Учебно-методический комплекс по дисциплине «Молекулярная диагностика» (наименование дисциплины) Для специальности «лечебное дело» 060101,65 (наименование и код специальности)
Скачать 1.14 Mb.
|
Методы молекулярной диагностики (доцент Иевлева А.Г.)Раздел № 2 учебного плана
Раздел № 3 учебного плана
Раздел № 4 учебного плана
К разделу I УМК ЛИСТ ДОПОЛНЕНИЙ И ИЗМЕНЕНИЙ В РАБОЧЕЙ ПРОГРАММЕ за ______/______ учебный год В рабочую программу _______________________________________________ (наименование дисциплины) для специальности _________________________________________________ (наименование специальности, код) ___________ формы обучения вносятся следующие дополнения и изменения: (очной, заочной) … Дополнения и изменения внес ______________________ _________________ ___________________ (должность, ученое звание, степень) (подпись) (И.О. расшифровка фамилии) Рабочая программа пересмотрена и одобрена на заседании кафедры _______ __________________________________________________________________ (наименование кафедры) Заведующий кафедрой ______________________________________________ _______________ ___________________ ____________________________ (ученое звание) (подпись) (И.О. расшифровка фамилии) «___»________200__г Дополнения и изменения в Рабочей программе за указанный период отсутствуют. Раздел II УМК Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Кафедра ______медицинской ___генетики_________________________ (наименование кафедры) БАНК КОНТРОЛЬНЫХ ЗАДАНИЙ И ВОПРОСОВ (ТЕСТОВ) ПО ОТДЕЛЬНЫМ темам И В ЦЕЛОМ ПО ДИСЦИПЛИНЕ {заданий в тестовой форме (тестов)} По дисциплине ______медицинская генетика__________________________ (наименование дисциплины) по специальности _________педиатрия__060103 _______________________ ( наименование специальности, код) 1. мРНК 5’-GAU GCA CGC UAG GUU UUA GCG-3’ кодирует полипептидную цепь с аминокислотной последовательностью А) Ser-Pro-Cys-Thr-Met-Asp-Leu Б) Asp-Ala-Arg-Tyr-Val-Leu-Ala В) Asp-Ala-Arg-Thr-Met-Asp-Leu 2. Метод ПЦР может использоваться для А) диагностики хромосомных нарушений Б) молекулярной идентификации личности В) диагностики мутаций в генах наследственных болезней Г) диагностики инфекций Д) диагностики дефектов внутриутробного развития плода 3. Произошла мутация в кодирующей последовательности 5’-CAG AAT ACC TGA TTG ATA GCA-3’ мутантная последовательность имеет вид 5’-CAG AAT ACT GAT TGA TAG CAT-3’ Определите характер мутации А) делеция Б) нонсенс В) сдвиг рамки считывания 4. Для работа ДНК-полимеразы необходимо наличие: А) однонитевой матричной ДНК Б) инициирующего кодона В) двунитевого участка на 3’-конце молекулы Г) 4-х типов дезокситрифосфатов Д) тРНК 5. Открытие гена означает: А) определение его локализации на цитогенетической карте Б) определение его локализации на карте микросателлитных индексных маркеров В) клонирование и секвенирование полноразмерной кДНК Г) клонирование геномных ДНК, перекрывающих область локализации гена Д) секвенирование полной нуклеотидной последовательности гена 6. Сколько генов в геноме человека? А) столько же, сколько и белков Б) в 2 раза больше, чем у круглого микроскопического червя нематоды В) 32 000 Г) 80 000 Д) 118 000 7. В нуклеиновых кислотах азотистое основание соединяется с сахаром: А) гликозидной связью Б) фосфоэфирной связью В) водородной связью Г) неспецифической связью 8. Последовательностью РНК, содержащей интроны, является: А) мРНК Б) преРНК В) тРНК Г) рРНК Д) ядерная гетерогенная РНК 9. Прямая молекулярная диагностика мутаций в гене возможна: А) для любых моногенных заболеваний Б) для генов с известной цитогенетической локализацией В) для клонированных генов Г) для генов с известной нуклеотидной последовательностью 10. Произошла мутация в кодирующей последовательности 5’-ATG GAT ACC TCA CTG TCC TGA-3’ мутантная последовательность имеет вид 5’- ATG GAT ACC TCA CTT TCC TGA -3’ Определите характер мутации А) делеция со сдвигом рамки считывания Б) миссенс В) нонсенс 11. ПЦР представляет собой: А) искусственную амплификацию гена Б) искусственный некомплементарный синтез ДНК В) амплификациюin vivo специфического фрагмента ДНК Г) избирательный комплементарный синтез in vitro небольшого фрагмента ДНК Д) комплементарный синтез транскрибируемых ДНК 12. При проведении ПЦР окончание синтеза амплифицируемого фрагмента ДНК определяется: А) наличием в матричной ДНК стоп-кодона Б) изменением температурных условий реакции В) присутствием в матричной ДНК двунитевого участка, образованного праймером Г) достижением границы матричной ДНК Д) наличием в матричной ДНК структурных особенностей 13. Произошла мутация в кодирующей последовательности 5’-TTG GGA ACC CTA CTG CTT CGA-3’ мутантная последовательность имеет вид 5’- TTG GGA ACC CTA CTG CTT TGA -3’ Определите характер мутации А) нонсенс Б) миссенс В) нейтральная 14. При трансляции образуются молекулы: А) пре РНК Б) мРНК В) полипептидной цепи Г) кДНК Д) тРНК 15. Генетический код это соответствие последовательности из 3 нуклеотидов в молекуле: А) ДНК – 3 нуклеотидам в молекуле преРНК Б) ДНК – 3 нуклеотидам в молекуле тРНК В) ДНК – одной аминокислоте в молекуле полипептидной цепи Г) мРНК – одной аминокислоте в молекуле полипептидной цепи Д) мРНК – антикодону в тРНК 16. Генетический код необходим для: А) комплементарного синтеза ДНК Б) перевода нуклеотидной последовательности в аминокислотную В) синтеза полипептидной цепи на рибосоме