиэлектролитных комплексов [34]. Установлено, что белок-полиэлектролитные комплексы спонтанно образуются при смешении растворов отдельных компонентов, главным образом, за счет электростатических взаимодействий между противоположно заряженными группами белка и полииона. Комплексообразование, однако, может быть обусловлено и другими причинами – образованием водородных связей или гидрофобными взаимодействиями, возникающими вследствие неионных взаимодействий между молекулой белка и неполярными участками полиэлектролита. Благодаря этим взаимодействиям образование белок-полиэлектролитных комплексов может происходить даже при таких значениях pH, при которых знаки заряда белковых глобул и цепей полиэлектролитов совпадают [34]. Образование фермент-полиэлектролитных комплексов должно сказываться как на активности фермента, так и на его устойчивости по отношению к различным инактивирующим факторам химической и физической природы. Большую роль здесь будет играть соотношение компонентов комплекса, определяющее число образующихся контактов между молекулой белка и полиэлектролитом. Для изучения влияния полимеров на активность липаз из различных источников (животного – липаза из поджелудочной железы свиньи - и грибного – липаза из Mucor javanicus - происхождения) были выбраны разнозаряженные полиэлектролиты - Na-полистиролсульфонат (ПСС, полианион) и полидиаллилдиметиламмоний хлорид (ПАМА, поликатион), а также полиэтиленгликоль (ПЭ-240), который является смесью двух олигомеров с разной молекулярной массой. Эти полиэлектролиты находят широкое применение в химических технологиях (как флокулянты для очистки воды), в медицине (лечение гиперкалиемии) и бионанотехнологиях (формирование полиэлектролитных оболочек на коллоидных частицах различной природы для получения микрокапсул, получение нанотрубок, и т.д.). 3.4.1. Влияние полиэлектролитного окружения на активность липаз из поджелудочной железы свиньи и гриба Mucor javanicus Активность липазы из поджелудочной железы свиньи и липазы из гриба Mucor javanicus была измерена в присутствии ПАМА и ПСС в соотношениях липаза : полимер 1:1, 1:10, 1:100 при рН 7,0 и t 25 ºС (табл. 48). Активность липаз без полиэлектролитов была принята за 100 %. Таблица 48 - Относительная активность (А) липаз из поджелудочной железы свиньи (Л-1), Mucor javanicus (Л-2) в присутствии ПАМА и ПСС при разных соотношениях липаза : полиэлектролит.
Активность липазы из поджелудочной железы свиньи в присутствии ПСС (рис. 11) при соотношениях 1:10 и 1:100 различалась незначительно (117 и 115 %, соответственно) и была максимальной, что может быть связано с увеличением микрогетерогенности системы в результате взаимодействия липазы с полиэлектролитом. В то же время использование эквимолярной смеси липаза:ПСС (1:1) приводит к значительному уменьшению активности липазы (до 23%), поскольку недостаточно ПСС для образования микрогетерогенной границы раздела фаз.
В присутствии ПАМА наивысшая активность панкреатической липазы наблюдалась при соотношении липаза : полимер равное 1:10 (94%) (рисунок 12). Присутствие ПАМА в соотношении 1:10 незначительно уменьшает активность липазы по сравнению с контролем (на 6%). Это может быть связано с тем, что отрицательно заряженная при нейтральных значениях рН липаза в процессе комплексообразования оказывается расположенной внутри глобулы положительно заряженного полимера и становится менее доступной для субстрата.
