Структурно-функциональная организация хромосом описторхид 03. 03. 04 Клеточная биология, цитология, гистология

Приготовление цитологических препаратов хромосом, дифференциальное окрашивание хромосом и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). Хромосомные препараты готовили из задней части тела мариты, содержащей органы репродуктивной системы (яичник, семенники, семяприемник). С-бэндинг и AgNOR-окрашивание проводили по стандартным протоколам с небольшими модификациями (Sumner, 1972; Howell and Black, 1980). FISH проводили по стандартному протоколу (Rubtsov et al., 2000). Для изучения локализации рДНК использовали фрагмент 18S рДНК человека, клонированный в плазмиде pHr13 (Malygin, 1992), и 5,8 S рДНК описторхид, полученную в ПЦР с праймерами ITS1_F (5'-GTCGTAACAAGGTTTCCGTA-3') и ITS2_R (5'-GGAACGACCTGAACACCA-3'). Выявление локализации теломерных повторов проводили с помощью теломерной ДНК-пробы и теломерной PNA-пробы. Теломерная ДНК-проба была синтезирована в безматричной ПЦР по стандартному протоколу (Ijdo et al., 1990). Метод FISH был проведен по стандартному протоколу без супрессии повторенных последовательностей (Pinkel et al., 1988). Получение микродиссекционных ДНК-проб. Диссекцию хромосом и последующую амплификацию диссектированного материала проводили по стандартному протоколу (Rubtsov et al., 2000). Мечение полученных продуктов ПЦР проводили AlexaFluor488, биотином или дигоксигенином в дополнительных циклах ПЦР. Микроскопический анализ. Микроскопический анализ препаратов марит проводился в Межинститутском центре коллективного пользования микроскопического анализа биологических объектов (ИЦИГ СО РАН, Новосибирск). Изображения живых марит были получены с помощью стереомикроскопа Stemi 2000 (Zeiss, Germany), программное обеспечение AxioVision (Zeiss, Germany). Широкопольная световая микроскопия проводилась на микроскопе AxioScop 2 Plus (Zeiss, Germany) с CCD-камерой AxioCam HRc (Zeiss, Germany), программным обеспечением AxioVision (Zeiss, Germany). ЛМСО была выполнена на микроскопе AxioImager Z1 (Zeiss, Germany), оснащенном модулем ApoTome (Zeiss, Germany), программное обеспечение AxioVision (Zeiss, Germany). ЛСМ проводилась на конфокальном микроскопе LSM 510 META (Zeiss, Germany), программное обеспечение LSM (Carl Zeiss). При проведении ЛСМ использовали режим multitrack (последовательное сканирование при раздельном возбуждении флуорохромов лазерами с разной длиной волны). Флуоресценция DAPI регистрировалась в диапазоне эмиссии 420-480 нм при возбуждении лазером 405 нм, собственная флуоресценция материала мариты регистрировалась в диапазоне от 505 нм и выше при возбуждении 488 нм. Микроскопический анализ препаратов хромосом проводили на микроскопе AxioPlan 2 Imaging microscope (Zeiss, Germany) с набором фильтров 49 (Zeiss, Germany), SP101 FITC (CHROMA, USA) and SP103v1 Cy3.5v1 (CHROMA, USA), CCD-камерой (CV M300, JAI Corporation, Japan), программное обеспечение ISIS4 (METASystems GmbH). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Комплексный микроскопический анализ. В результате проведения трехмерной конфокальной микроскопии и ЛМСО выполнено описание общей морфологии мариты описторха (Рисунок 1 а, б). Широкопольная микроскопия физических срезов описторха, окрашенных с помощью различных гистологических и гистохимических методов, позволила дать более детальное описание клеточного состава различных органов и тканей мариты описторха (Рисунок 1 в). Рисунок 1. ЛСМ O. felineus. a – марита описторха (сборка изображений оптических срезов). Длины волн возбуждения флуоресценции – 405 и 488 нм. Запирающие эмиссионные фильтры: BP 420-480IR (DAPI, синий псевдоцвет), LP 505 (автофлуоресценция, зеленый псевдоцвет). Объективы 20x/0.5. Scale