Клинико-морфологическое обоснование периодической гипобарической гипоксической стимуляции в терапии атопической бронхиальной астмы у детей
Скачать 387.43 Kb.
|
Создание экспериментальной модели бронхиальной астмы и реализация лечебной коррекции в эксперименте проводилось на 50 половозрелых особей мышей-самцов линии BALB/c весом 18-20 г. При выполнении исследования соблюдались правила биоэтики, утвержденные приказом МЗ СССР №755 от 12.05.1977, а также принципы гуманности, изложенные в директивах Европейского сообщества (86/609/EEC) и Хельсинской декларации по защите позвоночных животных, используемых для лабораторных и иных целей. Подопытные животные были разделены на две группы: 1-ая группа – 20 мышей с экспериментальной моделью бронхиальной астмы, не получающие лечение методом ПГГС; 2-ая группа – 20 мышей с экспериментальной моделью бронхиальной астмы, получающие лечение методом ПГГС. В качестве контроля использовались 10 интактных животных, находящихся в условиях вивария. Животные экспериментальных групп сенсибилизировались интраперитонеально двукратным введением 10 мкг овальбумина (Sigma), разведенного в 0,1 мл физиологического раствора, содержащего 2мг Al(OH)3, на 0 и 14 день эксперимента. С 22 по 45 день эксперимента животные через день подвергались ингаляционному введению аэрозоля 1% раствора овальбумина по 30 минут в день с помощью компрессорного небулайзера (Omron C-28). Для осуществления ингаляций аэрозоля аллергена лабораторные животные помещались в камеру объемом 5 литров. С 22 дня эксперимента животные получали лечение методом периодической гипобарической гипоксической стимуляции в условиях экспериментальной барокамеры. Каждый сеанс гипобаротерапии состоял из подъема, пребывания на «высоте» и спуска. При первом сеансе постепенно снижали барометрическое давление в камере соответственно подъему на высоту 1000 м над уровнем моря, при последующих сеансах прибавлялось по 500 м, доходя до конечной «высоты» 3500 м. На конечной высоте 3500 м над уровнем моря парциальное давление кислорода составляет 460 мм.рт.ст. Скорость подъема составляла 3-5 метров в секунду, спуск осуществлялся со скоростью 1-2 метр в секунду. Курс лечения состоял из 24 сеансов (22-45 дни эксперимента). Все сеансы проводились ежедневно в одно и то же утреннее время суток. На 14, 21, 45 сутки после начала эксперимента по 5 животных из каждой группы выводились из опыта путем декапитации под нембуталовым наркозом. Для исследования проводился забор фрагментов гипоталамуса, аденогипофиза и нейрогипофиза, надпочечников, тимуса, трахеи, бронхов и легочных структур. Данный материал от экспериментальных и контрольных животных был подвергнут стандартной однотипной гистологической обработке. Морфофункциональные методы исследования Для идентификации клеток с признаками апоптоза применяли иммуноцитохимические реакции с моноклональными антителами: на определение экспрессии проапоптического белка р53 и каспазы 3. Кусочки тканей фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвоживали и заливали в парафин. Исследование проводили на серийных парафиновых срезах толщиной 5-6 мкм. Срезы инкубировали с моноклональными антителами к р53 (фирма «Дако», Дания) в рабочем разведении 1:50, каспазы-3 (фирма BioGеnеx, США) в рабочем разведении 1:50. Для выявления иммунного окрашивания использовали стрептавидин-биотиновый пероксидазный метод («Дако», LSAB-kit, Дания), затем осуществляли докрашивание ядер водным гематоксилином Майера. Материалом для исследования состояния апоптоза у детей послужила периферическая кровь (мазки крови на специальных предметных стеклах для иммуноцитохимических исследований). Для идентификации клеток крови (эозинофилы) с признаками апоптоза применяли определение уровня экспрессии проапоптотического протеина р53 и выявление интрануклеосомной фрагментации ДНК методом TUNEL. Определение белка р53 производилось с помощью моноклональных антител (фирма «Дако», Дания). Для визуализации позитивного (р53) иммунного окрашивания клеток применяли стрептавидин-биотиновый пероксидазный метод с последующим докрашиванием ядер гематоксилином Майера. Для идентификации