Г) определения нуклеотидной последовательности ДНК Д) синтеза первичного РНК-транскрипта 17. Можно ли, зная последовательность аминокислот в кодируемом белке однозначно выписать последовательность нуклеотидов в: А) гене Б) экзонах В) кДНК Г) преРНК Д) мРНК 18. Сплайсинг это: А) процесс вырезания интронов из молекулы ДНК Б) трансляция областей мРНК, комплементарных экзонам В) избирательный синтез РНК-транскрипта, комплементарного кодирующей области гена Г) процесс вырезания последовательностей, комплементарных интронам из молекулы преРНК Д) избирательная транскрипция экзонов 19. Сдвиг рамки считывания возникает при: А) миссенс мутациях Б) нонсенс мутациях В) внутригенных делециях, не кратных трем нуклеотидам Г) внутригенных делециях, кратных трем нуклеотидам Д) экспансии 3-нуклеотидных повторов 20. Фенотипический эффект миссенс мутации зависит от: А) внутригенной локализации Б) изменения заряда аминокислоты В) функции домена, включающего аминокислотную замену Г) размера кодируемого белка Д) скорости транскрипции Контрольные вопросы 1. Дайте определение молекулярной медицины. Расскажите об основных направлениях ее развития и связях с расшифровкой структуры генома человека. 2.Центральная молекулярно-генетическая догма, основные информационные процессы – транскрипция, сплайсинг, трансляция. Генетический код. 3.Геномика, цели, подходы, основные достижения и их значение для развития медицины. 4.Структура генома человека. Число генов. Процент сходства по нуклеотидным последовательностям ДНК. Соотношение между кодирующими и некодирующими последовательностями. Изменчивость генома. Типы мутаций. 5.Значение открытия гена. Обратная генетика. Определение кДНК. Использование информационных технологий для анализа структуры и функций генных продуктов. Методы перехода от виртуального белкового продукта гена к реальному и их значение для разработки патогенетических методов лечения. 6.Дайте определение и приведите примеры моногенных заболеваний с аутосомно-рецессивным, аутосомно-доминантным и Х-сцепленном типах наследования 7.Мультифакториальные болезни. Цели и методы предиктивной медицины. Гены-кандидаты. Генетические факторы риска. 8.Перечислите, в каких областях медицины используется методология молекулярно-генетического анализа. 9.Методы молекулярной диагностики. Области применения. Техническое оснащение лабораторий ДНК-диагностики. 10.Выделение ДНК. Принцип и последовательные этапы метода. 11.Полимеразная цепная реакция. Определение. Цели использования. Реактивы, необходимые для проведения ПЦР. 12.Полимеразная цепная реакция. Принципы, условия проведения и последовательные этапы метода. 13.Полимеразная цепная реакция. Технические условия проведения реакции и достоинства метода. 14.Муковисцидоз, клиника, генетика, первичный биохимический дефект, мажорная мутация. 15.Диагностика мутации delF508 в гене муковисцидоза. Последовательные этапы. Интерпретация результатов. профессор, доктор биол. наук (Горбунова В. Н.) __________________________ __________________ _______________ (должность, ученое звание, степень) (подпись) (Фамилия И.О.) Заведующий кафедрой ___медицинской генетики_________ «___»________200__г. _________________ (Имянитов Е. Н.)____ (подпись) (Фамилия И.О.) Раздел III УМК Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Кафедра ________медицинской генетики_______________________________ (наименование кафедры) ПЕРЕЧЕНЬ МЕТОДИЧЕСКИХ УКАЗАНИЙ преподавателям ДЛЯ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМ УЧЕБНЫХ ЗАНЯТИЙ По дисциплине _медицинская генетика________________________________ (наименование дисциплины) по специальности _________________педиатрия_060103_________________ (наименование специальности, код) Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Кафедра медицинской генетики Тема практического занятия: МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ Методические указания для преподавателей 2011 Цель практического занятия: закрепить знания о строении и функции нуклеиновых кислот, полученные ранее в ходе обучения на кафедрах медицинской биологии и биохимии; дать представление о способах экстракции нуклеиновых кислот и современных методах анализа нуклеотидной последовательности Место проведения занятия: аудитория кафедры медицинской генетики. Продолжительность практического занятия – 3 академических часа Средства обучения: Наглядные пособия – таблицы, слайды. Набор тестовых заданий по теме. Основным методическим пособием для студентов являются учебные пособия:
Обсуждаемые вопросы (тематический план практического занятия):
Изложение плана электива, знакомство с аудиторией, обсуждение форм работы (10 мин) Проведение предварительнй беседы со студентами с целью проверки качества входного уровня знаний (15 мин.) Изложение темы практического занятия (теоретическая часть занятия) (3 академических часа) В начале 2000 года мир облетело сенсационное известие: «Расшифрована структура генома человека!». Новость оказалась настолько значимой, что стала предметом обсуждения между президентами ведущих стран мира. Однако на многих сообщение не произвело никакого впечатления. В первую очередь это связано с недостаточным пониманием того, что такое геном, какова его структура и что значит ее расшифровка? Имеет ли эта новость отношение к медицине и может ли коснуться каждого из нас? Поможет ли она преодолеть какие-то наши недуги или решить иные проблемы? Что