bar 1 mm. б – ЛМСО O. felineus (трехмерная реконструкция метратерма описторха). Яйца описторха (автофлуоресценция, красный псевдоцвет), зрелые сперматозоиды (DAPI, синий псевдоцвет). Объектив 63x/1.25. в – световая широкопольная микроскопия O. felineus. Срез семенного пузырька и матки описторха. Окрашивание гематоксилин-эозином. Scale bar 20 mkm. Основная часть мариты содержит матку с большим количеством яиц, которые, несмотря на наличие активно делящихся клеток, не пригодны в качестве источника хромосомного материала из-за твердой и плотной оболочки. Остальные ткани мариты (паренхима, кожно-мускульный мешок и др.) характеризовались крайне низким митотическим индексом. В проведенном исследовании клетки на стадии метафазы в составе этих тканей не были обнаружены. Более того, указанные ткани плохо подвергались мацерации, что не позволяло получать суспензию отдельных клеток. Единственным источником легкодоступных делящихся клеток оказались семенники, яичник и семяприемник мариты описторха. В дальнейших исследованиях они были использованы для приготовления хромосомных препаратов, содержащих хромосомы клеток, находящихся на разных стадиях митоза и мейоза. Кариотипы описторхид, исследованные в настоящей работе. Анализ хромосом описторхид в настоящей работе был выполнен на препаратах митотических и мейотических хромосом, полученных из семенников, яичника и семяприемника половозрелых марит. Диплоидное число хромосом у трематод варьирует от 12 до 28, причем преобладают виды с 2n=22 (около 20%) и 2n=18 (18%) (Баршене, 1993). Кариотипы, состоящие из от 24 до 28 хромосом, встречаются гораздо реже (около 4 % исследованных видов). У описторхид, вовлеченных в настоящее исследование, ранее были определены следующие хромосомные числа: O. felineus, M. xanthosomus - 2n=14; O. viverrini - 2n=12; C.sinensis - 2n=56; данные о числе хромосом у M. bilis отсутствовали. В результате кариотипирования показано, что число хромосом (2n) у исследованных образцов, O. felineus, M. xanthosomus, C. sinensis и M. bilis равно 14, у O. viverrini - 12 (Рисунок 2). Следует отметить, что число хромосом у C. sinensis из РФ, определенное в настоящей работе как 2n=14, отличается от числа хромосом 2n=56 у C. sinensis из Кореи и Китая (Park et al., 2000). Рисунок 2. Кариотипы представителей описторхид, исследованных в настоящей работе. Приведены инвертированные изображения хромосом, окрашенных DAPI. а – O. felineus; б – O. viverrini; в – M. xanthosomus; г – M. bilis; д – C. sinensis. Scale bar 10 mkm. Возможно, представители C. sinensis из Китая и Кореи являются октаплоидной формой (8n=56). С этим согласуются данные морфометрии хромосом C. sinensis из разных географических ареалов (Китая, Кореи и РФ). Показано, что кариотип C. sinensis из стран Азии образован 8-ю парами крупных хромосом и 20-ю парами мелких хромосом. Кариотип C. sinensis из РФ представлен двумя парами крупных и пятью парами мелких хромосом. Ранее полиплоидия уже была выявлена у некоторых видов трематод (P. westermani, F. hepatica), однако максимальная плоидность у описанных на сегодняшний день трематод не превышает 4n. Нельзя исключить, что представленные данные о числе хромосом C. sinensis из Китая и Кореи являются следствием методической ошибки, связанной с особенностью приготовления хромосомных препаратов: восемь гаплоидных клеток семенника, представляющих единую группу, содержит 56 хромосом, способных формировать на цитологическом препарате общую пластинку, имитируя мейотические хромосомы одной клетки. Мы часто наблюдали такие общие пластинки у C. sinensis из РФ (Zadesenets et al., 2012). Возможно, представители C. sinensis из юго-восточной Азии и с Дальнего Востока РФ являются разными видами. Решение этого вопроса