внутриядерной фрагментации ДНК использовали набор реактивов «Apoptag plus peroxidase in situ apoptosis detection kit» (фирма INTEGREN, Канада) с докрашиванием ядер 0,5% раствором метиленового зеленого. Во всех случаях подсчитывали процент окрашенных клеток на 1000 клеток в случайно выбранных полях зрения. Для светооптических исследований материал фиксировали в 10% водном растворе нейтрального формалина, спирт-формоле, жидкости Буэна, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали целлоидин-парафином. Приготовление серийных срезов толщиной 5-6 мкм осуществляли на ротационном микротоме МПС-2. Депарафинированные срезы окрашивали гематоксилином Майэра и эозином. Идентифицировали гликозаминогликаны – толуидиновым синим при значении pH 2,7-3,0, рибонуклеопротеиды – метиленовым зеленым и пиронином «G» по Браше. Гликоген и нейтральные мукополисахариды (гликопротеиды) определяли с помощью перйодат-Шифф реакции по Мак-Манусу. Гистохимические реакции сопровождались соответствующими ферментативными контролями (Пирс Э., 1962). Для электронномикроскопических исследований материал фиксировали при +40С в 2,5%-м растворе глютарового альдегида на S-коллединовом буфере (pH 7,2-7,4). Постфиксацию проводили в четырехокиси осмия по прописи G.Millonig (1961). Материал обезвоживали при комнатной температуре в ацетоне возрастающей концентрации и помещали в смолу ЭПОН-812. Полимеризацию объектов проводили при +600С в течении 2 суток. С каждого блока на ультратоме LKB-5 (Sweden-Bromma) получали полутонкие (1мкм) и ультратонкие (40-60 нм) срезы. Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим и основным фуксином по прописи M.Sato et E.Shamoto (1973). Полутонкие срезы использовали при подготовке блоков к заточке перед изготовлением ультратонких срезов, а также для анализа тканей и клеточной организации на световом уровне. Ультратонкие срезы подвергали двойному контрастированию насыщенным спиртовым раствором уранилацетата при температуре +370С в течение 20 минут и цитрате свинца по Reynolds (1963). Срезы изучали на электронном микроскопе ЭМВ 100АК, фотографирование структур проводили при увеличении от х5400 до х40000. Морфометрическое исследование выполняли на препаратах с использованием стандартной окулярной сетки Автандилова Г.Г. (1990), а также винтового окуляр-микрометра МОВ-1-15хУ4,2. Вычисление площади поверхности ультраструктур осуществляли наложением на электронограмму точечной или квадратной сетки (Стропус Р.А. с соавт., 1976; Якубов А.С., Кац В.А., 1984). Снятие морфометрических параметров проводили путем подсчета точек, попавших на структурные профили. Полученные результаты статистически оценивали по двустороннему критерию Фишера, t-критерию Стьюдента. Вычисления производились с помощью программного пакета «Statistica 6.0». Данные представлены в виде среднего арифметического по результатам каждого раздела исследования, +/- ошибки средних величин (m). Достоверными считались отличия при р < 0,05(95,5%). Результаты собственного исследования и их обсуждение В результате проведенных исследований было установлено, что наследственная предрасположенность к аллергическим болезням в анамнезе отмечалась у 47 (58,8±5,5%) детей, близкие родственники которых страдали тем или иным аллергическим заболеванием. Осложненное течение беременности и родов имели 62 (77,5±4,6%) матери наблюдаемых детей. Оценивая спектр сенсибилизации у детей было выявлено, что среди причинно-значимых, первостепенное значение имеют аллергены домашней пыли и клещей домашней пыли семейства Dermatophagoides (41,2±5,5%). Большую долю в структуре сенсибилизации составили также пыльцевые (32,5±5,2%) и эпидермальные (18,7±4,4%) аллергены. Сопутствующие аллергические заболевания у детей отмечались в виде проявлений атопического дерматита у 24 (30,0±5,1%), поллиноза у 26 (32,5±5,2%), отека Квинке у 8 (10,0±3,4%), крапивницы у 10 (12,5±3,7%) детей. Среди факторов, способствующих формированию БА у детей, важное место принадлежит респираторно-вирусным инфекциям (Иллек Я.Ю., Зайцева Г.А. с соавт., 2008). У 61,2±5,4% детей манифестация БА произошла в период течения острой респираторной вирусной инфекции (ОРВИ). 