Учебно-методический комплекс по дисциплине «Молекулярная диагностика» (наименование дисциплины) Для специальности «лечебное дело» 060101,65 (наименование и код специальности)
Скачать 1.14 Mb.
|
Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Кафедра медицинской генетики Тема практического занятия: ГЕНЕТИКА ПАТОЛОГИЧЕКИХ ПРИСТРАСТИЙ Методические указания для преподавателей 2011 Цель практического занятия: Познакомить студентов с современными научными данными по проблеме генетической предрасположенности к патологическим пристрастиям (наркомании, табакокурение, патологическая склонность к азартным играм). Место проведения занятия: аудитория кафедры медицинской генетики. Занятие проходит в виде представлений сообщений студентов с последующим их обсуждением. Продолжительность практического занятия – 3 академических часа Средства обучения: Наглядные пособия – таблицы, слайды. Основным методическим пособием для студентов являются учебные пособия:
Обсуждаемые вопросы (темы реферативных сообщений):
Сообщения студентов по темам и обсуждение (3часа.) Содержание занятия: Зависимость от табака, так же как и зависимость от многих других наркотиков – комплексное поведение, различия в котором определяются как генетическими факторами, так и факторами внешней среды. Вклад наследственности в процессы, связанные с курением, рассчитанный в исследованиях на близнецах, варьирует от 46 до 84%, что говорит о значительном влиянии генетических факторов. Изучение генов-кандидатов выявило, что функциональные полиморфизмы в генах, кодирующих цитохромы P450, и вариации в этих генах, которые ведут к более быстрому никотиновому метаболизму, вовлечены в курение. Также, курение ассоциируется с полиморфизмами генов допаминергической системы, которые могут влиять на число и/или функцию допаминовых рецепторов. С помощью экспериментов на животных локализовали специфические субъединицы никотиновых рецепторов, которые могут опосредовать подкрепляющие свойства никотина, а также изучили их роль в никотиновой зависимости. Однако, было обнаружено, что факторы внешней среды также вносят вклад в риск инициации и продолжения курения. Мы рассматриваем научные доказательства, которые поддерживают роль генетических влияний на курение, обсуждаем специфические генетические и нейробиологические механизмы, которые могут опосредовать предрасположенность к никотиновой зависимости, идентифицируем возможные взаимодействия генов и внешней среды, которые могут быть важны для понимания поведения, связанного с курением, и предлагаем направления для будущих исследований. Понимание вклада генетических факторов в процессы курения потенциально может помочь разработать более эффективные стратегии борьбы с курением. Ежегодно курение табака является причиной порядка 3 миллионов смертей во всем мире, более 430,000 которых случается только в Соединённых Штатах. Т.к. курение является модифицируемым фактором риска, его лечение и предупреждение представляют огромные возможности для улучшения здоровья общества. Несмотря на общественную осведомлённость о рисках курения для здоровья, примерно 25% взрослых американцев продолжают курить, что делает необходимым точное понимание различных факторов, влияющих на курение. Хотя факторы среды, такие как влияние ровесников и реклама, могут влиять на курение, значительная определяющая продолжающегося употребления табака – зависимость от никотина. Клинические исследования выделили интересные индивидуальные различия в способность стать зависимым от никотина и способности бросить. В то время как генетические причины таких клинических вариаций предполагались более 40 лет назад, успехи в генетике поведения и молекулярной биологии возродили интерес к генетическим основам никотиновой зависимости. Генетические модели Считается, что курение – это комплексное, мультифакториальное поведение, которое определяется генетическими факторами и факторами внешней среды. Подходы к пониманию генетических влияний на курение включают следующие: (1) изучение индивидуумов, имеющих общие гены, включая исследования на близнецах, исследования семей, и исследования усыновлений; (2) ассоциативные исследования, исследования, построенные по типу случай-контроль, базирующиеся на сравнении неродственных поражённых и непоражённых индивидуумов из популяции; говорят, что аллель А интересующего гена ассоциирован с характерной чертой, если он встречается со значительно большей частотой среди поражённых индивидуумов по сравнению с контрольной группой; (3) исследования на животных, анализ инбредных, трансгенных и мутантных по какому-либо гену животных; преимущество исследования на животных состоит в возможности изучения большого количества генетически идентичных животных в контролируемых условиях; (4) linkage analysis, исследование уровня наследования фенотипов и генотипов у родственников. В то время как исследования семей, усыновлений, и исследования на близнецах внесли вклад в доказательство влияния генетических факторов, ассоциативные и linkage исследования улучшили наше понимание этих комплексных заболеваний. Развитие сложных математических моделей для анализа генетических данных позволило оценить относительную значимость генетических факторов и факторов среды. Исследование пар близнецов долгое время было популярным дизайном исследований по изучению генетических причин болезней. Исследования на близнецах обычно рассматривают уровни конкордантности интересующих особенностей. Если пропорция монозиготных близнецов конкордантных по данной особенности больше чем пропорция дизиготных близнецов, вероятно, что гены влияют на эту особенность. Если значительной разницы в уровнях конкордантности между монозиготными и дизиготными близнецами нет, тогда эта особенность вероятно подвержена влиянию факторов среды. Fisher (1958) впервые сообщил, что конкордантность курения значительно выше среди монозиготных, чем среди дизиготных пар близнецов мужского пола в германской популяции. Эти открытия были впоследствии подтверждены для близнецов женского пола из Германии и повторены в исследованиях, проведённых в Соединённых Штатах, скандинавских странах, Австралии, Великобритании и Японии, в популяциях взрослых, пожилых курильщиков и курильщиков-подростков. В то время как первые работы предполагали, что влияние наследственности на курение невелико, более новые исследования на близнецах включали большие объёмы выборок, лучшую характеристику фенотипов, и более сложные модели анализа данных. Эти исследования обнаружили значительные генетические влияния на некоторые аспекты связанного с курением поведения, такие как инициация и продолжительность курения, количество выкуриваемых сигарет и у мужчин, и у женщин. Влияние наследственности, рассчитанное для курения (то есть, пропорция различий в курении, которая объясняется генетическими факторами) в этих исследованиях варьировала от 46 до 84%, что сравнимо с уровнем влияния наследственности, рассчитанным для астмы, гипертензии, или алкоголизма. Например, в обширном исследовании на 4960 парах близнецов мужского пола, ветеранах второй мировой войны, за которыми наблюдали более 16 лет, Carmelli с коллегами сообщают, что уровень конкордантности был значительно выше среди монозиготных, чем среди дизиготных пар близнецов для отсутствия опыта курения, курения в настоящее время, и отказа от курения. В недавнем обзоре более 17500 воспитывавшихся вместе монозиготных и дизиготных близнецов из 14 разных исследований, было вычислено, что генетические факторы, факторы семейного окружения, и специфические для индивидуума внешние факторы риска ответственны соответственно за 56%, 24%, и 20% вариабельности в регулярном употреблении табака. Исследования близнецов воспитываемых отдельно, что позволяет проверить влияние семьи, также показали, что генетические факторы ответственны примерно за 60% вариабельности курения. Для изучения эффектов генетических влияний, в исследованиях близнецов используют параметр, называемый общим уровнем конкордантности (ОУК), который позволяет проверить разницу между уровнями конкордантности среди монозиготных и дизиготных пар близнецов. Если ОУК значительно больше 1, считают, что потенциальные генетические влияния присутствуют. Большинство исследований сообщают о значениях ОУК 1.3-1.6 для курения, что говорит об умеренном эффекте генетических факторов на различные аспекты связанного с курением поведения. Надо отметить, что социальные факторы, такие как курение среди сверстников и членов семьи, более низкий уровень образования, отсутствие у родителей беспокойства в отношении курения, и восприятие курения, провоцируемое табачными компаниями, также влияют на инициацию курения. Когда регулярное курение устанавливается, два важных фактора, которые позволяют предсказать продолжительное курение – это зависимость от никотина и низкий уровень образования. Исследователи рассматривали разные статистические модели для изучения взаимодействия генетических факторов и факторов среды в отношении курения. По-видимому, существуют некоторые генетические факторы, которые влияют и на инициацию, и на последующее курение, а также генетические факторы, которые уникальны для того или иного аспекта поведения, связанного с курением. Также оказалось, что риск инициации курения подвержен влиянию как факторов среды, так и генетических факторов, но последние могут вносить боле весомый вклад в продолжение курения. Хотя исследования на близнецах ясно показывают, что генетические факторы влияют на курение, полученные данные ограничены допущением, что монозиготные и дизиготные близнецы в одинаковой степени подвержены влиянию одних и тех же факторов среды. Однако было обнаружено, что монозиготные близнецы могут разделять более похожую среду, чем дизиготные пары, что может сильно увеличивать рассчитываемый уровень наследственности. В то время как исследования на людях не позволяют манипулировать индивидуальными генами и их продуктами, исследования на животных предоставляют возможность систематически изучать биологические влияния специфических генов на никотиновую зависимость. Несколько подходов к исследованию генетики животных оказались полезны для понимания никотиновой зависимости. Наиболее полезны из них те, которые используют инбредные штаммы, трансгенных мышей, и мышей-мутантов, у которых инактивированы те или иные гены. Инбредные штаммы получаются в результате внутриродового скрещивания таким образом, что животные гомозиготны по всем генетическим локусам. Соответственно, все члены инбредного штамма генетически идентичны. В сериях экспериментов Morrison и Lee, Hatchell и Collins, и Robinson с соавторами показали, что разные штаммы инбредных животных различаются по чувствительности к поведенческим и