Это подтверждается тем, что при увеличении концентрации ПАМА в смеси с липазой до 1:100 происходит значительное уменьшение активности до 44% по сравнению с эквимолярной системой (при 1:1 активность составила 73%). Это свидетельствует о значительном экранировании активных центров липазы при связывании с избытком положительно заряженного ПАМА. Максимальная активность липазы из гриба Mucor javanicus (рисунок 13 и 14) наблюдалась в присутствии ПАМА при соотношении 1:100 (116%), а в присутствии ПСС при соотношении 1:1 (152%). Увеличение активности липазы из Mucor javanicus с увеличением концентрации положительно заряженного ПАМА относительно фермента (от 96 % при соотношении 1:1 до 116 % при соотношении 1:100) связано прежде всего с удалением отрицательно заряженных жирных кислот из реакционной смеси путем электростатического взаимодействия с полиэлектролитом и сдвигом равновесия в сторону образования продуктов реакции. Увеличение активности липазы на 52 % в случае эквимолярного соотношения фермента с ПСС (табл. 48) можно объяснить закреплением каталитически выгодной конформации фермента в комплексе с ПСС.
Таким образом, активность липазы существенно зависит от заряда полиэлектролита и от концентрации его относительно фермента. Наилучшими для липазы из поджелудочной железы свиньи являются системы с ПСС 1:10 и 1:100, для липазы из Mucor javanicus – системы с ПАМА 1:100 или ПСС 1:1. В комплексах липазы из поджелудочной железы свиньи с полимером ПЭ-240 в соотношениях 1:1 и 1:10 наблюдается повышение каталитической активности липазы при соотношении липаза : полимер 1:1 на 8%, а при соотношении 1:10 изменения активности не происходит (таблица 49). Таблица 49 - Активность липазы из поджелудочной железы свиньи, в присутствии ПЭ-240 при разных соотношениях липаза : полиэлектролит.
3.4.2. Влияние температуры на активность липаз в комплексе с синтетическими полиэлектролитами. Резкое повышение температуры является одним из важнейших факторов, которые вызывают инактивацию любых ферментов, в том числе липаз. В основе такого действия высокой температуры лежат следующие молекулярные механизмы: - агрегация за счет водородных связей и гидрофобных взаимодействий; - изменение первичной структуры в результате разрывов в полипептидной цепи и модификации функциональных групп фермента в результате их окисления, расщепления дисульфидных связей, фосфорилирования, дезаминирования и т.д. - диссоциация олигомерных белков-ферментов на нефункциональные субъединицы или даже “разворачивание” полипептидной цепи субъединиц. Высокая стабильность иммобилизованных ферментов, вероятно, является следствием “защиты” ферментов от вредных воздействий за счет специфического микроокружения, уменьшения их подвижности, и подавления, вследствие этого, процессов агрегации фермента и диссоциации молекул фермент-субстратного комплекса [34]. Учитывая обнаруженные эффекты регуляции ферментативной активности липаз и перспективы практического использования были исследованы температурные зависимости активности липаз из поджелудочной железы свиньи и гриба Mucor javanicus в комплексах с полиэлектролитами. Результаты измерений представлены в таблицах 50 (для липазы из поджелудочной железы свиньи) и 51 (для липазы из гриба Mucor javanicus) в виде относительных значений активности липаз (в сравнении с контрольными значениями активности липаз в комплексе с полиэлектролитами при 25 0С, принятыми за 1). 3.4.2.1. Изменение активности липазы из поджелудочной железы свиньи в комплексе с полиэлектролитами при увеличении температуры При соотношении липаза : ПАМА = 1:1 (табл. 50, рис. 15) активность липазы оказалась ниже, чем в отсутствие полимера при температурах 40 °С (2,7 кр. ед.) и 60 ºС (3,2 кр. ед.) в 1,6 и 1,2 раза, соответственно. Однако, при 80 ºС активность липазы при этом соотношении с ПАМА выше в 2,1 раз, чем активность чистой липазы. Таблица 50 - Относительная активность (А) панкреатической липазы (Л-1) в присутствии полиэлектролитов при изменении температуры от 20 до 80 °С
При соотношении липаза : ПАМА 1:10 (табл. 50, рис. 16) активность липазы значительно выше, чем в отсутствие полимера (в 1,8 раз при 40 ºС, в 2,3 раза при 60 ºС, в 1,7 раз при 80 ºС). Кроме того, наблюдается сдвиг температурного оптимума в сторону более высоких температур, по сравнению с исходным ферментом. Все данные свидетельствуют о происходящих конформационных изменениях в системе липаза-полимер, которые делают фермент более устойчивым к температурным воздействиям.
