Биодеструкция зубных протезов из полимерных материалов (экспериментальное исследование) 14. 01. 14 Стоматология

24 час ИНКУБАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМЫ 792 П О В Е Р Х Н О С Т И БАЗИСНЫЕ ПЛАСТМАСС Ы Стафилококк Денталур 48 час Синегнойная Палочка Фторакс 7 сут Энтерококк 14 сут Кандида Пластмасса бесцветная су 1,5 мес Рис. 1. Общий дизайн исследования Поверхности образцов базисных пластмасс были изучены с помощью двулучевого сканирующего электронного микроскопа Quanta 200 3D (FEI Company, USA) в режимах высокого, низкого вакуума и естественной среды при ускоряющих напряжениях 5, 10, 25 кВ. Перед исследованием проводилось напыление нанослоем золота толщиной 5 нм в напылительной установке (SPI Inc., USA). Съемка образцов производилась на увеличениях в диапазоне от х 40 до х 20 000. Образцы базисных пластмасс после инкубации с микроорганизмами были фиксированы по двум методам: Ito-Karnovsky и в 10% формалине. После инкубации микроорганизмов с образцами пластмасс из инкубационной среды путем центрифугирования при 8 000 об/мин были получены осадки культур, которые были изучены методом электронной трансмиссионной микроскопии на микроскопе JEOL-100 B (Jeol Ltd, Japan) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Для оценки подповерхностных изменений структуры базисных пластмасс под воздействием бактерий была произведена резка ионным (галлиевым) пучком контрольных и опытных образцов в двулучевом сканирующем микроскопе Quanta 200 3D. На поверхности опытных образцов выбирали участки, покрытые массивным слоем образовавшейся биопленки. Изучение химического состава пластмасс проводили методом рентгеновского микроструктурного анализа с помощью приставки к СЭМ Genesis XM2 EDAX (USA). Для набора спектра излучения потенциально выявляемых микроэлементов ускоряющее напряжение составляло 10 и 25 кВ. Для дезинфекции и эрадикации сформировавшейся биопленки на поверхности полимерных зубопротезных материалов использовали метод ультразвуковой обработки в ванночке (фирма «Геософт-дент» (Россия), мощностью 25 Вт), генерирующей ультразвуковые волны частотой 50/60 Гц. Эффективность воздействия вышеуказанного метода на биопленку поверхности пластмасс после их инкубации с микроорганизмами, оценивалась в сканирующем электронном микроскопе. Интактные образцы пластмасс (контроль), также подвергали ультразвуковой обработке на тех же режимах и анализировали в СЭМ Quanta 200 3D (FEI Company, USA). Для оценки площади обрастания биопленкой образцов зубопротезных пластмасс применяли программу “Scandium” (Olympus, Japan). Выделенное поле поверхности образцов зубопротезных пластмасс и область биообрастания контурировали с помощью инструмента «лассо». Площадь выделенных областей измерялась в пикселях. Всю площадь поля принимали за 100%. Соответственно, области биообрастания составляли искомую долю в процентном выражении. Статистический анализ полученных данных проводили по общепринятой методике с помощью электронной таблицы Microsoft Excel с использованием программного пакета «Statistica 6.0». Табличные данные представлены в виде средних значений, среднеквадратического отклонения и ошибки выборки. Экспериментальная часть исследования была выполнена в ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалея МЗ РФ на базе «Лаборатории анатомии микроорганизмов» (зав. лабораторией, д.м.н. Диденко Л.В.). Основные результаты исследования По данным исследования методом СЭМ структурная организация гладкой, шероховатой поверхностей, поверхностей спила и скола у всех изученных базисных пластмасс «Денталур», «Фторакс», «Пластмасса бесцветная» принципиально одинакова. Полированная поверхность интактных образцов была относительно гладкой, с единичными мелкими крошками на поверхности. Следы механических повреждений, образующиеся при полировке, выглядели как неглубокие царапины (Рис.2а). Шероховатая поверхность была неровной, с выступающими гребнями и большим количеством крошки (Рис.2 б). Спил выглядел как волокнистая структура, практически с