такое молекулярная медицина и связана ли ее развитие с расшифровкой структуры генома? Более того, у некоторых людей возникли опасения, не грозит ли в очередной раз новое открытие ученых человечеству? Не последует ли за этим всеобщее принудительное генетическое обследование - своеобразная генетическая паспортизация населения? Не явится ли наш геном предметом анализа и насколько конфиденциальна будет полученная информация? Под геномом понимается полная генетическая система клетки, которая обеспечивает наследственную передачу в ряду поколений всех ее свойств и признаков. Но ведь и ДНК выполняет ту же функцию! Поэтому очень часто выражения «геном» и «ДНК» употребляют как синонимы. В начале XX века генетики сформулировали основные законы передачи признаков по наследству. Стало понятно, что гены являются некими дискретными единицами, которые, не смешиваясь друг с другом, передаются из поколения в поколение через половые клетки. Эти единицы располагаются в ядрах клеток и ассоциированы с компактными структурами - хромосомами, которые на определенной стадии деления клетки после специфического окрашивания можно наблюдать в микроскоп. ДНК - это нитевидная молекула, основу которой составляют монотонно чередующиеся остатки сахара (дезоксирибозы) и фосфорной кислоты. Каждый остаток сахара в нити ДНК соединен с одним из четырех типов различающихся между собой нуклеотидных оснований или нуклеотидов аденина, тимина, гуанина и цитозина, сокращенно обозначаемых буквами А, Т, Г и Ц. Порядок расположения этих зубцов и является тем языком, на котором могут быть записаны информационные программы развития любого организма из оплодотворенной яйцеклетки. Но оказалось, что далеко не вся ДНК состоит из подобных программ. Они в виде отдельных генов вкраплены в ДНК и занимают не более 10-15% общей длины молекулы. Кроме того, в большинстве генов человека присутствуют длинные некодирующие участки. Так что, суммарно кодирующие области ДНК составляют менее 3% от общей длины молекулы. Два удивительных свойства отличают нуклеиновые кислоты от всех других типов молекул. Во-первых, молекулы ДНК способны размножаться, то есть сами себя воспроизводить. Именно поэтому появление ДНК ассоциируется с возникновением жизни, которая невозможна без размножения. Во-вторых, в нуклеиновых кислотах в виде генов записана информация о развитии любого живого существа. Недаром ДНК сравнивают с энциклопедией жизни! Реализация этих двух свойств определяется тем, что в живой материи ДНК находится, главным образом, в форме двунитевой спирали. Образование двунитевых структур ДНК происходит по очень строгому правилу, в соответствии с которым напротив нуклеотида А в одной из нитей ДНК всегда располагается нуклеотид Т в другой нити, тогда как напротив Г всегда находится. Вот это правило: А-Т, Г-Ц, которое называется правилом комплементарности, и определяет способность ДНК к самовоспроизводству, а также к производству неких шаблонов генов, которые затем используются для строительства белков. Связи между комплементарными нуклеотидами в двунитевых ДНК настолько непрочные, что даже при относительно небольшом нагревании они рвутся, и молекула ДНК переходит в однонитевую форму. Но при нормализации условий взаимодополняющие друг друга комплементарные нити вновь объединяются и двунитевая структура ДНК восстанавливается. При размножении молекулы или при работе генов однонитевая цепь ДНК служит трафаретом или матрицей для строительства комплементарной нити в соответствии с правилом: А-Т, Г-Ц. Основная масса ДНК находится в составе хромосом в ядрах клеток в суперскрученной форме за счет взаимодействия с определенными ядерными белками. Относительно небольшая часть ДНК локализована в органеллах клетки, которые называются митохондриями. Длина молекулы ДНК измеряется в нуклеотидах или в парах оснований. Размер ДНК человека составляет 3.2 миллиарда пар оснований. Если бы каким-то образом нам удалось выделить из ядра и развернуть, не повредив, эту тончайшую нить ДНК, то ее физическая длина составила бы немногим менее двух метров. Нужно обладать очень богатым воображением, чтобы представить себе, что в ядре каждой нашей клетки имеется молекула ДНК такого гигантского размера, и как же она суперскручена, как замечательно она упакована, что ей не только там не тесно, но она способна выполнять две свои удивительные функции: самовоспроизводства и кодирования! Основной структурной единицей генов являются нуклеотиды - А, Т, Г и Ц, тогда как основной структурной единицей белков является совершенно иной тип молекул - аминокислоты. Их разнообразие больше - 20 вариантов. Как же происходит переход от гена к белку? В основе этого перехода лежит генетический код - центральный закон нашей жизни, в соответствии с которым последовательность из трех нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты - кодон - соответствует одной аминокислоте в молекуле белка. Таким образом, знание нуклеотидной последовательности кодирующей ДНК позволяет однозначно прогнозировать аминокислотную последовательность кодируемого белка. Очень важным свойством генетического кода является его вырожденность – способность кодировать одну и ту же аминокислоту не одним вариантом нуклеотидных триплетов, а несколькими. Причем, эти синономические триплеты, как правило, различаются по третьему нуклеотиду в кодоне. Важным следствием этого свойства является то, что знания