требует дополнительных исследований. Сравнительный анализ хромосомных чисел у трематод показал тенденцию к уменьшению количества хромосом в ходе эволюции их кариотипа (Short et al., 1989; Баршене, 1993). В некоторых работах в качестве предкового кариотипа трематод предлагается кариотип с 19-ю парами акроцентрических хромосом. Предполагается, что эволюция предковой формы кариотипа трематод шла по пути робертсоновских слияний (Short et al., 1989). Как показали результаты сравнения хромосомных наборов описторхид, уже описанные в литературе и полученные в ходе настоящего исследования, они имеют схожую морфологию хромосом, кариотипы у них - асимметричные. Согласно терминологии асимметричным кариотипом называют кариотип, хромосомы которого резко отличаются по своему размеру (Баршене, 1993; Spakulova et al., 2011). Проведение сравнительного морфометрического анализа хромосом описторхид показало некоторые расхождения между результатами, полученными в настоящей работе и приведенными другими исследователями. Данные различия обусловлены разной степенью конденсации и распластывания хромосомного материала, которые возникают при использовании разных источников делящихся клеток, разных способов фиксации материала и приготовления препаратов. В разных исследованиях использовали партениты или мариты трематод. В данной работе источником хромосомного материала служили мариты. При сравнении данных морфометрии хромосом описторхид, полученных в ходе настоящего исследования, были выявлены лишь небольшие недостоверные различия в относительных размерах как крупных, так и мелких хромосом (Таблица 2). Таблица 2. Результаты морфометрического анализа хромосом описторхид N O. felineus O. viverrini M. xanthosomus M. bilis C. sinensis RL,% M RL, % M RL, % M RL, % M RL, % M 1 29.97± 1.31 m 31.04±1.17 m 30.13± 1.15 sm 32.61± 1.06 m/sm 31.18± 0.70 m 2 23.41± 1.28 m 23.19±0.81 m 22.83± 0.76 m 24.45± 0.85 m 25.02± 0.90 m 3 11.35± 0.39 sm 16.04±0.63 m 11.01± 0.89 sm 10.30± 0.82 sm 9.76± 0.36 m 4 10.23± 0.67 sm 11.12±0.64 m 10.22± 0.65 sm 9.19± 0.66 sm 9.31± 0.41 sm/m 5 9.15± 0.62 m 10.07±0.63 m 9.54± 0.67 sm/m 8.43± 0.62 sm 8.85± 0.26 sm/m 6 8.35± 0.59 sm 8.54± 0.56 sm 8.53± 0.62 m 7.78± 0.65 sm/a 8.34± 0.36 m 7 7.54± 0.76 sm - - 7.74± 0.59 m 7.24± 0.43 sm 7.54± 0.42 sm/a RL (relative length) – относительная длина хромосом; М – морфотип хромосом. Исключением является значимое отличие относительной длины хромосомы 3 у O. viverrini: данная хромосома является метацентриком среднего размера, возникшим в результате слияния двух хромосом предкового кариотипа. Результаты сравнительной морфометрии хромосом указывают на высокий консерватизм кариотипов описторхид. Дифференциальное окрашивание хромосом описторхид. Дифференциальное окрашивание хромосом широко используется при анализе структурно-функциональной организации хромосом (Dutrillaux, 1979; Sumner, 1994). Однако, выполненные на сегодняшний день работы по проведению дифференциального окрашивания хромосом трематод единичны. Проведенные в ходе настоящей работы исследования дали следующие результаты: 1). Для хромосом описторхид характерно наличие С-блоков небольшого размера, в прицентромерных районах и прителомерных районах. У некоторых видов были выявлены также интерстициальные - в плечах хромосом (O. felineus, M. xanthosomus, M. bilis) (Рисунок 3). Для мелких хромосом описторхид дифференцировать прителомерные и интерстициальные С-блоки не представлялось возможным ввиду слишком малых размеров хромосом. Рисунок 3. Локализация блоков конститутивного гетерохроматина (С-блоков) в хромосомах описторхид. OFE – O. felineus; OVI – O. viverrini; MXA – M. xanthosomus; MBI – M. bilis; CSI – C. sinensis. 