параллельным расположением волокон и частицами пластмассы в виде крошек разной величины (Рис.2в). Скол образцов пластмасс «Денталур», «Фторакс» и «Пластмасса бесцветная» имел относительно гладкую поверхность, в рельефе наблюдались участки неодинаковой высоты, но при этом царапин и крошек не отмечалось (Рис. 2г). У всех образцов в отдельных участках полированной поверхности выявлялись дефекты в виде округлых «вздутий» и их разрывов, внутри которых была видна гладкая поверхность. Скорее всего, причиной появления такого рода дефектов является локальная термическая нагрузка на образец при полировке. Аналогичные изменения происходили под влиянием электронного пучка при исследовании в СЭМ. Механические повреждения пластмасс в процессе их обработки, границы раздела поверхностей являются объектом для успешной колонизации бактериями и грибами. В последнюю очередь микроорганизмы колонизируют гладкую поверхность. а б г в д Рис.2 Микроскопическая картина поверхностей пластмассовых образцов: а – гладкая поверхность (х2000), б –шероховатая поверхность (х2000), в –спил (х2000), г – скол (х2000), д – вздутия на гладкой поверхности (х8000) Химический состав базисных пластмасс, изученный с помощью рентгеновского микроструктурного анализа, показал, что основными химическими элементами базисных пластмасс являются углерод, кислород, (водород этим методом не определяется). Кроме этого были выявлены примеси азота, кальция, кремния, а в базисной пластмассе «Фторакс» - фтор. Применение этого метода при изучении процессов биодеструкции является важным моментом, поскольку различные примеси в материалах могут являться источником необходимых питательных веществ для микроорганизмов, или же обладать биоцидным действием, а также влиять на заряд поверхности. Принято считать, что совокупный заряд поверхности полимеров отрицательный, поэтому отрицательно заряженным микроорганизмам необходимо преодолеть силы отталкивания. По последним данным, поверхность полимеров состоит из мозаики наноскопических областей, имеющих разные по знаку заряды. Причины, по которым возникают области с другим зарядом, до сих пор изучены крайне недостаточно [Baytekin H. T. et all., 2011]. Обнаружение примесей в базисных пластмасах может являться ключевым моментом для изучения процессов биодеструкции и в разработке способов ее профилактики. При исследовании в сканирующем электронном микроскопе Quanta 200 3D образцов пластмасс, инкубированных с грамположительными и грамотрицательными бактериями, можно было четко проследить следующие этапы: 1. Появление налета на поверхности (безмикробная пленка). 2. Адгезия бактерий к поверхности. 3. Образование микроколоний (объединение нескольких бактериальных клеток в единую группу). 4. Слияние отдельных микроколоний между собой при одновременной инициации синтеза клетками экзоклеточного матрикса. 5. Формирование зрелой биопленки, полностью покрытой экзоклеточным матриксом. 6. Образование номад - отпочковывание от зрелой биопленки бактерий, покрытых экзоклеточным матриксом. 7. Растрескивание биопленки и выход бактерий из нее. Скорость образования биопленки, интенсивность обрастания поверхности, формирование номад и растрескивание биопленки зависит от вида бактерий, разновидности базисной пластмассы и характеристик ее поверхности (гладкая, шероховатая, спил, скол, наличие повреждений). Стафилококки адгезировали и формировали микроколонии на поверхности пластмасс на ранних сроках взаимодействия с пластмассами. К 7 суткам инкубации происходило слияние микроколоний и образование биопленок. Плотный экзоклеточный матрикс формировал ветвистые структуры, в которых были хорошо видны округлые отверстия. С увеличением срока инкубации происходило объединение биопленок между собой, и дальнейшее увеличение ее суммарной биомассы происходило за счет ее толщины. При растрескивании стафилококковой биопленки можно было оценить ее толщину, которая составляла несколько микрон (от 1 до 5 мкм). Помимо этого происходила отшнуровка от материнской биопленки округлых