аминокислотной последовательности кодируемого белка не достаточно для однозначного воспроизводства кодирующей нуклеотидной последовательности. Удивительным является то, что генетический код оказался одинаковым для всех живых существ от вирусов до человека. Универсальность генетического кода является бесспорным доказательством родственности всего живого на Земле. При этом наиболее правдоподобной гипотезой возникновения жизни кажется ее привнесение в форме взаимодействия нуклеиновых кислот и белков откуда-то извне. Правда, остается неразрешимым вопрос, а как жизнь образовалась там, откуда она пришла на Землю? В этом месте уместнее всего произнести слово Бог и говорить о божественном характере возникновения жизни на Земле. Но это уже вопрос не науки, а веры, убеждения. Декодирование информации, заложенной в молекуле ДНК, происходит в соответствии с центральной догмой молекулярной генетики. В соответствии с этой догмой один ген кодирует один белок, а точнее одну полипептидную цепь. Но это справедливо не для всех генов. Конечными продуктами примерно четверти генов человека являются не белки, а рибонуклеиновые кислоты. РНК, также как ДНК, состоят из четырех типов произвольно чередующихся нуклеотидов. Правда, в РНК функции Т выполняет другой нуклеотид – У (урацил). Второе важное структурное отличие заключается в том, что в РНК в основании располагается другой сахар - не дезоксирибоза, а рибоза. Первым шагом на пути расшифровки информации в молекуле ДНК является процесс транскрипции – синтез молекул РНК, комплементарных определенным участкам в молекуле ДНК. Те участки молекулы ДНК, которые транскрибируются, как раз и являются генами. Молекулы РНК, которые образуются в результате транскрипции, носят название преРНК или точнее первичный РНК-транскрипт. Серия модификаций превращает преРНК в информационную или матричную РНК - мРНК. В ходе процессинга преРНК происходят изменения на концах молекулы, обеспечивающие ее стабилизацию и возможность продвижения к нужным органеллам, в первую очередь, к рибосомам. Происходит полиаденелирование – присоединение полиА-последовательности к 3’-концу, и кэпирование – присоединение гуанозин-3-фосвата к 5’-концу молекулы преРНК. Но самой главной смысловой модификацией преРНК является сплайсинг. Для того чтобы определить, что такое сплайсинг, нужно вспомнить, что подавляющее большинство генов человека, также как генов эукариот, в отличие от прокариот, имеют прерывистую структуру. Кодирующие участки гена, которые носят название экзоны, перемежаются с гораздо более длинными некодирующими участками – интронами. И экзоны и интроны переписываются в молекулу преРНК. А потом действует механизм избирательного вырезания интронов и сшивки экзонов с образованием мРНК. Этот процесс и носит название сплайсинг. Таким образом, молекулы мРНК могут быть в десятки раз короче молекул преРНК, так как интроны, как правило, значительно длиннее экзонов. мРНК переходит в цитоплазму клетки и соединяется с рибосомой - структурой, которая выполняет функцию фабрики по производству белков. Последовательное вхождение кодонов мРНК в этот комплекс является инструкцией для выбора в соответствии с генетическим кодом аминокислот из цитоплазмы клетки и соединения их между собой. Так и строится остов белка до тех пор, пока в мРНК не встретится один из стоп-кодонов. Возможность специфического выбора аминокислот определяется тем, что в цитоплазме клетки присутствуют определенные физические прообразы генетического кода в виде 20 типов молекул транспортных РНК - тРНК. Основным свойством этих необычных нуклеиновых кислот, несколько напоминающих по форме лист клена, является их способность транспортировать одну из аминокислот, причем каждому из 20 типов аминокислот соответствует своя тРНК. Это соответствие зависит от структуры очень важного участка тРНК - антикодона. Антикодон, также как и кодон, состоит из трех нуклеотидов. Последовательность этих нуклеотидов в антикодоне и определяет тип тРНК, то есть то, какую именно аминокислоту способна транспортировать определенная тРНК. Комплементарное взаимодействие (по правилу А-У, Г-Ц) между кодоном в молекуле мРНК и антикодоном в молекуле тРНК и обеспечивает правильность выбора аминокислоты при «сборке» белка. В конце ХХ века молекулярные технологии развивались настолько интенсивно, что были созданы предпосылки для планомерного изучения структуры геномов разных видов живых существ, включая человека. Одной из наиболее значимых целей этих проектов является определение полной нуклеотидной последовательности геномных ДНК. Таким образом, родилась новая наука - геномика. В настоящее время с различной степенью точности расшифрована нуклеотидная последовательность геномной ДНК около 300 видов микроорганизмов, большинство из которых являются инфицирующими. Для многих низших полнота анализа оказалась абсолютной, то есть не осталось не расшифрованным ни одного нуклеотида! Однако при переходе на многоклеточные организмы задача значительно усложняется и не только потому, что длина ДНК высших в тысячи, а иногда в сотни тысяч раз больше, но и структура ее становится более сложной для анализа. Переход от низших к высшим сопровождается появлением большого числа некодирующих ДНК, значительную часть которых составляют повторяющиеся последовательности. Они вносят большую путаницу в правильную стыковку уже расшифрованных фрагментов ДНК. Кроме того, тандемные