Министерство образования и науки Российской Федерации
Сибирский федеральный университет
АНТИБИОТИКИ
Методические указания к практическим занятиям
Красноярск
СФУ
2012
УДК
ББК
А
Рецензенты:
Составители: Н.И. Сарматова
А Антибиотики: Методические указания к практическим занятиям [Текст] / сост. Н.И. Сарматова. – Красноярск: Сиб. федер. ун-т, 2012. – 29 с.
ISBN
Методические указания составлены в соответствии с учебным планом и программой по дисциплине «Антибиотики». Пособие содержит тематический план практических занятий, контрольные вопросы; представлены источники основной и дополнительной литературы в соответствии с темами дисциплины. Методические указания предназначены для студентов, обучающихся по направлению «Биология», магистерская программа «Микробиология и биотехнология».
Н.И. Сарматова
ФГАОУ ВПО «Сибирский федеральный
университет», 2012
СОДЕРЖАНИЕ
общие сведения
Наука об антибиотиках – сравнительно молодая синтетическая ветвь современного естествознания. Но в, то, же время одна из стремительно развивающихся отраслей биологической науки. Она представляет интерес не только для теоретиков, изучающих биологические процессы, протекающие в микробной клетке, но и для специалистов – биотехнологов, экологов, биохимиков. Это связано с поиском новых антибиотических веществ, который проводится как с применением традиционных, так и новых методов, включающих использование клеточной и генной инженерии, приемов, способствующих пробуждению «молчащих» генов, ответственных за биосинтез антибиотиков. Велика роль исследований, решающих такие конкретные задачи:
- подавление в клетках патогенного микроорганизма определенной мишени; получение препаратов, устойчивых к деструктивному воздействию ферментов микроорганизмов;
- выделение антибиотических веществ, инактивирующих ферменты, разрушающие практически ценные антибиотики;
- выделение биологически активных соединений, подавляющих развитие резистентных микроорганизмов.
Не уменьшается интерес исследователей и практиков к химической и биологической модификации широко известных и новых антибиотиков. Следует изучать и то негативное влияние, которое оказала наука об антибиотиках и ее практическое применение, на экологическую стабильность нашей планеты. Несомненно, наука об антибиотиках имеет большое познавательное и практическое значение.
Целью преподавания дисциплины является формирование у студентов-биологов глубоких базовых теоретических и практических знаний в области науки об антибиотиках с точки зрения современных представлений о возможности получения наиболее эффективных антибиотических веществ и разработки подходов к практическому применению средств, снижающих возникновение устойчивых к ним форм микроорганизмов.
Задачами изучения дисциплины «Антибиотики» являются:
формирование умений и навыков использования стандартных микробиологических методов для обнаружения и выделения микробов – продуцентов антибиотических веществ
знакомство с современными методами и условиями культивирования микроорганизмов - продуцентов антибиотических веществ при лабораторном и промышленном культивировании
Дисциплина читается на 2 курсе обучения по магистерской программе 020400.68.01 «Микробиология и биотехнология». Общая трудоемкость дисциплины составляет 72 часа. Аудиторные занятия составляют 33,3 % общего времени, отведенного на изучение дисциплины, на практические занятия отводится 16 часов.
Таблица 1. Объем дисциплины и виды учебной работы
Вид учебной работы
|
Всего
зачетных
единиц
(часов)
|
Семестр
|
12
|
Общая трудоемкость дисциплины
|
2,0 (72)
|
2,0 (72)
|
Аудиторные занятия:
|
0,67 (24)
|
0,67 (24)
|
Лекции
|
0,22 (8)
|
0,22 (8)
|
Практические занятия (ПЗ)
|
0,44 (16)
|
0,44 (16)
|
Самостоятельная работа:
|
1,33 (48)
|
1,33 (48)
|
изучение теоретического курса (ТО)
|
1,11 (40)
|
1,11 (40)
|
реферат
|
0,22 (8)
|
0,22 (8)
|
Вид итогового контроля
|
зачет
|
зачет
|
1 СОДЕРЖАНИЕ И МЕТОДИКА ПОДГОТОВКИ К СЕМИНАРСКИМ ЗАНЯТИЯМ
Для подготовки к практическим (семинарским) занятиям студенты получают темы за неделю да начала занятия, подбирают и изучают материал, прорабатывая основную и дополнительную литературу.