2). Окрашивание азотнокислым серебром (AgNOR-окрашивание) позволило выявить единственный активный ЯО район на одной из мелких хромосом описторхид. Более того, специфичное окрашивание было обнаружено в мейотических хромосомах на стадии профазы (пахитены включительно), в ранних сперматидах и интерфазных ядрах. В метафазных хромосомах мейоза I и II специфичные сигналы не были обнаружены. Ag-позитивные сигналы выявлялись в ранних сперматидах, по всей видимости, после реактивации ЯО районов. Аналогичные результаты уже были ранее получены при AgNOR-окрашивании хромосом на различных стадиях сперматогенеза беспозвоночных и позвоночных, включая человека (Schmid et al., 1982, 1983; de Campos et al., 2005). Известно, что AgNOR-окрашивание может выявлять не только транскрипционно активные ЯО районы, но и кислые белки в других районах, таким образом, не всегда давая верное представление о локализации ЯО района (Dobigny et al., 2002). В таких случаях используют метод гибридизации in situ с ДНК-пробами, специфичными рДНК.

Похожие:

	Методическая разработка к практическому занятию для студентов 1 курса... ...		Методическая разработка к практическому занятию для студентов 1 курса... ...
	Программа вступительного экзамена «Клеточная биология, цитология, гистология» Экзамен проходит по традиционной форме, в соответствии с содержанием курса гистологии и клеточной биологии		Программа вступительного экзамена по специальности «Клеточная биология, цитология, гистология» Программа вступительных испытаний при приеме на обучение по программам подготовки научно-педагогических кадров в аспирантуре сформирована...
	Система цитокинов и их рецепторов при хронических вирусных инфекциях:... Форма обучения: очная, заочная (сокращенная), очно-заочная (вечерняя), очно-заочная (вечерняя) сокращенная		Учебной дисциплины «гистология, эмбриология, цитология» Специальность... Дисциплина «Гистология, эмбриология, цитология», относится к циклу математических, естественнонаучных дисциплин. Основные знания,...
	Рабочая программа учебной дисциплины Гистология, эмбриология, цитология-гистология... Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования		Рабочая программа учебной дисциплины единство и разнообразие клеточных... Изучение данной дисциплины базируется на знании дисциплин профессионального блока «Ботаника», «Методы биологического эксперимента»,...
	Рабочая программа дисциплины опубликована на сайте ТюмГУ: Цитология... «Биология», профили ботаника, зоология, физиология, генетика, биоэкология; форма обучения – очная		Учебно-методический комплекс дисциплины сд. Дс. Ф. 4 Гистология сд... ...
	Рабочая программа составлена в соответствии с требованиями фгос во... Изучение данной дисциплины базируется на знании дисциплин профессионального блока «Ботаника», «Методы биологического эксперимента»,...		Гистология, эмбриология, цитология гистология полости рта Дать знания по цитологии, эмбриологии, общей и частной гистологии и умения их практического использования, необходимые для успешного...
	Урок-зачет по теме "Учение о клетке" в 10-м классе За 2 недели до зачёта 3 (6) ученика получают задание составить вопросы разного уровня сложности по разделам «Химическая организация...		Рабочая учебная программа дисциплины «Гистология, эмбриология, цитология,... Рабочая учебная программа разработана в соответствии с фгос впо по направлению подготовки (специальности) 060201. 65 Стоматология,...
	№1. Цитология занятие №2. Строение клетки: клеточная оболочка. Цитоплазма Предмет и задачи цитологии, ее значение в системе биологических и медицинских наук		Рабочая программа составлена в соответствии с требованиями фгос во... Изучение данной дисциплины базируется на знании дисциплин профессионального блока «Методы биологического эксперимента», «Цитология...