физиологическим эффектам никотина, включая развитие толерантности и чувствительность к создающим отвращение ответам, таким как вызываемые никотином припадки. Например, используя α [125I]-бунгаротоксин, как лиганд для никотиновых рецепторов, Miner с соавторами (1984) показали, что различия в чувствительности к индуцированным никотином припадкам очень сильно коррелируют (r2 = 0.64, p < 0.05) с количеством сайтов связывания бунгаротоксина в гиппокампе в 19 различных инбредных штаммах. Более того, судя по всему, генетические влияния определяют количество никотиновых рецепторов в головном мозге, которые опосредуют эффекты никотина. Наблюдаемые различия между инбредными штаммами подтверждают гипотезу о том, что генетические факторы могут вносить вклад в различия в предрасположенности к никотиновой зависимости среди людей. Трансгенные животные и животные-мутанты, у которых инактивирован какой-либо ген (Knock-out animals).Цель экспериментов knock-out – заместить специфический ген инактивированным или изменённым; биохимические изменения, наблюдаемые у таких животных могут обнаружить функцию белка, кодируемого геном. Например, используя мышей с knockout, Picciotto et al показали, что β-2 субъединица нейронального никотинового ацетилхолинового рецептора может опосредовать подкрепляющие свойства никотина, в то время как α-7 субъединица оказалась важна для никотинового воздействия в гиппокампе. Другие модели генетической инженерии, в которых сегмент ДНК из другого организма включался в зародыш животных, позволили ученым исследовать специфические рецепторы, которые могут опосредовать свойства никотина, приводящие к возникновению зависимости. Например, трансгенные мыши, у которых гиперэкспрессируется тирозиновая гидроксилаза, фермент, контролирующий скорость-лимитирующую стадию синтеза дофамина, оказались менее чувствительны к физиологическим эффектам никотина. Также было показано, что никотин повышает экспрессию тирозиновой гидроксилазы (TH) в клеточных культурах, что говорит о том, что дофаминергические механизмы могут быть важными медиаторами центральных эффектов никотина. Однако, важно отметить, что экспериментальные манипуляции с геном могут приводить к множеству неожиданных фенотипических изменений, что ограничивает валидность этих моделей и их применимость по отношению к человеку. Гены-кандидаты для курения Гены, влияющие на метаболизм никотина Накапливаются доказательства того, что на потребление табака могут оказывать влияние генетически определенные вариации группы ферментов семейства цитохрома P450 (CYP), в частности фермента CYP2A6, который участвует в метаболизме никотина, превращая его в котинин. Наряду с нормальным функциональным аллелем CYP2A6*1, было найдено ещё два варианта гена CYP2A6: CYP2A6*2 и *3; оба ассоциируются со сниженной активностью фермента. Pianezza et al показали, что частота встречаемости индивидуумов со сниженным метаболизмом никотина (т.е., носители аллелей CYP2A6*2 или *3) была значительно ниже среди зависимых от табака индивидуумов, чем в группе контроля. Возможный защитный эффект аллелей CYP2A6*2 и *3 был также продемонстрирован в исследованиях, показавших, что индивидуумы с этими аллелями курили значительно меньше сигарет в день и имели более высокую вероятность бросить курить. Другой фермент семейства цитохрома P450, CYP2D6, также вовлечён в окисление никотина до котинина. Индивидуумы, являющиеся гомозиготами по рецессивным дефектным аллелям (CYP2D6*3, *4 и *5), обозначаются как poor metabolizers. Индивидуумы, несущие одну или две копии функциональных CYP2D6*1 или *2 генов называются extensive metabolizers, и те, кто имеет более двух копий обозначаются, как ultrarapid metabolizers. В нескольких исследованиях изучался этот полиморфизм в связи с зависимостью от табака с противоречивыми результатами. Turgeon et al (1995) показали, что poor metabolizers были мало представлены среди курящих по сравнению с некурящими, что подтверждает гипотезу о том, что люди, у которых метаболизм никотина идёт медленно, с меньшей вероятностью проявляю склонность к курению. Однако, Cholerton et al (1996) не смогли найти разницу в генотипах CYP2D6 между курящими и некурящими. Позднее, тем не менее, та же группа заключила, что, хотя статус гена CYP2D6 не влияет на то, станет или не станет человек курить, но если всё же начинает, дальнейшее его поведение может зависеть от генотипа CYP2D6. Дальнейшее подтверждение связи данного генотипа с курением следует из докладов о том, что количество ultrarapid metabolizers среди курящих много было в четыре раза выше, чем среди некурящих и в два раза выше, чем среди курящих с непостоянными привычками. По-видимому, люди могут регулировать свой уровень курения в зависимости от генетически опосредованных различий в уровне никотина в крови. Связан ли генотип CYP2D6 с риском развития рака лёгкого, изучалось с противоречивыми результатами, и ассоциированный риск развития связанных с употреблением табака болезней пока не определён. Гены дофаминовой системы Мезолимбическая дофаминергическая система является необходимой для подкрепляющих эффектов некоторых наркотиков, вызывающих привыкание, включая никотин. Как показано на втором рисунке, никотин стимулирует высвобождение дофамина в прилежащем ядре, возможно, через активацию ацетилхолиновых рецепторов, расположенных в мезолимбических дофаминовых