образований, представляющих собой совокупность бактерий, заключенных в экзоклеточный матрикс (номады). Выход бактерий из зрелой биопленки при растрескивании и отшнуровка номад обеспечивают распространение бактерий в окружающей среде. Синегнойная палочка также, как и стафилококки, активно колонизировала поверхность зубопротезных пластмасс. В отличие от стафилококка колонизация происходила посредством скользящего роста бактерий по поверхности пластмассы, что обеспечивало быстрое обрастание поверхности искусственного материала. Образование биопленки бактериями наступало по мере истощения питательных веществ в инкубационной среде. По сравнению с культурой Staphylococcus aureus на ранних сроках (24 и 48 час) в культуре Pseudomonas aeruginosa при инкубации с пластмассами менее интенсивно синтезировался экзоклеточный матрикс, то есть образование биопленки наступало несколько позже. С течением времени формировалась ярко выраженная биопленка, на поверхности которой формировались номады. Также наблюдалось растрескивание биопленки, которое было менее выражено по сравнению со стафилококковой биопленкой. При инкубации пластмасс с Enterococcus faecium на сроках 24 – 48 часов на гладкой и шероховатой поверхности базисных полимеров обнаруживались единичные клетки. К 14 дню инкубации на поверхностях можно было видеть отдельно лежащие скопления бактерий, с минимально выраженным экзоклеточным матриксом, и только к 1,5 месяцам наблюдения можно было видеть биопленки на поверхности пластмасс, которые занимали очень незначительную площадь по сравнению с биопленками, образованными стафилококками и синегнойной палочкой. При инкубации полиуретана с Cаndida albicans к 7 дню вся поверхность покрывалась налетом разной электронной плотности, в котором обнаруживались адгезированные хламидоспоры. Биопленок, морфологически подобных тем, что образовывали грамположительные и грамотрицательные бактерии, грибы на ранних сроках не образовывали. Было обнаружено, что на этих сроках экзоклеточный матрикс только частично покрывал дрожжевые клетки. На поверхности базисных полиметилметакрилатных пластмасс грибы формировали гифы и псевдомицелий. К 1,5 месяцам инкубации на поверхности пластмасс образовывалась плотная пленка с включениями частиц полимеров, и кроме этого на ее поверхности визуализировались псевдогифы и хламидоспоры. Подобно бактериальным биопленкам, у Candida albicans при формировании биопленки сохраняется возможность распространения в окружающей среде посредством хламидоспор, которые, как было установлено в данном исследовании, активно колонизируют искусственные поверхности. Последовательность развития бактериальных биоповреждений у всех изученных видов пластмасс можно представить в следующем виде: 1. Бактерии при взаимодействии с материалами на ранних этапах (24, 48 час) концентрировались в участках с механическими повреждениями поверхности (царапины, микротрещины и.т.п.). Единичные адгезированные бактерии, как правило, не вызывали разрушение поверхности пластмасс. 2. Минимальные повреждения пластмасс визуализировались при появлении микроколоний. Они характеризовались увеличением линейных размеров царапин, трещин, углублений и сопровождались выкрашиванием материала. 3. Наиболее выраженные биоповреждения были выявлены при появлении на поверхности пластмасс биопленок. По периферии биопленок, в основном, можно было видеть трещины, а при удалении ультразвуком с поверхности образцов биопленок в подбиопленочном пространстве были выявлены грубые дефекты в виде глубоких трещин и каверн. 4. На поздних сроках наблюдения (1,5 мес) с поверхности пластмасс происходила десквамация биопленок с интегрированными в них частицами полимера. 