повторы сами очень трудно поддаются подобной расшифровке. Поэтому в геноме одного из видов круглого червя (нематоды) - первого многоклеточного организма, для которого удалось определить нуклеотидную последовательность ДНК, - уже осталось некоторое число неясных мест. Правда, их удельный вес составляет менее одной сотой процента от общей длины ДНК, и эти неясности не касаются генов или регуляторных элементов. Нуклеотидная же последовательность всех 19 099 генов этого червя, распределенных на площади в 97 миллионов пар оснований, была определена полностью. Еще больший успех связан с расшифровкой генома дрозофилы, лишь в 2 раза уступающего по размеру ДНК человека и в 20 раз превосходящего ДНК нематоды. Несмотря на высокую степень генетической изученности дрозофилы, около 10% ее генов были до этого момента неизвестны. Но самым парадоксальным является тот факт, что у высоко организованной дрозофилы количество генов оказалось меньше, чем у микроскопического круглого червя! С современных биологических позиций это трудно объяснить. Разработка геномных проектов сопровождалась интенсивным развитием многих областей науки и техники. Так, мощный импульс для своего развития получила биоинформатика - был создан новый математический аппарат для хранения, обработки и упорядочивания огромных массивов информации; сконструированы системы суперкомпьютеров, обладающих невиданной мощностью; написаны тысячи программ, позволяющих в считанные минуты проводить сопоставительный анализ различных блоков информации, ежедневно вводить в компьютерные базы новые данные, получаемые в различных лабораториях мира, и адаптировать новую информацию, к той, которая была накоплена ранее. Одновременно были разработаны системы для эффективной изоляции различных элементов генома и автоматического определения нуклеотидных последовательностей ДНК. На базе этих систем были сконструированы мощные роботы, значительно ускоряющие эти процессы и делающие их менее дорогостоящим. Развитие геномики, в свою очередь, привило к открытию огромного количества новых фактов. Значение многих из них еще предстоит оценить в будущем. Но и сейчас очевидно, что эти открытия приведут к переосмыслению многих теоретических положений, касающихся возникновения и эволюции различных форм жизни на Земле. Они будут способствовать лучшему пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе работы отдельных клеток и их взаимодействий; детальной расшифровке многих до сих пор неизвестных биохимических циклов; анализу их связи с фундаментальными физиологическими процессами. Таким образом, происходит переход от структурной геномики к функциональной, которая в свою очередь создает предпосылки для исследования молекулярных основ работы клетки и организма, в целом, как интегральных систем. Накопленная уже сейчас информация будет предметом анализа в течение нескольких ближайших десятилетий. Но каждый следующий шаг в направлении расшифровки структуры геномов разных видов, порождает новые технологии, облегчающие процесс получения информации. Так, использование данных о структуре и функции генов более низко организованных видов живых существ может значительно ускорить поиск специфических генов высших. И уже сейчас методы компьютерного анализа, используемые для идентификации новых генов, зачастую вытесняют более трудоемкие методы молекулярного анализа. Наиболее важным следствием расшифровки структуры генома определенного вида является возможность идентификации всех его генов и, соответственно, определения аминокислотной последовательности всех его белков. Таким образом, геномика создает фундамент для интенсивного развития новой науки - протеомики (протеин это синоним белка, его латинское название). Протеомика занимается изучением структуры и функции каждого белка; анализом белкового состава клетки; определением молекулярных основ функционирования отдельной клетки, являющегося результатом координированной работы многих тысяч белков, и исследованием формирования фенотипического признака организма, являющегося результатом координированной работы миллиардов клеток. Расшифровка структуры генома человека привела к сенсационному открытию. Оказалось, что в нашем геноме только 32 000 генов, что в несколько раз меньше количества белков. При этом белок-кодирующих генов только 24 000, продуктом остальных генов являются молекулы РНК. Процент сходства по нуклеотидным последовательностям ДНК между разными индивидуумами, этническими группами и расами составил 99,9%. Это то, что делает нас Homo sapiens! Вся наша изменчивость на нуклеотидном уровне определяется 0,1%. Если сопоставить эти цифры с длиной молекулы ДНК, то окажется, что около 100 000 мутаций формируют эту изменчивость. Примерно 70% этих мутаций определяют наши индивидуальные непатологические особенности. Немногим менее 5% составляют мутации, серьезным образом нарушающие структуру и функции кодируемых белков или даже приводящие к их полному отсутствию. Именно эти мутации связаны с тяжелыми моногенными болезнями человека. Кроме того, широкое распространение в популяциях получили такие мутации, которые в относительно небольшой степени влияют на функции кодируемых белков. Эти мутации, которые получили название полиморфизмов, рассматривают как варианты нормы. Но именно они формируют наследственную предрасположенность к наиболее частым мультифакториальным болезням человека. Открытие гена сопровождается