путях. Неудивительно поэтому, что исследователи изучают ассоциацию вариантов некоторых генов, контролирующих метаболизм дофамина, с никотиновой зависимостью. Гены дофаминовых рецепторов: Полиморфизмы в нескольких генах дофаминовых рецепторов были обнаружены и исследованы при болезнях привыкания к наркотикам. Например, Blum et al описали полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (TaqI) в 3’-нетранслируемой области гена дофаминового рецептора D2 (DRD2), с двумя возможными аллелями DRD2*A1 и *A2; первый показал ассоциацию со сниженной плотностью DRD2. Noble et al впервые показали значительно повышенную частоту аллеля DRD2*A1 среди курящих и куривших по сравнению с некурящими. Эти результаты были подтверждены в исследовании белых нелатиноамериканцев, которое показало, что 49% курильщиков являются носителями аллеля А1 по сравнению с 26% в группе контроля. Это исследование также показало значительную обратно пропорциональную взаимосвязь между частотой аллеля DRD2*A1 и возрастом начала курения, а также максимальной длительностью воздержания от курения. Такие взаимосвязи также наблюдались среди американских курильщиков мексиканского происхождения. Было сделано предположение о том, что индивидуумы-носители аллеля DRD2*A1 могут иметь меньшее количество дофаминовых рецепторов и более редкое с ними связывание и могут нуждаться в употреблении больших количеств никотина, увеличивающего уровень синаптического дофамина и, таким образом, быстрее становятся толерантными. Однако валидность ранних ассоциативных популяционных исследований была поставлена под вопрос из-за потенциального смешивания эффектов вследствие “population admixture”. Этот термин относится к неодинаковому распределению генов в популяции за счёт этнических или расовых различий индивидуумов, составляющих популяцию. Так как люди поражённые и непоражённые болезнью могут иметь различное этническое происхождение и, как кажется, существуют этнические различия в частоте аллелей, генетическая гетерогенность популяции может приводить к ложным результатам. Исследования, использующие семейные подходы для избавления от популяционных наслоений, не наблюдали ассоциации полиморфизма DRD2 с предрасположенностью к никотиновой зависимости. Как оказалось, ассоциация между склонностью к потреблению никотина и генотипом DRD2 может быть не такой значительной, как предполагалось в ранних исследованиях. Исследования других генов дофаминовых рецепторов сравнительно ограниченны. Shields et al оценили ассоциацию между длинными (L) и короткими (S) вариантами вариабельного тандемного повтора гена дофаминового рецептора D4. Исследование обнаружило что, афро-американцы, имеющие, по крайней мере, один L аллель, имеют повышенный риск курения и более ранний возраст начала курения, по сравнению с гомозиготными по S аллелю индивидуумами. Интересно, что эта ассоциация не наблюдалась среди белых. Так как L аллель ассоциирован с чертой личности “novelty-seeking”, авторы предположили, что этнические различия в их исследовании могут быть связаны с генетически опосредованными различиями в свойстве “novelty-seeking” между двумя этническими группами. Роль гена дофаминового рецептора D1 в никотиновой зависимости изучалась Comings et al как часть исследования, посвящённого изучению генов дофаминовых рецепторов среди курильщиков-пробандов синдрома Туретта и патологических игроков. Во всех трёх группах была значительно повышена частота индивидуумов с 1/1 или 2/2 генотипами по сравнению с контрольными индивидуумами, что позволяет предположить существование частичного совпадения основ генетической предрасположенности к аддиктивным формам поведения, возможно опосредованных аллельными вариантами гена DRD1. Ген транспортера дофамина: Белок, транспортирующий дофамин, экспрессируется геном SLC6A3, и вариации в гене дофаминового транспортера, как было показано, влияют на концентрации синаптическиого дофамина и ответы на него. Полиморфизм числа тандемных повторов был описан в этом гене; аллель с 9 повторами (SLC6A3-9) ассоциируется с болезнью избытка дофамина, а аллель с 10 повторами (SLC6A3-10) связан с состояниями, характеризующимися недостатком дофамина. Lerman et al обнаружили, что курильщики с гораздо меньшей вероятностью имели SLC6A3-9 генотип, чем некурящие. Также, курящие с SLC6A3-9 генотипом с большей вероятностью начинали курить в возрасте старше 16 лет, и бросали курить в прошлом на значительно более длительные периоды времени, чем курящие с другими генотипами. Ассоциация гена SLC6A3 с курением была особенно резко выражена у тех, кто имеет генотип DRD2-A2. Исследователи предположили, что повышенный уровень синаптического дофамина, связанный с генотипом SLC6A3-9 может играть защитную роль по отношению к курению, и это более вероятно у тех индивидуумов, которые имеют нормальную плотность DRD2. Эти данные частично подтвердились в исследованиях Sabol et al. в популящиях курящих, бросивших курить и некурящих. Они показали отсутствие ассоциации между геном SLC6A3 и началом курения, но значительная ассоциация была показана для прекращения курения. В обоих этих исследованиях эффективный размер был мал и были собраны смешанные выборки волонтёров, что повышает вероятность ошибок, связанных с особенностями набранной группы. Более недавнее исследование на общей выборке не смогло подтвердить эти результаты, что