5. При изучении образцов в электронном сканирующем микроскопе Quanta 200 3D под воздействием электронного пучка происходит образование дефектов поверхности. Установлено, что в образцах, инкубированных с микроорганизмами, время воздействия на образец электронного пучка, приводившего к образованию дефекта, было значительно меньше, чем при действии на контрольные образцы. Наряду с принципиально одинаковым характером процесса биоповреждений следует отметить наличие некоторых особенностей, связанных с разной анатомической организацией изученных бактерий – стафилококки относятся к грамположительным бактериям, а синегнойная палочка – к грамотрицательным. При стафилококковой биодеструкции характерным было образование очень глубоких трещин, приводящих к образованию крупных осколков полиуретана («Денталур») (Рис.3). Исследование ультратонких срезов стафилококков, инкубированных с полиуретаном, показало наличие мелких частиц полиуретана в цитоплазме бактерий и на поверхности клеточной стенки (Рис. 4). Аналогичная картина взаимодействия Staphylococcus aureus наблюдалась и с другими образцами. а б в г Рис. 3. Взаимодействие Staphylococcus aureus c «Денталур». Образование глубоких трещин и слущивание крупных частиц пластмассы: а – биопленка (х15000), б – трещина (х30000), в - слущивание частиц (х15000), г - образование объемного дефекта (х70).

Похожие:

	Экспериментальное обоснование применения временныхнесъемных зубных... Для общества вопрос о знании этих социальных институтов и умении направлять их развитие имеет первостепенное значение уже потому,...		Сныткин Владислав Анатольевич Обоснование применения пластиночных... Ена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический...
	Российской Федерации Государственное бюджетное образовательное учреждение... Ортопедическое лечение дефектов твердых тканей зубов и зубных рядов несъемными конструкциями зубных протезов		Характеристика и свойства конструкционных полимерных материалов Наверно, каждая хозяйка мечтает обставить комнаты красивой, прак­тичной мебелью. Но мало кто знает, при помощи каких материалов она...
	Клинико-экспериментальное применение зубных эликсиров для лечения... Российской Федерации от 17. 12. 2012 №1069н «Об утверждении случаев, в которых возможна сдача крови и (или) ее компонентов за плату,...		Методические указания по выполнению реферата по дисциплине "процессы... Методические указания предназначены в помощь студентам при выполнении реферата по дисциплине "Процессы соединения, сборки и ремонта...
	Клинико-организационные аспекты использования цельнокерамических... Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный...		Методические указания по выполнению рефератов по дисциплине "Механика... Методические указания предназначены в помощь студентам при выполнении рефератов по дисциплине "Механика деформирования и разрушения...
	Методические указания по выполнению рефератов по дисциплине "Механика... Методические указания предназначены в помощь студентам при выполнении рефератов по дисциплине "Механика деформирования и разрушения...		Совершенствование методов диагностики и эндодонтического лечения... Методические рекомендации предназначены для медицинских работников, оказывающих первичную медико-санитарную помощь: врачей стоматологического...
	Методические указания по выполнению рефератов по дисциплине "Физика... Методические указания предназначены в помощь студентам при выполнении рефератов по дисциплине "Физика и химия процессов получения...		Рабочая учебная программа дисциплины протезирование зубных рядов Фгос впо по направлению подготовки (специальности) 060201- стоматология, утвержденному приказом №16 Министерства образования и науки...
	Разработка полимерного низкочастотного виброизолятора с квазинулевой жесткостью Проведено аналитическое исследование разрабатываемого виброизолятора, его изготовление и экспериментальное исследование. Частота...		Содержание Тюленёва А. Н., Осипенко М. А., Няшин Ю. И. экспериментальное и теоретическое исследование процесса иммобилизации микроорганизмов...
	Исследовательская работа Автор работы Экспериментальное исследование, направленное на определение оптимального конструктора веб-сайта в школьных условиях		Синергетическая модель концепта «жизнь»: экспериментальное исследование Работа выполнена на кафедре английского языка Тверского государственного университета