При подготовке к занятию студенты должны пользоваться пособием по методическому обеспечению самостоятельной работы, в котором приведен список вопросов для самоподготовки по темам семинарских занятий. Вопросы для самоподготовки помогут студентам выявить в изучаемых материалах главные содержательные моменты, целенаправленно изучать научную и учебно-методическую литературу, подготовиться к промежуточному и итоговому контролю. Формы проведения занятий – индивидуальные выступления студентов, групповое обсуждение с постановкой дополнительных вопросов.
При проведении занятий используются мультимедийные технологии, в частности презентации PowerPoint, с применением мультимедийного проектора, возможностью работы с электронной доской, компьютером, имеющим выход в Интернет. Выступление студента-докладчика по реферату должно сопровождаться презентацией (текстовой, табличной, графической и т.д.).
1.1 Перечень тем для подготовки к практическим (семинарским) занятиям
Модуль 1. Общие вопросы учения об антибиотиках
Занятие 1. Принципы классификации антибиотиков
Классификации антибиотиков различаются в зависимости от того, какие цели преследуют при этом исследователи различных профилей. Так, например, для биолога интерес представляет классификация по штаммам-продуцентам, для врача – по спектру действия на различных возбудителей и т. д. В зависимости от продуцирующих организмов антибиотики могут быть разделены на следующие группы:
1. Образуемые эубактериями.
2. Образуемые бактериями рода Streptomyces.
3. Образуемые несовершенными грибами.
4. Образуемые грибами классов базидио- и аскомицетов.
5. Образуемые лишайниками, водорослями, низшими растениями.
6. Образуемые высшими растениями.
7. Образующиеся в организмах животных.
По механизму биологического действия антибиотики могут быть классифицированы следующим образом:
1. Нарушающие синтез клеточной стенки бактерий.
2. Нарушающие функции мембран.
3. Подавляющие синтез нуклеиновых кислот.
4. Подавляющие синтез белков.
5. Ингибирующие процессы клеточного дыхания.
6. Антиметаболического действия.
7. С иммунокорректирующей активностью.
По спектру действия антибиотики делятся на такие группы:
1. Противобактериальные узкого спектра действия, активные в отношении грамположительных бактерий.
2. Противобактериальные широкого спектра действия.
3. Противотуберкулезные.
4. Противогрибковые.
5. Противоопухолевые.
6. Антипротозойные.
По химической структуре выделяют 11 групп (или семейств).
Занятие 2. Практическое применение антибиотиков
При слове «антибиотики» всегда на первое место выступало их использование в качестве лечебных препаратов при заболевании человека. Но не менее значимо применение антибиотиков в сельском хозяйстве, пищевой и консервной промышленности. При выборе антибиотика для борьбы с возбудителями заболевания и очагом его распространения, а также способа применения препарата основное внимание обращают не только на биологический эффект, но и на экономический и экологический аспекты. Одно из существенных требований к антибиотикам для сельского хозяйства – они не должны использоваться в медицинской практике.
Первые сведения об использовании антибиотиков в консервной промышленности относятся к 1943 году. Применение антибиотиков при консервировании позволяет значительно снизить время термической обработки того или иного продукта. Антибиотик, используемый в этом процессе, подавляя развития ряда бактерий не должен оказывать токсического действия на организм человека.