говорит о необходимости более твёрдых доказательств для понимания связи между геном дофаминового транспортёра и курением. Гены, влияющие на метаболизм дофамина: Различные ферменты, такие как TH, дофаминовая β-гидроксилаза, катехол-О-метил трансфераза (COMT), и моноамин оксидаза (MAO)-A и MAO-B, вовлечены в синтез и метаболизм дофамина. Хотя эти гены изучались в связи с некоторыми заболеваниями, такими как алкоголизм, депрессия и шизофрения, данные о связи с курением весьма ограниченны. Экспозиция к тобачному дыму, как было показано, уменьшает уровни MAO-A и MAO-B в мозге. В соответствие с этими исследованиями, Costa-Mallen et al показали небольшую ассоциацию между полиморфизмом в гене MAO-B и курением. Также, ассоциация между курением большого числа сигарет и вариациями в генах MAO-A и дофамин-β-гидроксилазы, но не COMT, была найдена в Британском исследовании, с более высокой взаимосвязью среди былых и женщин. Единственное исследование посвящённое изучению полиморфизмов в гене TH среди курильщиков показало отрицательные результаты. Серотонинергические и никотиновые гены Накапливаются доказательства того, что никотин повышает высвобождение серотонина в мозге, и что симптомы отмены при прекращении употребления никотина могут модулироваться сниженной серотонинэргической нейротрансмиссией. Транспортёр серотонина (5-HTT) привлёк внимание исследователей потому, что он регулирует величину и длительность серотониновой нейротрансмиссии. Был описан полиморфизм в 5’-промоторной области 5-HTT приводящий к образованию короткого и длинного вариантов аллеля. Вариант S ассоциируется со сниженной серотониновой экспрессией и захватом. Немногие исследования, посвящённые изучению роли гена 5-HTT в курении, привели к противоречивым результатам. В то время, как Lerman et al не нашли значительных различий в распределении генотипов 5-HTT среди курящих и некурящих, ассоциация между L-аллелем и курением была описана среди японской популяции. Эти противоречащие друг другу данные могут объясняться различиями в изучаемых популяциях и различиями в группировке генотипов. Более недавние исследования нашли взаимосвязь между полиморфизмом гена 5-HTT и невротизмом, и привыканием к никотину, что позволяет предположить, что никотиновая зависимость может подвергаться влиянию комбинации гена 5-HTT и свойства личности, связанного с беспокойностью, скорее, чем влиянию каждого фактора в отдельности. Вариации в гене 5-HTT также могут влиять на агрегацию тромбоцитов, что является фактором риска для заболеваний сердца; так как единственный ген отвечает за экспрессию 5-HTT в тромбоцитах и в мозге, может быть интересно выяснить возможность того, что риск для заболеваний сердца и никотиновой зависимости имеют общую генетическую предрасположенность, опосредованную через ген 5-HTT. Silverman et al обнаружили 5 новых однонуклеотидных полиморфизмов в гене, кодирующем α2 субъединицу никотинового ацетилхолинового рецептора, который, как было показано в экспериментах, использующих методику knock-out, опосредует подкрепляющие свойства никотина. Однако в обширном, хорошо спроектированном эксперименте, учёные не нашли ассоциации между 4 из этих полиморфизмов и курением; большее количество данных в этой области необходимо для того, чтобы вывести какие-нибудь ясные заключения о роли генов ацетилхолиновых рецепторов в курении. В таблице 1 суммированы основные результаты исследований кандидатных генов. Развитие техник клонирования, гибридизации и секвенирования позволило определить локализацию на хромосомах некоторых генов, влияющих на нейротрансмиссию. Два исследования предложили доказательства связи никотиновой зависимости с хромосомными регионами. Используя данные Совместного исследования Генетики Алкоголизма, Bergen et al выполнили linkage-analysis для двух связанных с курением свойств – статуса курения (курил/не курил) и пачка/лет, на парах братьев и сестёр. Были получены некоторые доказательства связи свойства курил/не курил с регионами на хромосомах 6, 9 и 14. Также, в исследовании, основанном на изучении родословных семей, Diggirala et al нашли убедительные доказательства взаимосвязи поведения, связанного с курением, и генетической локализацией на хромосомах 4, 15 и 17. Однако, всестороннее исследование с помощью linkage analysis, проведённое среди 130 семей из Новой Зеландии, с применением сканирования генома, не смогло обнаружить веского доказательства взаимосвязи курения с выбранными индивидуальными регионами на хромосомах 2, 4, 10, 16, 17 и 18; разноречивые результаты исследований могут быть связаны с различиями в клинических характеристиках фенотипа, присутствия сочетанного заболевания, такого, как злоупотребление алкоголем, или различающихся вкладов внешних влияний. К настоящему времени, данные, полученные с помощью linkage analysis, неубедительны, но, потенциально, они могут предоставить более определённые данные о вовлечённости специфических генов в регулирование никотиновой зависимости. Исследования на близнецах и на животных неизменно находят значительное генетическое влияние на развитие никотиновой зависимости. Хотя окончательные доказательства пока не найдены, вариации в некоторых кандидатных генах могут влиять на курение. Возможно, наиболее последовательные доказательства существуют для генов, кодирующих группу ферментов CYP, которая отвечает за усиленный метаболизм