Интраэпителиальные неоплазии и микроинвазивный рак шейки матки. Клинические и молекулярно-биологические особенности.

На правах рукописи Снигур Нина Владимировна ИНТРАЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ НЕОПЛАЗИИ И МИКРОИНВАЗИВНЫЙ РАК ШЕЙКИ МАТКИ. КЛИНИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ. 14.00.14- Онкология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва - 2009 Работа выполнена в Федеральном Государственном Учреждении «Центральная клиническая больница с поликлиникой» Управления делами Президента РФ (главный врач - доктор медицинских наук, профессор А.Т. Бронтвейн) Научные руководители: доктор медицинских наук Е.Б. Савинова кандидат медицинских наук О.А. Анурова Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор В.П. Козаченко доктор медицинских наук, профессор Е.А. Коган Ведущая организация: Федеральное Государственное Учреждение Российский Научный Центр Рентгенорадиологии Министерства Здравоохранения РФ Защита диссертации состоится « »_______ 2009 года в___часов на заседании диссертационного совета (Д.001.017.01) Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН. Автореферат разослан « »______________2009 года Ученый секретарь диссертационного совета РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, доктор медицинских наук, профессор Ю.В. Шишкин Общая характеристика работы Актуальность исследования. Рак шейки матки (РШМ) - актуальная проблема для гинекологов и онкологов всего мира. Ежегодно в мире выявляется около 500 тысяч новых случаев, более 270 тысяч женщин умирают от РШМ (Waggoner S.E., 2003). Три четверти всех случаев РШМ регистрируется в развивающихся странах. В России в последние десятилетия наблюдается рост заболеваемости РШМ, отмечается высокий показатель запущенности и увеличение числа больных молодого возраста (Морхов К.Ю., Кузнецов В.В., 2009). В 2006 году в России РШМ занял первое место в структуре онкологической заболеваемости среди женщин 15-39 лет и второе место среди женщин 40-54 лет, уступив лишь раку молочной железы (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2008). В структуре смертности женщин от онкологических заболеваний в России в 2006г. РШМ находился на втором месте в возрастных группах 25-49 лет. В экономически развитых странах в результате активного внедрения скрининга предрака и рака шейки матки отмечено снижение смертности от РШМ (Lowy D.R. et.al., 2008). Доказательство роли ВПЧ высокого риска в этиологии РШМ (Zur Hausen H., 1989, 2002) привело к пониманию механизмов канцерогененеза шейки матки и существенно повысило возможности профилактики РШМ. В то же время известно, что инфекция ВПЧ далеко не всегда приводит к развитию рака. Несмотря на широкое распространение ВПЧ в популяции, лишь у части женщин в результате постоянной персистенции вируса возникают предраковые поражения шейки матки – цервикальные интраэпителиальные неоплазии (CIN), которые поэтапно, в течение длительного времени могут прогрессировать в рак. В то же время, нередко имеет место и регрессия CIN. Очевидно, наличия вирусной инфекции недостаточно для возникновения рака и необходимы определенные клеточные факторы, способствующие развитию заболевания. В процессе опухолевой трансформации большое значение имеют состояние иммунной системы, генетические особенности взаимодействия вируса и клетки, вызывающие нестабильность генома, и другие факторы. Крайне важным для разработки оптимальной тактики лечения больных является поиск и выявление возможных маркеров прогрессии CIN и РШМ. В связи с развитием молекулярно-генетических и иммуногистохимических методов анализа в последние годы эти методы используются для поиска и изучения возможных маркеров прогрессии предрака и РШМ. В настоящей работе представлялось актуальным провести анализ ВПЧ и генетических нарушений из всех доступных фокусов CIN и РШМ каждой пациентки. Поскольку в клинической практике наиболее доступны иммуногистохистохимические исследования, представлялось важным провести сравнительное изучение экспрессии в СIN и РШМ ранних стадий известных маркеров пролиферации, апоптоза и клеточной адгезии. Цель исследования: изучение клинических, морфологических и молекулярных особенностей цервикальных интраэпителиальных неоплазий и микроинвазивного рака шейки матки для выявления возможных маркеров прогрессирования предраковой патологии шейки матки. Задачи исследования: 1. Изучить клинические особенности цервикальных интраэпителиальных неоплазий и микроинвазивного РШМ. 2. Определить частоту ВПЧ 16 и 18 типов в цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и РШМ. 3. Изучить генетические нарушения в ДНК из фокусов цервикальных интраэпителиальных неоплазий и РШМ путем анализа частоты потери гетерозиготности на хромосоме 6. 4. Изучить особенности экспрессии и оценить возможное прогностическое значение иммуногистохимических маркеров Ki-67, сурвивина и Е-кадхерина в цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и РШМ. Научная новизна исследования Выполнено комплексное клиническое и молекулярное изучение CIN и РШМ. Проведена микродиссекция парафиновых срезов цервикальных биопсий и генотипирование ВПЧ 16 и 18 типов в отдельных фокусах CIN и РШМ. Поликлональные поражения шейки матки, обусловленные различными типами ВПЧ, выявлены в CIN II и CIN III в 4 и 16% соответственно, а в РШМ - в 2,6% наблюдений. Наряду с превалированием ВПЧ 16 типа отмечено значительное присутствие ВПЧ 18 типа как в CIN, так и в РШМ. Показано, что частота вирус-индуцированных генетических нарушений на хромосоме 6 в районе генов HLA в локусах D6S276, TNFa и D6S291 увеличивается при прогрессировании CIN в рак. Впервые изучены особенности экспрессии иммуногистохимических маркеров сурвивина (ингибитор апоптоза) и Е-кадхерина (компонент клеточного комплекса адгезии) одновременно с маркером Ki-67 (маркер пролиферативной активности) в CIN и РШМ. Определены критерии оценки экспрессии указанных маркеров и возможность использования этих маркеров в качестве факторов прогноза течения CIN. Практическая значимость исследования. Иммуногистохимическое определение прогностически неблагоприятных вариантов экспрессии маркеров Ki-67, сурвивина и Е-кадхерина, а также выявление генетических нарушений в локусах D6S276, TNFa и D6S291 на хромосоме 6 позволяет выделить группу больных CIN с высоким риском прогрессирования, что крайне важно при выборе тактики лечения пациенток с CIN. Оптимизация лечения этой группы больных позволит снизить заболеваемость РШМ. Апробация диссертации. Основные положения работы доложены и обсуждены на совместном заседании отделений акушерско-гинекологического профиля, онкологического профиля, хирургических отделений ФГУ «Центральная клиническая больница с поликлиникой» УД Президента РФ и кафедры хирургии факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В.Ломоносова 15 июня 2009г. Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы и списка работ, опубликованных по теме диссертации. Работа содержит 39 таблиц, 26 рисунков. Список литературы включает 198 источников, из них 39 отечественных и 159 зарубежных. Содержание диссертации Материалы и методы исследования. Работа включает ретро- и проспективный анализ историй болезни 255 больных, получавших лечение в отделении гинекологии ФГУ ЦКБ УДП РФ в период с 1998г. по 2005г. включительно, среди них 124 больные с CIN и 131 пациентка с РШМ. Все случаи CIN представлены плоскоклеточными интраэпителиальными неоплазиями. Преобладали пациентки с CIN II-CIN III (91/124, 66,9%). Преинвазивной карциномой страдали 10/33 (30,3%) больных CIN III (рис.1). Возраст больных CIN колебался от 18 до 79 лет, средний возраст больных CIN составил 45,2 года. Плоскоклеточный РШМ выявлен