изоляцией и клонированием его кодирующей области, так называемой молекулы комплементарной ДНК – кДНК. Для того чтобы определить, что такое кДНК, нужно вспомнить процесс транскрипции. Мы говорили, транскрипция это синтез молекулы РНК, комплементарной определенным участкам молекулы ДНК, то есть генам. А есть процесс обратной транскрипции, когда в качестве матрицы используется молекула РНК и с помощью определенного фермента, который так и называется – обратная транскриптаза – производится синтез молекул ДНК. Так, если взять какую-то специфическую молекулу мРНК и провести обратную транскрипцию получится очень важный класс молекул - кДНК. Вы помните, в мРНК уже нет интронов, и, проводя такой обратный синтез, можно получить молекулу ДНК, составленную из экзонов, то есть представляющую всю, как говорят полноразмерную кодирующую область гена. На следующем этапе молекулу кДНК клонируют. Клонирование это очень эффективный метод поддержания и размножения любых относительно небольших молекул ДНК путем их встраивания в вектор и введение этой конструкции в клетки-хозяина. Вектора обеспечивают проникновение чужеродных ДНК в клетки, и их конструируют на базе тех молекул, которым свойственно проникать в клетки, то есть вирусных или плазмидных ДНК. В качестве клеток-хозяина чаще всего используют бактериальные клетки. Клонированную кДНК условно называют «ген в пробирке», и на этом этапе можно работать с геном как с веществом. Можно наращивать число копий гена путем размножения клеток-хозяина, одновременно могут быть обеспечены условия для его работы или экспрессии. Так например, при клонировании генов человека в бактериях можно добиться синтеза в них чужеродных для этих клеток белков человека. Такая возможность определяется универсальностью генетического кода, то есть одинаковым прочтением информации, записанной в молекулах ДНК, клетками любого видового происхождения. Клонирование лежит в основе всей генной инженерии. На следующем этапе определяют нуклеотидную последовательность клонированной кДНК, то есть ее секвенируют. Это позволяет прогнозировать аминокислотную последовательность кодируемого белка и с использованием современных компьютерных технологий реконструировать не только его третичную структуру и доменную организацию, но и возможные функции. Эта методология получила название обратной генетики. Таким образом, важнейшим следствием завершения многих геномных проектов является возможность проведения анализа на белковый уровне. Переход от прогнозируемого или виртуального белка к реальному осуществляется за счет получения антител либо к искусственно синтезируемым полипептидам, гомологичным прогнозируемой полипептидной последовательности, либо к продукту экспрессии кДНК в клетках-хозяина. С помощью антител можно анализировать характер распределения этого белка in vivo в норме и при каких-то патологических состояниях, а также попытаться выделить его в препаративном количестве для прямого биохимического анализа и выявления тех метаболитов, которые взаимодействуют с этим белком. Что все это означает, если речь идет о заболевании в этиологии которого есть генетическая составляющая? Идентификация подобного белка означает нахождение первичного биохимического дефекта при данном заболевании. Выделение этого белка и его биохимический анализ означает расшифровку первичной патологической метаболической цепи или расшифровку молекулярных основ патогенеза заболевания. А это, в свою очередь, создает базис для разработки не симптоматических, а патогенетических методов лечения заболевания – одно из главнейших направлений современной молекулярной медицины. Анализ состояния генов у отдельных индивидуумов стал возможен после разработки метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), называемой также специфической амплификацией ДНК. Изобретение этого метода, удостоенное в 1993 году Нобелевской премии, оказало огромное влияние на развитие всей молекулярной генетики и явилось фундаментом для широкого внедрения этой методологии в медицинскую практику. Суть открытия заключается в том, что были разработаны условия для искусственного избирательного синтеза огромного числа копий небольшого фрагмента ДНК при использовании в качестве матрицы любой другой молекулы ДНК, которая может включать синтезируемую область. Небольшие размеры фрагмента и огромное количество копий позволяют использовать затем очень простые методы для детального анализа синтезированной ДНК, вплоть до определения ее нуклеотидной последовательности. ПЦР можно сравнить с очень мощным увеличительным стеклом, с помощью которого можно рассмотреть есть ли определенный очень небольшой участок в гигантской молекуле ДНК и как он устроен у конкретного индивидуума. Присутствуют ли в нем какие-нибудь мутации? При этом мы заранее знаем, какой именно участок хотим рассмотреть. Для правильного автоматического выбора этого участка необходимо искусственно синтезировать две пары совсем небольших молекул ДНК - праймеров, соответствующих началу и концу синтезируемого фрагмента. А это значит, что нужно знать, с чего начинается и чем заканчивается этот фрагмент. Поэтому метод ПЦР может быть применен к анализу только таких ДНК, нуклеотидные последовательности которых уже известны. Для того чтобы провести ПЦР, достаточно иметь ДНК исследуемого пациента, два типа праймеров, фермент, обеспечивающий комплементарный синтез ДНК (ДНК-полимеразу) и 4 