никотина, и для генов DRD2, которые регулируют функцию дофамина. Однако, важно отметить, что факторы окружающей среды также важные регуляторы курения. Лучшее понимание генетических влияний и влияний среды, и их взаимодействий должно усилить концепцию, рассматривающую табакокурение, как хроническое аддиктивное заболевание, при котором нужна помощь. К тому же, понимание того вклада, который вносит генетика, в курение потенциально может лечь в основу разработки более эффективных стратегий сокращения курения. Большая часть генетических данных была получена из исследований с дизайнами, которые имели ограничения при изучении комплексных форм поведения. Также, противоречивость большей части существующих на сегодняшний день данных ограничивает клиническое применение результатов. Становится всё более очевидным, что курильщики представляют собой негомогенную группу; более того, генетические влияния на разные стадии курения, такие как инициация, продолжение курения, отказ от курения, могут быть различны. Возможно исследователям необходимо изучать поведенческие различия, ведущие к зависимости от табака путём исследования хорошо описанных подгрупп курильщиков с ясно охарактеризованными фенотипами, и включения методологических подходов, спроектированных таким образом, чтобы обойти проблемы популяционных наслоений. Существуют предположения о том, что возможные кандидатные гены могут также включать гены, кодирующие опиоидные, каннабиоидные и глутаматные рецепторы. Так как несколько генов могут опосредовать никотиновую зависимость, применение более новых технологий, таких как чипы, которые позволяют быстро проводить скрининг и определение множества генных вариаций, может быть более эффективным и экономически выгодным. Также, предел, до которого факторы генетического риска являются общими для всех злоупотребляемых веществ, либо специфически определяют несходство индивидуальных наркотиков, включая никотин, нуждается в более точном определении. Рассматривая данные о этнических различиях в метаболизме никотина, своевременным выглядит то, что генетические исследования расширяются, чтобы вобрать различные этнические группы. Более важно то, что наряду с определением взаимодействий генов друг с другом, генетические исследования должны будут рассматривать взаимоотношения генов с другими биологическими факторами и факторами среды. Такой интегрированный подход может помочь развить более совершенные стратегии борьбы с курением. Наконец, исследователи должны принимать во внимание возможность того, что генетические маркеры курения потенциально могут быть неправильно использованы, и вопросы конфиденциальности и доступа к генетической информации, вероятно, приобретут в будущем большую значимость. Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Кафедра медицинской генетики Тема практического занятия: ТЕХНОЛОГИИ ГЕНОМНОГО АНАЛИЗА Методические указания для преподавателей 2011 Цель практического занятия: Познакомить студентов с высокопроизводительными аналитическими методами в биологии и медицине, дать представление о генетическом анализе в масштабе целых геномов. Место проведения занятия: аудитория кафедры медицинской генетики. Продолжительность практического занятия – 3 академических часа Средства обучения: Наглядные пособия – таблицы, слайды. Основным методическим пособием для студентов являются учебные пособия:
Обсуждаемые вопросы : 1. Высокопроизводительные аналитические подходы в современной биологии и медицине. 2. Сравнительная геномная гибридизация. 3. Исследование профилей экспрессии генов. Содержание занятия: Высокопроизводительные аналитические подходы стали возможны благодаря роботизации и миниатюризации лабораторного оборудования работающего под руководством специализированных программ. Хранение и анализ огромного объема информации, полученной в результате работы таких машин, потребовало использования сверхмощных компьютеров и целых компьютерных сетей и разработки программного обеспечения. Без внедрения таких технологий невозможно представить реализацию проекта "Геном человека". В процессе выполнения этого проекта намного ранее запланированных сроков была определена последовательность более 3000 миллионов нуклеотидных последовательностей человеческой ДНК. Сведения о строении 35000 генов человека, доступные всем исследователям, служат основой широкомасштабного изучения геномных нарушений, экспрессии различных генов и синтеза белка (http://genome.ucsc.edu). Все эти технологии находят или найдут в ближайшее время свое применение в медицинских исследованиях. Сведения, полученные в ходе сравнительного анализа генома различных растений, животных и человека, помогут определить функциональное значение различных генов и найдут практическое применение в сельском хозяйстве и программе сохранения растительного и животного мира Земли. Высокопроизводительный анализ геномной ДНК Сравнительная геномная гибридизация является широко используемым "низко технологичным" методом скринирования последовательностей ДНК, копийность которых в геноме увеличена или уменьшена. Смесь одинаковых количеств ДНК, выделенной из опухолевых и контрольных клеток и меченной соответственно красными и зелеными флюорохромами, гибридизируется с метафазами нормальных клеток. Участки генома, копийность которых повышена, выглядят красными, а участки генома, копийность которых ниже