в 87,8% наблюдений РШМ, чаще встречались случаи плоскоклеточного ороговевающего рака (61,1%). Железистое строение опухоли выявлено у 12,2% больных РШМ (рис.2). Преобладали наблюдения РШМ I стадии (101/131, 77%), при этом РШМ IA стадии обнаружен у 82 больных (62,6% больных РШМ). Чаще всего был диагностирован РШМ IA1 стадии (60/131, 45% больных РШМ). Запущенные случаи болезни выявлены у 16 больных: РШМ III стадии в 7,6% наблюдений, РШМ IV стадии в 4,6% случаев (табл. 1). Средний возраст больных РШМ составил 48,6 года. В группу больных РШМ IA1 стадии включены 2 больные с раком культи шейки матки после ранее выполненной надвлагалищной ампутации матки. Частота рака культи шейки матки составила 1,5%. Рис.1. Состав больных CIN. Рис.2. Состав больных РШМ в зависимости от гистологического строения опухоли Таблица 1. Состав больных РШМ в зависимости от стадии и гистологического строения Стадия РШМ Плоско- клеточный РШМ Адено-карцинома шейки матки Железисто-плоскоклеточ-ный РШМ Все наблюдения РШМ n=115 % n=14 % n=2 % n=131 % IА1 52 45,2% 7 50% 1 50% 60 45,8% IА2 22 19,1% - - - - 22 16,8% IВ 15 13,0% 3 21,4 % 1 50% 19 14,5% II 11 9,6% 3 21,4% - - 14 10,7% III 10 8,7% - - - - 10 7,6% IV 5 4,3% 1 7,1% - - 6 4,6% Клиническое обследование заключалось в изучении анамнестических и объективных данных, включающих характер менструальной функции, характер репродуктивной функции, сопутствующие заболевания. Проводилась оценка предшествующих методов лечения патологии шейки матки. Кольпоскопическое исследование проведено по стандартной методике с использованием кольпоскопа фирмы K. Storz. Цитологическое исследование и морфологическое исследование проведено коллективом сотрудников патологоанатомического корпуса и отделения клинической цитологии ФГУ «ЦКБП» УД Президента РФ. Гистологическое исследование трактовалось согласно критериям ВОЗ и FIGO. Иммуногистохимическое исследование экспрессии маркеров Ki-67 (DAKO, 1:100), сурвивина (DBS, 1:20) и Е-кадхерина (DAKO, 1:100) проведено по методике LSAB в отделении патологической анатомии РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН под руководством ведущего научного сотрудника О.А. Ануровой. Исследованы биопсийные препараты 71 больной: 44 препарата CIN и 27 препаратов РШМ. Интенсивность экспрессии Ki-67 (маркер пролиферативной активности) оценивали в зависимости от доли клеток с мечеными ядрами к общему числу клеток эпителия и от распространения клеток с мечеными ядрами по слоям эпителиального пласта. Выделены три варианта экспрессии - выраженная, умеренная, слабая (см. табл.2). Таблица 2. Оценка экспрессии маркера Ki-67 Расположение Ki-67- позитивных клеток Степень окрашивания Базальная треть эпителия Базальная и средняя треть эпителия Все слои эпителия Окрашено менее 30% клеток Слабая экспрессия Слабая экспрессия Умеренная экспрессия Окрашено 30-70% клеток Слабая экспрессия Умеренная экспрессия Выраженная экспрессия Окрашено более 70% клеток Умеренная экспрессия Выраженная экспрессия Выраженная экспрессия Белок сурвивин – член семейства ингибиторов апоптоза. Интенсивность экспрессии сурвивина оценивали в зависимости от доли клеток с окрашенными ядрами к общему числу клеток эпителия. Выделены 4 варианта экспрессии сурвивина: выраженная (окрашены ядра более 70% клеток), умеренная (окрашены ядра 30-70% клеток), слабая (окрашены ядра менее 30% клеток), отсутствие экспрессии (не определяются клетки с мечеными ядрами). Е-кадхерин – поверхностный мембранный гликопротеид, опосредующий взаимодействие между мембранами клеток эпителия. Интенсивность экспрессии Е-кадхерина оценивали в зависимости от доли клеток с мембранной экспрессией Е-кадхерина к общему числу клеток эпителия. Выделены следующие варианты экспрессии: выраженная (мембранное окрашивание более 70% клеток), умеренная (мембранное окрашивание 50-70% клеток), слабая (мембранное окрашивание 25-50% клеток), очень слабая экспрессия (мембранное окрашивание менее 25% клеток), отсутствие иммунореактивности - клетки с мембранным окрашиванием не определяются. Молекулярно-генетические исследования выполнены в лаборатории онкогеномики РОНЦ им Н.