Модуль 2: Выделение и условия культивирования продуцентов антибиотических веществ
Занятие 3. Лабораторное культивирование микроорганизмов – продуцентов антибиотических веществ
Продуценты антибиотиков могут выделяться из самых разнообразных субстратов: почвы, гниющих растительных и животных остатков, илов, воды озер и рек, воздуха и других источников. Наиболее богата микроорганизмами, продуцирующими антибиотики, почва. Из нее большей частью и выделяют организмы — продуценты антибиотических веществ.
Прежде чем начинать поиски продуцентов антибиотических веществ, приступать к выделению микробов-антагонистов, образующих антибиотики, из естественных мест их обитания, исследователь должен иметь ясную цель.
При этом возможны три основные задачи: во-первых, поиски продуцентов уже известных, описанных в литературе и используемых на практике антибиотиков; во-вторых, поиски новых антибиотиков, способных проявлять биологическое действие по отношению к конкретным организмам; в-третьих, обнаружение продуцентов антибиотиков, подавляющих в клетке определенную мишень. В зависимости от поставленной цели должны быть использованы и соответствующие методы поисков организмов — продуцентов тех или иных антибиотических веществ.
На проявление антибиотических свойств микроорганизмов оказывают влияние многие факторы. Какие же факторы оказывают наиболее существенно влияние на образование антибиотиков микроорганизмами при культивировании их в лабораторных условиях. К числу наиболее существенных факторов, оказывающих влияние на проявление антибиотических свойств микроорганизмов, выделенных из природных источников, относятся состав среды, ее активная кислотность, окислительно-восстановительные условия, температура культивирования, методы совместного выращивания двух или большего числа видов микроорганизмов и т.д., иными словами, весь сложный комплекс условий культивирования микроорганизмов. Выяснение характера определенного физиолого-биохимического процесса, осуществляемого микроорганизмом, возможно
только при тщательном подборе соответствующих питательных сред.
Только при учете всех особенностей культивирования организма и при изучении влияния различных компонентов субстрата, физико-химических и физических факторов среды можно определить способность микроорганизма образовывать антибиотическое вещество. Создавая организму разнообразные условия культивирования, тем самым выясняют, какие из них наиболее благоприятны для выявления потенциальных возможностей биосинтеза антибиотиков.
Часто изучаемый антибиотик по тем или иным причинам не может быть использован в медицинской практике, тогда его следует испытать в сельскохозяйственном производстве или в отдельных отраслях пищевой и консервной промышленности. Только после всестороннего и глубокого изучения антибиотика можно говорить о перспективности или, наоборот, о непригодности его для практических целей.
Лабораторный регламент. Антибиотическое вещество, имеющее практическую значимость и являющееся новым препаратом, должно выпускаться в промышленных масштабах. Поэтому при изучении продуцента и образуемого им антибиотика в лабораторных условиях разрабатывается так называемый лабораторный регламент. Лабораторный регламент — это технологический документ, которым завершаются научные исследования в лабораторных условиях по разработке метода получения антибиотика. Он служит основой для промышленного регламента. Задача лабораторного регламента — разработка оптимального метода производства антибиотического вещества.
Занятие 4. Основные этапы промышленного получения антибиотиков
После установления лечебных свойств первого антибиотика – пенициллина – сразу же возникла задача организации его массового производства. В настоящее время можно говорить о том, что производство антибиотиков – хорошо развитая отрасль, которая занимает одно из центральных мест в производстве лекарственных препаратов. Огромный спрос на антибиотические препараты со стороны медицины, сельского хозяйства, пищевой промышленности способствовал усиленному поиску новых антибиотиков и получению их в промышленных масштабах.
Современное промышленное получение антибиотиков – это сложная многоступенчатая биотехнологическая система, состоящая из ряда последовательных стадий.
1. Стадия биосинтеза (образования) антибиотика, основной задачей которой является создание оптимальных условий для развития продуцента и максимально возможного биосинтеза антибиотика. Высокая результативность этой стадии зависит от уровня биосинтетической активности продуцента, времени его максимального накопления, стоимости сред для культивирования организма.