нормы, окрашиваются в зеленый цвет. Степень разрешения для утрачивающихся областей генома составляет около 1 млн. пар оснований. Амплификация (повышение копийности) может обнаруживаться и в случае меньшего размера затронутых участков генома при условии ее высокого уровня. Отдельные гены становятся видимыми, если они амплифицированы в 40 и более раз. При методологии "CGH" смесь ДНК опухолевых и нормальных клеток гибридизируется с панелью клонов ДНК, представляющих разные разведения целого генома или его частей. При этом подходе пространственное разрешение значительно выше, что дает возможность идентифицировать отдельные гены в участках генома с повышенной или пониженной копийностью. Использование панелей ДНК позволяет определять имеющиеся мутации генов, например гена p53, а также нуклеотидный полиморфизм (SNP). Последняя методика используется для поиска молекулярных маркеров в большой популяции или для поиска имеющихся различий в активности энзимов, участвующих в метаболизме. Исследование профилей экспрессии Недавняя модификация метода "CGH", известная как CESH (Chromosome Expressed Sequence Hybridization - гибридизация экспрессирующихся участков хромосом) является низко разрешающим методом скрининга генной экспрессии. Сравнение данных, полученных этим методом, с данными "CGH"-анализа показывает, приводит ли амплификация участков генома к повышенному уровню экспрессии вовлеченных генов, что вовсе не является обязательным. Большим достижением стало использование микропанелей (micro-arrays), позволяющее изучать уровень экспрессии каждого из генов в тканях и клетках определенного типа или опухолях. Репрезентативные клоны или синтезированные олигонуклеотиды всех или выбранных генов наносятся в виде точек на стекла или микрочипы. В случае использования стекол панели затем гибридизируются с кДНК, полученными из мРНК исследуемых тканей/клеток, и одновременно с контрольными кДНК, мечеными соответственно красными и зелеными флюорохромами. Чем выше уровень экспрессии гена в исследуемой ткани, тем сильнее будет представлена в ней кДНК данного гена по сравнению с контролем. Таким образом, после гибридизации сильно экспрессирующиеся гены будут выявляться в виде красных точек, а слабо экспрессирующиеся гены - в виде зеленых точек. Этот метод позволяет в результате одной гибридизации определить профиль экспрессии всех 35000 генов в исследуемой ткани. Так как характеристики и поведение тканей/клеток определяются активностью их генов, профили генной экспрессии могут быть использованы для предсказания поведения опухоли, в частности ее метастатического потенциала и ответа на терапию. Чтобы быть полезными в клинике, профили генной экспрессии должны быть более информативными, чем существующие диагностические и прогностические критерии, такие как клинические характеристики и морфология. Van 't Veer и соавторы определили уровень экспрессии 25000 генов у больных раком молочной железы с помощью микропанелей Rosetta. Экспрессия была определена у 78 больных спорадическим операбельным раком молочной железы, из которых у 34 отмечено прогрессирование заболевания в течение 5 лет. Выявленная разница в экспрессии отдельных участков ДНК между больными с отдаленными метастазами и без таковых была наиболее значимым прогностическим фактором прогрессирования заболевания, чем стадия, возраст и другие клинические факторы. Из 25000 генов определены 70 генов, экспрессия которых различна в группе больных с прогрессированием болезни и больных, наблюдавшихся без отдаленных метастазов. Данная информация может быть полезна при назначении адъювантной терапии, поскольку достоверно выявляет прогностически благоприятную группу больных, не нуждающихся в адъювантной терапии. В этом же исследовании они сравнили профиль экспрессии различных генов у 78 больных спорадическим раком и у 18 больных раком молочной железы с мутацией генов BRCA1 и 2. Выявлено существенное различие в экспрессии генов между этими двумя группами больных. Протеомика Хотя масс-спректрометрия была предложена более 100 лет назад Нобелевским лауреатом сэром Томсоном, только недавно были разработаны спектрометры высокой разрешающей способности и чувствительности, такие как MALDI-tof (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization time-of-flight), используемый в протеомике. При этом небольшое количество (несколько фентамоль) неизвестного белка, полученного с помощью электрофореза, разрушают с помощью трипсина на отдельные фрагменты различной длины и массы. Воздействие на эти фрагменты лазерным излучением высокой энергии приводит к их ионизации и перемещению в вакуумной трубке к детектору. Скорость перемещения фрагмента белка будет зависеть от его массы, и детектор позволяет определить время от начала ионизации до момента достижения детектора. Таким образом, по характеру фрагментов создается масс-спектрометрический профиль изучаемого белка. Для всех известных белков такой профиль уже известен, для неизвестных он хранится в памяти, и для него пытаются найти ген, ответственный за его продукцию. Такой прибор как MALDI-tof масс-спектрометр дает возможность проанализировать сотни образцов белков за один час, что позволяет приблизиться к решению задачи охарактеризовать все белки человеческого организма. В прошлом году инициирован проект "Human Proteom Organization" (HUPO), целью которого является