Показано, что в присутствии ПСС липаза из поджелудочной железы свиньи при 20 ºС имеет активность около 100% по отношению к контролю при 25 ºС при обеих концентрациях полимера (табл. 50, рис. 17, 18). При повышении температуры до 40 и 60 ºС активность панкреатической липазы во всех случаях была выше контроля: при соотношении 1:1 активность увеличилась в 2,6 и 7,6 раза, а при соотношении 1:10 увеличилась в 3,1 и 10,8 раз, соответственно. 3.4.2.2. Изменение активности липазы из гриба Mucor javanicus в комплексе с полиэлектролитами при увеличении температуры Активность липазы в присутствии ПАМА в соотношении 1:1 (табл. 51, рис. 19) возросла в 12,8 раз (при 60 ºС) относительно контрольной пробы (при 25 ºС и рН 7,0). При 80 ºС активность липазы значительно снизилась в 2,8 раза, что объясняется началом частичной денатурации фермента при высокой температуре. Таблица 51 - Относительная активность (А) липазы из Mucor javanicus (Л-2) в присутствии полиэлектролитов при изменении температуры от 20 до 80 °С.
|
Отчет о научно-исследовательской работе Гост 32-2001. Межгосударственный стандарт. Система стандартов по информации, библиотечному и издательскому делу. Отчет о научно-исследовательской... | Отчет о научно-исследовательской работе Межгосударственный стандарт (гост 32-2001). Отчет о научно-исследовательской работе. Структура и правила оформления (редакция 2005... | ||
Общие положения отчет Отчет о научно-исследовательской работе (нир) документ, который содержит систематизированные данные о научно-исследовательской работе,... | Реферат Отчет о научно-исследовательской работе состоит Отчет о научно-исследовательской работе состоит из 33 рисунков, 8 разделов, 12 подразделов, 9 формул, 31 источника. Общий объем 48... | ||
Отчет о научно-исследовательской работе «определение доступности... Ключевые слова: отчет, научно-исследовательская работа, заключительный отчет, кинопоказ, доступность, качество, цифровые технологии,... | Отчет по научно-исследовательской работе студентов экономического факультета за 2012-2013 г Научно-исследовательская работа студентов является действенным средством повышения качества подготовки специалистов и проводится... | ||
Отчет о научно-исследовательской работе Двухфакторная многокритериальная методика аттестации научно-педагогических работников спбгу на основе показателей эффективности их... | Отчет о научно-исследовательской работе фгоу впо «Кемеровский гсхи» Ключевые слова: наука, инновации, инновационный потенциал, инновационный проект, финансирование научно-исследовательской работы,... | ||
Отчет о научно-исследовательской работе за 2011 год Основные научные направления (по которым факультет осуществляет научно-исследовательскую деятельность) | Отчет о научно-исследовательской работе Проведение научных исследований коллективами научно-образовательных центров в области коллоидной химии и поверхностных явлений | ||
Отчет о научной исследовательской работе студентов (магистрантов) Института Организация научно-исследовательской деятельности студентов и их участие в научных исследованиях и разработках в 2012 году | Отчет о научно-исследовательской и опытно-конструкторской работе Методические указания по выполнению контрольной работы одобрены на заседании Научно-методического совета взфэи | ||
Отчет о научно-исследовательской работе «научно-методическое сопровождение выполнения обязательств российской федерации по охране всемирного культурного и природного наследия... | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования | ||
Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Санкт-петербургский государственный электротехнический университет «лэти» им. В. И. Ульянова (ленина) |