типа молекул, являющихся предшественниками ДНК и состоящих из дезоксирибозы, фосфорной кислоты и одного из нуклеотидных оснований - А, Т, Г или С. В методическом отношении ПЦР очень проста. Вся реакция проводится в очень небольшом объеме, поэтому себестоимость диагностики с использованием ПЦР невелика. Она сопоставима со стоимостью обычного клинического анализа. Большим достоинством ПЦР является то, что для ее проведения не требуется большого количества ДНК и можно ограничиться анализом даже одной молекулы. В качестве образцов ДНК, наряду с чистыми препаратами, могут использоваться высушенные на фильтровальной бумаге пятна крови, смывы из полости рта, луковицы корней волос и тому подобный материал. Поэтому применение ПЦР особенно эффективно в тех случаях, когда имеется очень мало биологического материала для анализа, то есть в пренатальной диагностике, включая доимплантационную, при диагностике инфекций, а также в судебной медицине. Для анализа может использоваться также длительно хранившийся патологоанатомический материал. Молекулярный анализ такого материала может способствовать созданию условий для проведения пренатальной диагностики в тех семьях, в которых больной ребенок уже умер и не был при жизни обследован. В настоящее время практически вся молекулярная диагностика основана на ПЦР. Единые методические подходы используются как для диагностики моногенных заболеваний, так и для анализа генетической предрасположенности к мультифакториальным болезням. Различия будут только в выборе системы праймеров. Поэтому оправданным является создание унифицированных центров по молекулярной генетике человека, в которых одновременно может проводится ДНК-диагностика очень многих заболеваний. Одним из основных инструментов молекулярной медицины является ДНК-диагностика. Она выполняется с использованием стандартного набора методов, главным из которых служит полимеразная цепная реакция - ПЦР. В настоящее время подобная молекулярная диагностика принципиально возможна примерно для 1000 моногенных заболеваний. Подчеркнем еще раз, что для ее проведения необходима молекулярная идентификация гена, ответственного за развитие заболевания. Диагностика мутаций является самым объективным, а иногда и единственным критерием определенного моногенного заболевания. Она может проводится на любых стадиях развития, начиная с момента зачатия ребенка, и не зависит от времени появления первых симптомов заболевания. Таким образом, методы молекулярно-генетического анализа активно используются при диагностике моногенных болезней, включая пренатальную и досимптоматическую диагностику. Но еще более широкое распространение получила ДНК-диагностика при исследовании наследственной предрасположенности к наиболее частым мультифакториальным болезням человека. В настоящее во всем мире проводятся широкие комплексные исследования, в которые вовлечены десятки тысяч людей. Формируются группы больных по самым разным широко распространенным заболеваниям и контрольные группы. В каждой из них проводится тестирование различных полиморфных аллелей десятков генов - таких генов, которые предположительно могут иметь отношение к развитию заболевания. При этом для анализа выбирают те полиморфные аллели, которые оказывают повреждающее влияние на функцию кодируемых белков. Одновременно в этих группах проводится учет и средовых факторов риска. При обнаружении достоверных различий по частотам аллелей в группе больных по сравнению с контролем эти аллели рассматривают, как генетические факторы риска. Количественная оценка степени различия в частотах аллелей позволяет судить о вкладе того или иного гена в риск развития заболевания. На следующем этапе с использованием методов многомерной статистики проводят анализ вклада ген-генных, межсредовых и ген-средовых взаимодействий. Получаемые в ходе этого анализа количественные оценки позволяют достаточно надежно прогнозировать риск развития заболевания при сочетании определенного генотипа по исследуемым генам с параметрами, характеризующими образ жизни человека. Очень активно методы молекулярной генетики используются при анализе инфекционных заболеваний. Причем это касается не только разработки наиболее точных и высокочувствительных методов диагностики инфекций, основанных на ПЦР. Не менее важное значение имеют исследования геномов самих патогенных микроорганизмов и анализ молекулярных механизмов их взаимодействия с геномом человека. Организм человека является средой обитания для сотен видов бактерий и вирусов. С биологической точки зрения каждый из нас представляет собой целую систему сосуществующих организмов - симбионтов. Далеко не все из этих симбиотических микроорганизмов патогенные. Без некоторых видов бактерий человек просто не способен существовать и их утрата или снижение количества является причиной развития ряда тяжелых заболеваний. Расшифровка структуры геномов многих болезнетворных микроорганизмов с одновременной идентификацией всех белков, в том числе и вирулентных, является великолепной предпосылкой для разработки патогенетических методов предупреждения и лечения многих инфекционных болезней. Однако нужно отдавать себе отчет, что во многих случаях эта задача является очень непростой. Оказалось, что геномы многих паразитирующих микроорганизмов обладают огромной пластичностью и имеются значительные структурные различия между штаммами бактерий, обитающими в разных частях