53,8±5,6% детей относились к группе часто и длительно болеющих детей. У 18,8±4,4% детей частота ОРВИ в период манифестации БА превышала 10 случаев за календарный год. У детей выявлена высокая частота различной сопутствующей патологии. Заболевания желудочно-кишечного тракта регистрировались у 61,2±5,4% пациентов, а заболевания ЛОР-органов, таких как хронический тонзиллит, аденоидиты, синуситы у 43,8±5,5% детей. Характерно, что частота сопутствующей патологии выше в старшей возрастной группе (пубертатный период). При оценке клинической эффективности ПГГС было установлено, что использование метода ПГГС в комплексной терапии наблюдаемых пациентов позволило значимо снизить частоту симптомов заболевания, потребность в короткодействующих бронхолитических препаратах, достоверно повысить долю детей с контролируемым течением БА (табл. 2). Таблица 2 Характеристика некоторых признаков БА у наблюдаемых детей до и через год после лечения методом ПГГС
Отмечалось (рис. 1) повышение доли детей с легкой интермиттирующей БА с 3,3% до 30% (р=0,0001), понижение доли детей со средней степени тяжести персистирующей БА с 26,7% до 6,7% (р=0,001), уменьшение доли пациентов с тяжелой персистирующей астмой с 8,3 до 3,3% (р=0,2).  Рис 1. Динамика степени тяжести БА у детей основной группы до и после баротерапии Примечание: I – легкая интермиттирующая бронхиальная астма; II – легкая персистирующая бронхиальная астма; III – средней степени персистирующая астма; IV- тяжелая персистирующая астма При оценке динамики степени тяжести болезни нами установлено, что у 33 (55,0%) детей основной группы через год после баролечения степень тяжести астмы была пересмотрена на более легкую, соответственно был изменен объем базисной терапии (одна ступень вниз), у 28 (45,0%) тяжесть заболевания не изменилось. Эти данные свидетельствуют о том, что у большинства детей наступило улучшение в течение заболевания, уменьшилась потребность в бронхолитических препаратах, и была пересмотрена базисная ингаляционная терапия. Для удобства оценки эффективности гипобаротерапии мы раздели детей до и после лечения на две группы: дети с легкой интермиттирующей и легкой персистирующей степенью тяжести бронхиальной астмы (группа 1) и дети со среднетяжелой и тяжелой БА (группа 2). Производилась оценка соотношения числа детей с легкой и среднетяжелой/тяжелой БА до и после лечения в зависимости от пола и возраста пациентов (табл. 3). Во всех подгруппах детей отмечалось достоверное повышение доли детей с легкими формами БА через год после курса ПГГС по сравнению с данными для изучаемых подгрупп до лечения. Достоверной разности в уровне эффективности гипобаротерапии детей в зависимости от возраста (между детьми пубертатного и препубертатного возраста), а также в зависимости от пола не было выявлено (р>0,05). Таблица 3 Динамика степени тяжести БА в результате гипобаротерапии
* - расчеты производились с использованием критерия χ2 для таблицы сопряженности 2х2 с поправкой Йейтса, а также двусторонний точный критерий Фишера Потребность в назначении детям в качестве базисного лечения гормональных ингаляционных препаратов достоверно уменьшилась (р=0,01) с 31,6% до 10,0% детей (рис. 2).  Рис. 2. Изменение базисной терапии основной и контрольной групп в течение года наблюдения Примечание: Iа – основная группа до баротерапии; Iб – основная группа через год после баротерапии; IIа – контрольная группа в начале наблюдения; IIб – контрольная группа через год от начала наблюдения *- р=0,01 ** - р=0,75 У детей основной группы через год после проведения курса ПГГС по сравнению с детьми контрольной группы была установлена достоверно более низкая доля детей, которые получали в качестве медикаментозной базисной терапии гормональные ингаляционные препараты (10,0% против 30,0%; р=0,04). После проведенного лечения методом ПГГС в течение календарного года с 15,0% до 1,7% детей уменьшилась необходимостью применения инфузионной терапии с использованием системных гормональных препаратов при обострении БА. У детей основной группы в течение года более не возникало ситуаций, потребовавших введение в схему