Для максимального выхода антибиотика при культивировании продуцента используют комплекс мер, включающий подбор наиболее благоприятных для этих целей питательных сред и режимов культивирования организма. Все это входит в понятие управляемый синтез.
2. Стадия предварительной обработки культуральной жидкости, клеток (мицелия) микроорганизма и фильтрации (отделения культуральной жидкости от биомассы продуцента), эффективность которой определяется составом среды для выращивания продуцента антибиотика, характером его роста, накоплением антибиотика в культуральной жидкости или внеклеточное.
3. Стадия выделения и очистки антибиотика, особенностью которой является достигаемое увеличение концентрации антибиотика (примерно от 1 до 20–30 %). В качестве основных методов используются экстракция, осаждение, сорбция на ионообменных материалах, выпаривание, сушка.
4. Стадия получения готовой продукции, изготовление лекарственных форм, расфасовка, основное требование к которой – высокое качество конечного продукта. Готовый антибиотик подвергается тщательному контролю: биологическому и фармакологическому. В первом случае ставится задача выяснения стерильности готового препарата, которая обеспечивается соблюдением стерильных условий работы на всех стадиях процесса развития продуцента, выделения и очистки препарата. При фармакологическом контроле предполагается исследование токсичности, пирогенности, аллергенности и других свойств препарата, определенных Государственной фармакопеей. Расфасованный и упакованный препарат с указанием биологической активности, даты выпуска и срока годности поступает в продажу. Выход антибиотиков обычно составляет несколько десятков граммов на 1 л.
Можно отметить, что помимо прямой ферментации, существует также способ получения полусинтетических производных антибиотиков. Такое производство было разработано с 1960 года, а первым полусинтетическим антибиотиком явился метициллин. Вообще говоря, на основе ферментативного гидролиза 6-аминопенициллановой (6-АПК) кислоты с помощью фермента пенициллинацилазы, который образуется многими видами микроорганизмов, получено около 40 тыс. полусинтетических производных. 6-АПК оказалась исключительно удобным объектом для введения радикалов вместо атома водорода в аминной группе.
В настоящее время в разных странах созданы биотехнологические производства с использованием иммобилизованной пенициллинамидазы для выделения 6-АПК из бензилпенициллина. Полученная 6-АПК затем используется для химического синтеза других пенициллинов. Например, при синтезе ампициллина гидролиз бензилпенициллина осуществляют при участии мутанта Kluivera citrophyla, после чего вносят клетки Pseudomonas melanogenium и эфир D, L-фенилглицина, условия процесса подобраны таким образом, что происходит образование ампициллина (D-аминобензилпенициллин).
Занятие 5. Пути повышения антибиотической продуктивности
Микроорганизмы — продуценты антибиотиков, выделенные из природных субстратов, обычно имеют низкую антибиотическую активность. Так, разные штаммы Penicillium, выделенные из почв, образуют пенициллин при глубинном их выращивании в количестве от 10 до 30 ед./мл культуральной жидкости. Продуцент стрептомицина S. griseus, впервые выделенный 3. Ваксманом с сотрудниками в 1944 г. из сильно унавоженной почвы, образовывал до 100 мкг/мл стрептомицина.
Понятно, что потребности медицины, сельского хозяйства и некоторых отраслей промышленности не могут быть удовлетворены без получения наиболее продуктивных штаммов организмов, образующих антибиотические вещества.
Поэтому перед наукой была поставлена задача разработать пути повышения биосинтеза практически ценных антибиотических веществ. При решении этой задачи необходимо применять три тесно связанных метода:
1) естественной изменчивости,
2) индуцированного мутагенеза и ступенчатого отбора наиболее активных форм продуцентов антибиотиков,
3) генно-инженерных манипуляций.
Для выделенных штаммов должны быть изучены условия культивирования полученных вариантов в целях определения наиболее оптимальной биосинтетической активности.
|