нашего организма. Метод ПЦР используется и в судебной медицине. Он лежит в основе геномной дактилоскопии - идентификации личности на основе молекулярного анализа высоко изменчивых маркерных участков ДНК, таких, например, как полиморфные нейтральные однонуклеотидные замены или вариабельные микросателитные повторы. Одинаковый характер маркерных аллелей у человека, подозреваемого в совершении преступления, и в образцах биологического материала, оставленного на месте совершения преступления, может интерпретироваться, как доказательство вины. Причем для проведения подобного анализа годится любой биологический материал, будь то пятна крови, кусочки кожи, волосы или сперматозоиды при изнасиловании. По точности заключения геномная дактилоскопия не уступает обычному дактилоскопическому анализу, но не всегда преступник оставляет отпечатки пальцев на месте совершения преступления. Этот же метод может быть использован для установления отцовства или идентификации останков погибших людей. В последнем случае необходимо обследование ближайших родственников предполагаемого погибшего. Заключение. Завершилась первая «структурная» часть проекта «Геном человека». В результате идентифицированы все гены человека и расшифрована их молекулярная природа. В ближайшие годы будут идентифицированы все белки человека и прочитана их аминокислотная последовательность. Значение этих открытий для молекулярной медицины трудно переоценить. Прежде всего, это приведет к существенному расширению списка заболеваний, анализ которых может осуществляться с использованием молекулярной методологии. Значительное развитие в этой связи получат диагностическое и профилактическое направления молекулярной медицины, основанные на анализе индивидуальных особенностей генома, формировании на этой базе групп риска по отдельным нозологиям и разработке способов предупреждения заболеваний до появления клинических симптомов и/или наступления каких-то необратимых патологических изменений. Открытия в области геномики порождают огромное количество этических, правовых и социальных проблем, причем таких, с которыми человечество раньше не сталкивалось. Мы немного касались этих вопросов при обсуждении генетического паспорта. Целые институты работают сейчас над изучением проблем адаптации человека и общества в целом к восприятию достижений генетики, ее проникновению не только в медицину, но и во многие другие области человеческой деятельности. Нет сомнения в том, что расшифровка структуры генома человека имеет определяющее значение для понимания его биологии и эволюции и в 21-ом веке будет сделано очень много открытий в этом направлении. Перечень основной и дополнительной литературы. |
Похожие:
 | Рабочая программа По дисциплине «Биология» (наименование дисциплины)... Фгос-3 впо по направлению подготовки (специальности) «Лечебное дело» (квалификация (степень) «специалист»), утвержденного приказом... | | Учебно-методический комплекс по дисциплине патологическая анатомии,... По специальности- лечебное дело- 060101 (по направлению подготовки- социальная работа 040400) |
 | Рабочая программа по дисциплине Нормальная физиология (наименование... Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования | | Учебно-методический комплекс по дисциплине «информационный менеджмент»... Код и наименование специальности по Перечню направлений подготовки (специальностей) 020300 |
| Учебно-методический комплекс по дисциплине «связи с общественностью»... Код и наименование специальности по Перечню направлений подготовки (специальностей) 020300 | | Учебно-методический комплекс по Акушерству и гинекологии (наименование... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «санкт-петербургский государственный медицинский... |
| Учебно-методический комплекс По дисциплине: лечебная физкультура Требования государственного образовательного стандарта (гос) по специальности «Лечебное дело» 060101 | | Рабочая учебная программа по дисциплине патофизиология, клиническая... Фгос впо по направлению подготовки (специальности) 060101. 65 Лечебное дело, утверждённым приказом Минобрнауки России от 8 ноября... |
| Рабочая программа учебной дисциплины «медицинская реабилитация» цикла... Рабочая программа дисциплины составлена в соответствии с федеральным государственным образовательным стандартом (фгос) высшего профессионального... | | Рабочая программа учебной дисциплины «медицинская реабилитация» цикла... Рабочая программа дисциплины составлена в соответствии с федеральным государственным образовательным стандартом (фгос) высшего профессионального... |
| Учебно-методический комплекс по Акушерству и гинекологии для специальности... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «санкт-петербургский государственный медицинский... | | Программа Анатомия человека Рекомендуется по специальности 060101... ... |
| Примерная программа наименование дисциплины Анатомия Рекомендуется... Дисциплина «Анатомия» относится к циклу математических и естественнонаучных дисциплин | | Примерная программа наименование дисциплины Фармакология Рекомендуется... Дисциплина «Фармакология» относится к циклу математических, естественнонаучных, дисциплин |
| Рабочая программа по дисциплине: гистология. Цитология, эмбриология... | | Форма освоения основной профессиональной образовательной программы... Квалификационная характеристика выпускника по специальности 060101 Лечебное дело |