лечения пероральных гормональных препаратов. Для уточнения механизма лечебного эффекта ПГГС нами было произведено изучение состояние апоптоза эозинофилов периферической крови (табл. 4). Было выявлено, что у детей с БА в период ремиссии по сравнению со здоровыми детьми отмечалось достоверно значимое снижение уровня программированной гибели эозинофилов в периферической крови как по уровню экспрессии проапоптотического протеина р53, так и по признакам внутриядерной фрагментации ДНК. Увеличение продолжительности жизни активированных эозинофилов поддерживает аллергическое воспаление в слизистой оболочки бронхов, способствует его прогрессированию и хронизации (Akuthota P. et al., 2011). В тоже время известно, что р53 может подавлять активность NF-kB через прямое или косвенное взаимодействие с рядом клеточных белков (Ravi R. et al., 1998; Webster G.A. et al., 1999; Ryan K.M., 2000). Снижение ингибирующего влияния р53 приводит к повышению активности NF-kB - одного из ключевых механизмов воспаления при БА, запускающего синтез широкого спектра провоспалительных медиаторов и антиапоптотических эффекторов (Yang, L. et al., 1998; Christman, J. W. et al., 2000; Pantano C. et al., 2008). Полученные данные согласуются с результатами предыдущих работ, указывающих на сохранение активности аллергического воспаления в период ремиссии у детей с атопической БА (Воляник О.В., 2008, Алеманова Г.Д., 2010). | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Похожие:
 | «Неотложная и отдаленная эффективность комбинированной терапии среднетяжелой... Работа выполнена в гбоу впо первый Московский государственный медицинский университет имени И. М. Сеченова | | Клинико-функциональные особенности бронхиальной астмы у детей с грибковой... Цель: создание творческой и психолого-педагогической среды для развития инновационного педагога, осуществляющего деятельность по... |
 | Значение показателей процессов пероксидации липидов, иммунологических... | | Иммуномодулирующая терапия в комплексном лечении неконтролируемой бронхиальной астмы у детей Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновский государственный... |
| На модели т-лимфоцитов больных атопической бронхиальной астмой Казанский (Приволжский) федеральный университет, Институт фундаментальной медицины и биологии, кафедра биохимии | | Реферат «Интервальная гипоксическая тренировка лыжников- гонщиков» Значительно повысить аэробную производительность в обычных условиях с помощью тренировочного процесса невозможно, поэтому спортсмены... |
| Клинико-лабораторное обоснование применения ортокератологических... | | Регуляция I и II типов программированной клеточной гибели т-лимфоцитов... Работа выполнена в нил биохимии нуклеиновых кислот кафедры биохимии фгаоувпо «Казанский (Приволжский) федеральный университет», г.... |
| Изучение генетической предрасположенности к атопической бронхиальной... Работа выполнена в лаборатории химической геномики Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте... | | Эпидемиология и эффективность современных методов диагностики и лечения... Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Уральская Государственная медицинская... |
| Экспериментально-морфологическое обоснование применения препарата... Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная... | | Клинико-лабораторное обоснование профилактики кариеса зубов и болезней... Работа выполнена в фгу «Центральный научно-исследовательский институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии Росмедтехнологий»... |
| Клинико-лабораторное обоснование выбора метода непрямого восстановления... | | Клинико-экономическое обоснование вариантов фармакотерапии и хирургического... Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования |
| Клинико-иммунологические характеристики традиционной и инновационной... Тема урока: Закрепление, совершенствование и учёт выполнения гимнастических упражнений | | Список рефератов для сдачи вступительных экзаменов в аспирантуру по терапии Пневмокониозы (силикоз, силикатозы, бериллиоз, смешанные), клинико- морфологические формы и стадии. Пылевые бронхиты. Диагностика.... |