Н. Блохина РАМН. В исследование включены 123 пациентки, из них 45 больных CIN и 78 больных РШМ. Препараты ДНК получали с помощью буфера с протеиназой К (Sigma, 500мкг/мл) из клеток РШМ, всех фокусов CIN (включая CIN, сопутствующие РШМ) и нормального эпителия или стромы, собранных при микродиссекции срезов парафиновых блоков цервикальных биопсий. В качестве образца использовали 5мкм серийный срез, окрашенный гематоксилином-эозином, с обозначенными патологом фокусами CIN, рака и нормального эпителия или стромы. Определение типа ВПЧ в препаратах ДНК проводили в ПЦР с праймерами к гену Е6 ВПЧ 16 и 18 типов, продукты ПЦР тестировали в электрофорезе в 2% агарозном геле, в качестве положительного контроля использовали ДНК из клеточных линий Caski (ВПЧ тип 16) и HeLa (ВПЧ тип 18). Определение потери гетерозиготности в ДНК из фокусов CIN и РШМ проводили в ПЦР с праймерами к микросателлитным маркерам D6S344, D6S276, D6S273, D6S291, TNFa и ESR на хромосоме 6, как описано (Мазуренко Н.Н. и др. 2006).

Похожие:

	Как предупредить рак шейки матки Но чаще всего про гинеколога вспоминают тогда, когда женщина забеременела, или когда появились резкие боли, выделения и другие болезненные...		Клинические рекомендации колоректальный рак в работе врача общей практики 2014 Колоректальный рак — злокачественная опухоль из элементов эпителия толстой кишки
	Особенности течения беременности и родоразрешения женщин, перенесших заболевания шейки матки Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования “Московская медицинская академия...		Методические рекомендации для студентов к практическим занятиям по... Эндометриоз. Предопухолевые заболевания и опухоли шейки и тела матки. Болезни яичников, маточных труб и молочных желез. Эндометриоз...
	Обоснование лапароскопической подвздошной и парааортальной лимфаденэктомии,... Обоснование лапароскопической подвздошной и парааортальной лимфаденэктомии, транспозиции яичников у больных раком шейки матки ib...		Вопросы для сертификационного экзамена по акушерству и гинекологии Предраковые заболевания шейки матки. Клиника. Диагностика. Лечение. Диспансеризация больных
	Список Сц акушерство и гинекология 2012, ту кольпоскопия и патология шейки матки 2013, ту лазерные технологии в акушерстве 2013		Генитальные микоплазмы в структуре бактериальных инфекций влагалища... Работа выполнена в гоу впо первый Московский Государственный Медицинский Университет им. И. М. Сеченова
	Заболевания шейки матки при беременности (современные аспекты диагностики и тактика ведения) ...		Отчет о научно-исследовательской работе «Разработка методов оценки... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
	Отчет о научно-исследовательской работе «Разработка методов оценки... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования		Эпигенетические изменения в опухолях шейки матки: гипер- и гипометилирование... ...
	Т. Г. Заболотская лабораторная диагностика Молекулярно-биологические методы: выявление и идентификация вирусных нуклеиновых кислот		Риск развития миомы матки снижается при увеличении числа родов и... Сведения о миоме матки встречается в древних источниках, даже при исследовании останков египетских мумий были выявлены случаи кальцифицированных...
	Беременность и заболевания шейки матки: частота, осложнения гестации,... Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Орловский государственный...		Вопросы к экзамену физика и научный метод познания Молекулярно – кинетическая теория. Основные положения молекулярно – кинетической теории. Основная задача молекулярно-кинетической...