картирование и характеристика всех белков человеческого организма до 2005 г. Существует множество возможностей прикладного использования протеомики в онкологических исследованиях. Например, путем сравнения картин двумерного электрофореза белков, выделенных из разных опухолей, можно изолировать белки, экспрессия которых закономерно повышается или понижается в клетках определенных новообразований. MALDI-tof позволяет быстро идентифицировать все дифференциально экспрессирующиеся белки, а следовательно дает возможность понять, что именно определяет фенотипические различия, такие как чувствительность к химиотерапевтическим агентам. Petricoin и соавторы в своей фундаментальной работе показали значение протеомики для диагностики рака яичников. Они сравнили протеомические свойства плазмы больных, страдающих раком яичников и различными доброкачественными образованиями. На основании этих особенностей плазмы удалось правильно определить больных c I стадией рака яичников и тех, кто имеет II-IV стадии. Из 66 больных доброкачественными новообразованиями яичника у 3 был неправильно диагностирован рак яичников. Складывается впечатление, что воспалительные заболевания и доброкачественные опухоли имеют собственные характерные профили экспрессии белков. Авторы подчеркивают, что разработанный неинвазивный метод диагностики позволяет проводить эффективный скрининг ранних форм рака яичников у носителей мутации BRCA1 and BRCA2. Остается разработать программное обеспечение, которое позволит проводить подобную диагностику (белее подробно www.clinicalproteomics.steem.com). Если данная методика может быть воспроизведена для других форм рака, то тогда изучение протеомики плазмы может быть использовано для ранней диагностики и стадирования злокачественных опухолей. Сегодня становится очевидной важность создания коллекций различных опухолей с данными о характере заболевания, лечении и его результатах, а также образцов нормальных тканей и биологических жидкостей здоровых лиц и больных для проведения исследований на основе высокопроизводительных аналитических подходов. Первоочередным является создание международных коллекций биологических образцов для проведения совместных исследований. Тканевые микропанели Tканевые микропанели (tissue micro-arrays) представляют собой коллекцию микрообразцов нормальных и опухолевых тканей, полученных из сотни или даже тысячи гистологических блоков, для проведения быстрого иммуногистохимического анализа с целью определения экспрессии изучаемого протеина. Выявленные с помощью высокопроизводительных аналитических подходов маркеры затем могут быть использованы в клинической практике. |
Похожие:
 | Рабочая программа По дисциплине «Биология» (наименование дисциплины)... Фгос-3 впо по направлению подготовки (специальности) «Лечебное дело» (квалификация (степень) «специалист»), утвержденного приказом... | | Учебно-методический комплекс по дисциплине патологическая анатомии,... По специальности- лечебное дело- 060101 (по направлению подготовки- социальная работа 040400) |
 | Рабочая программа по дисциплине Нормальная физиология (наименование... Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования | | Учебно-методический комплекс по дисциплине «информационный менеджмент»... Код и наименование специальности по Перечню направлений подготовки (специальностей) 020300 |
| Учебно-методический комплекс по дисциплине «связи с общественностью»... Код и наименование специальности по Перечню направлений подготовки (специальностей) 020300 | | Учебно-методический комплекс по Акушерству и гинекологии (наименование... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «санкт-петербургский государственный медицинский... |
| Учебно-методический комплекс По дисциплине: лечебная физкультура Требования государственного образовательного стандарта (гос) по специальности «Лечебное дело» 060101 | | Рабочая учебная программа по дисциплине патофизиология, клиническая... Фгос впо по направлению подготовки (специальности) 060101. 65 Лечебное дело, утверждённым приказом Минобрнауки России от 8 ноября... |
| Рабочая программа учебной дисциплины «медицинская реабилитация» цикла... Рабочая программа дисциплины составлена в соответствии с федеральным государственным образовательным стандартом (фгос) высшего профессионального... | | Рабочая программа учебной дисциплины «медицинская реабилитация» цикла... Рабочая программа дисциплины составлена в соответствии с федеральным государственным образовательным стандартом (фгос) высшего профессионального... |
| Учебно-методический комплекс по Акушерству и гинекологии для специальности... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «санкт-петербургский государственный медицинский... | | Программа Анатомия человека Рекомендуется по специальности 060101... ... |
| Примерная программа наименование дисциплины Анатомия Рекомендуется... Дисциплина «Анатомия» относится к циклу математических и естественнонаучных дисциплин | | Примерная программа наименование дисциплины Фармакология Рекомендуется... Дисциплина «Фармакология» относится к циклу математических, естественнонаучных, дисциплин |
| Рабочая программа по дисциплине: гистология. Цитология, эмбриология... | | Форма освоения основной профессиональной образовательной программы... Квалификационная характеристика выпускника по специальности 060101 Лечебное дело |
