Структурно-функциональная организация хромосом описторхид 03. 03. 04 Клеточная биология, цитология, гистология

Флуоресцентная гибридизация in situ с хромосомами описторхид Локализация рДНК. У высших эукариот гены рРНК организованы в два мультигенных семейства, состоящих из тандемно повторяющихся единиц. Основной класс рРНК (45S) содержит гены 18S, 5,8S и 28S рРНК, которые участвуют в формировании ядрышка. В настоящей работе для определения локализации кластера рибосомных генов использовали ДНК-пробы: 18 S и 5,8S рДНК. При использовании 18S рДНК-пробы человека было показано наличие кластера рДНК в хромосоме 3 для всех исследованных видов. Однако зона выявляемого на хромосомах сигнала, занимала очень большой по размеру район хромосомы, что затрудняло интерпретацию полученных результатов и субхромосомную локализацию кластера рДНК (Рисунок 5 а). Использование 5,8S рДНК-пробы позволило уточнить район локализации кластера рибосомных генов в хромосомах описторхид. На конденсированных хромосомах сигнал рДНК был локализован в нехарактерном для кластеров повторов рДНК АТ-богатом (согласно окраске DAPI) районе хромосомы 3 (Рисунок 5 б). Однако при проведении FISH с менее конденсированными пахитенными хромосомами было обнаружено, что этот АТ-богатый район «распадается» на два АТ-богатых района и расположенный между ними GC-богатый район. Кластер рДНК также распадается на два: один локализован в GC-богатом районе, расположенном между АТ-богатыми районами, другой – в прилегающей к АТ-богатому району части соседнего GC-богатого района (Рисунок 5 в, г). Локализация теломерной ДНК. В хромосомах многих позвоночных «теломерная ДНК» помимо концов хромосом, может быть локализована в виде кластеров в интерстициальных районах хромосом (ITSs, interstitial telomere sequences) (Meyne et al., 1989). К возникновению ITSs могут приводить либо перестройки хромосом, либо репарация или негомологичная рекомбинация ДНК с участием теломеразы. Крупные кластеры теломерной ДНК, выявляемые как ITSs, могут служить своеобразным маркером произошедшего робертсоновского слияния хромосом в ходе эволюции кариотипа (Slijepcevic, 1998). Поэтому предполагалось наличие ITSs, по крайней мере, в хромосоме 3 O. viverrini (2n=12), возникшей, в результате робертсоновского слияния мелких хромосом предковой формы описторхид. В ходе настоящего исследования в качестве проб использовали меченую теломерную ДНК и PNA-пробу. Было показано, что теломеры описторхид, так же как и теломеры у позвоночных, образованы мотивом TTAGGG и теломерная ДНК локализована на концах плеч всех хромосом (Рисунок 5 д). Большее увеличение разрешения метода FISH достигнуто при использовании в качестве ДНК-мишени пахитенных хромосом. Однако даже на пахитенных хромосомах интерстициальных сайтов хромосом теломерной ДНК обнаружено не было (Рисунок 5 е, ж). Отсутствие ITSs в хромосоме 3 виверровой двуустки можно интерпретировать следующим образом: или слияние хромосом произошло достаточно давно, и произошла элиминация возникшего в результате слияния ITSs, или размеры ITSs столь малы, что не могут быть выявлены с помощью FISH на мейотических хромосомах. Также возможно, слияние предковых хромосом произошло в результате разрывов, приведших к элиминации теломерных районов обеих исходных хромосом. Рисунок 4. Результаты FISH различных ДНК-проб с хромосомами описторхид: 18S рДНК-проба на хромосомах M. xanthosomus (а); 5,8 S рДНК-проба на хромосомах O. viverrini (б), O. felineus (в), M. xanthosomus (г); теломерная ДНК-проба на хромосомах M. bilis (д); теломерная PNA-проба на хромосомах C. sinensis (е) и O. viverrini (ж); Op1-ДНК-проба (зеленый псевдоцвет) и Op2-ДНК-проба (красный псевдоцвет) на хромосомах O. felineus (з); Met1-ДНК-проба (красный псевдоцвет) и Met2-ДНК-проба (зеленый псевдоцвет) на хромосомах M. xanthosomus (и); Op1-ДНК-проба (зеленый псевдоцвет) и Op2-ДНК-проба (красный псевдоцвет) на хромосомах M. xanthosomus (к); Met1-ДНК-проба (зеленый псевдоцвет) на хромосомах M. xanthosomus до (л) и после проведения Prep-ISH (м). Стрелками указаны хромосомоспецифичные кластеры повторенных последовательностей. Сравнительный анализ хромосом. Сравнение данных, полученных после проведения С-дифференциального и AgNOR-окрашивания, анализа распределения повторенных последовательностей, указывают на консервативность кариотипа описторхид. К сожалению, попытки использования GTG-дифференциального окрашивания хромосом описторхид, показавшие свою высокую эффективность в сравнительной цитогенетике млекопитающих (Richard et al., 2003), не увенчались успехом. Возможно, одной из причин была высокая степень конденсации хромосомного материала. Ввиду слабой изученности хромосомной организации трематод, идиограмм ранее не было построено ни для одного вида, лишь в работе Hirai (2004) присутствует схематичное изображение хромосом с учетом локализации ЯО районов и С-позитивных блоков для одного вида S. mansoni (Hirai H. and Hirai Y., 2004). Рисунок 5. Пахитенные хромосомы описторхид и схематичные изображения их хромомерной организации. Изображения мелких хромосом (3-7) увеличены. а – O. felineus, б – M. bilis, в – M. xanthosomus, г – O. viverrini (инвертированные изображения хромосом, окрашенных DAPI). Решением данной проблемы стало получение и анализ препаратов пахитенных хромосом. В ходе работы были подобраны условия для фиксации и приготовления хромосомного материала, позволившие получать препараты, содержащие значительное количество пахитенных хромосом с отчетливой хромомерной организацией. Окрашивание пахитенных хромосом описторхид красителем DAPI сделало возможным проведение идентификации и сравнительного анализа индивидуальных хромосом описторхид. Таким образом, удалось построить схемы всех малых пахитенных хромосом изучаемых видов, но, к сожалению, не удалось провести полную идентификацию всех районов крупных пахитенных хромосом 1 и 2 из-за варьирования уровня конденсации их материала и многочисленных налеганий хромосом друг на друга. В зависимости от продолжительности гипотонической обработки и условий распластывания на предметном стекле уровень конденсации пахитенных хромосом существенно варьировал: в крупных хромосомах описторхид насчитывалось от 80 до 220 хромомеров. Предварительный сравнительный межвидовой анализ мелких хромосом описторхид позволил выявить наличие внутрихромосомных перестроек, вероятно перицентрических инверсий. При межвидовом сравнении пахитенных хромосом удалось идентифицировать хромосомы, слияние которых привело к возникновению хромосомы 3 в кариотипе виверровой двуустки. При сравнении хромомерной организации мелких хромосом было показано, что данная метацентрическая хромосома возникла в результате слияния хромосом 3 и 7 возможного предкового кариотипа описторхид. Для проведения хромосомного пэйнтинга, который успешно зарекомендовал себя в сравнительной цитогенетике млекопитающих, были созданы микродиссекционные ДНК-пробы (WCPs, Whole Chromosome Paints) из материала крупных хромосом 1 и 2 для двух видов, - O. felineus (Op1 и Op2, соответственно) и M. xanthosomus (Met1 и Met2, соответственно). Одним из условий успешного проведения хромосомного пэйнтинга является наличие супрессии повторенных последовательностей с помощью Cot1 или Cot2 ДНК. Однако при работе с хромосомами описторхид получение фракции высокоповторенной ДНК оказалось проблематичным ввиду отсутствия достаточного количества исходного материала (марит). Гибридизация in situ ДНК-проб, полученных из индивидуальных хромосом, без супрессии повторов специфически окрашивала исходные хромосомы, но дала достаточно высокий уровень неспецифического сигнала на всех хромосомах (Рисунок 4 з, и). Для разрешения данной проблемы непосредственно перед проведением гибридизации денатурированную ДНК-пробу инкубировали при 370С для отжига повторенных последовательностей самих на себя, что не привело к решению проблемы. В результате проведения гомологичной гибридизации WCPs хромосом 1 и 2 O. felineus и M. xanthosomus были выявлены хромосомоспецифичные кластеры повторенных последовательностей, локализованные в прицентромерных районах хромосом 1 и 2 и у O. felineus, и у M. xanthosomus (Рисунок 4 з, и). Также был обнаружен дополнительный хромосомоспецифичный кластер в терминальной части р-плеча хромосомы 1 у M. xanthosomus (Рисунок 4 и). Однако попытки проведения хромосомного пэйнтинга с использованием WCPs близкородственных видов, O. felineus и M. xanthosomus, не дали ожидаемых результатов (Рисунок 4 к). Возможно, это обусловлено проведением гетерологичной FISH без супрессии гибридизации повторенных последовательностей, что часто является необходимым условием успешного проведения хромосомного пэйнтинга. Полученный результат указывает на то, что, несмотря на небольшой размер генома описторхид, диспергированные повторенные последовательности представлены в их хромосомах в значительном количестве, и сохранили высокий уровень гомологии у исследованных видов. Наличие столь большого количества диспергированных повторов существенно затруднило проведение гетерологичного хромосомного пэйнтинга даже между двумя представителями одного рода (M. bilis и M. xanthosomus). Оно оказалось неэффективным, несмотря на использование варианта гибридизации Prep-ISH, позволявшего обогатить ДНК-пробу уникальными последовательностями (Рисунок 4 л, м). Наличие кластеров хромосомоспецифичных повторенных последовательностей в хромосомах 1 и 2 у O. felineus и M. xanthosomus описторхид свидетельствует о том, что, ДНК прицентромерных С-позитивных районов крупных хромосом указанных видов описторхид является наиболее быстро эволюционирующей частью их генома, как и у большинства эукариот (Henikoff et al., 2001). * * * Полногеномное секвенирование описторхид позволит решить значительную часть проблем, касающихся эволюции геномов в этом таксоне. Стоит отметить, что проведение секвенирования генома описторха даже с многократным перекрыванием едва ли позволит провести полную сборку секвенированных последовательностей без предварительного построения физических карт хромосом описторха. Для решения этой задачи необходимо получение ВАС-библиотек или космидных библиотек хотя бы одного из видов описторхид. Это позволит с помощью гомологичной и гетерологичной гибридизации in situ индивидуальных клонированных последовательностей построить физические карты хромосом изучаемых видов описторхид и получить необходимые реперные точки для полной сборки их геномов. Для успешного развития этих работ разработка метода получения препаратов пахитенных хромосом, выполненная в настоящем исследовании, имеет огромное значение, так как открывает возможности построения физических карт хромосом описторхид с высоким разрешением и привязкой к их структурно-функциональной организации. Проведение FISH клонированных в ВАСах или космидах фрагментов ДНК крупных хромосом обеспечит надежное маркирование конкретных районов в пахитенных хромосомах, что позволить построить надежные схемы их хромомерной организации и завершить начатую работу по созданию идиограмм пахитенных хромосом изучаемых видов. Построение физических карт хромосом, также позволит провести детальный анализ хромосомных перестроек, имевших место в эволюции описторхид. В связи с этим создание ВАС-библиотеки или космидной библиотеки одного из видов описторхид с последующим ее использованием для построения физических карт на базе пахитенных хромосом описторхид является естественным и необходимым продолжением настоящей работы. ВЫВОДЫ В результате проведения цитогенетического анализа хромосом описторхид с использованием методов дифференциального окрашивания и флуоресцентной гибридизации in situ было показано: - кариотип C. sinensis (2n=14) из Дальнего Востока РФ представлен, образован двумя парами крупных метацентрических хромосом и пятью парами мелких хромосом (субмета-, мета- и акроцентрических); - кариотип M. bilis (2n=14) представлен, двумя парами крупных метацентрических хромосом и пятью парами субмета- и акроцентрических хромосом; - наличие узких С-позитивных блоков в прицентромерных районах всех хромосом исследованных видов описторхид, интерстициальные (у O. felineus, M. xanthosomus) и прителомерные (у всех видов) С-позитивные блоки; обнаружено наличие одного транскрипционно активного ЯО района в одной из мелких хромосом у всех изученных видов описторхид; - кластер рДНК расположен в терминальной части q-плеча хромосомы 3 у исследованных видов описторхид и представлен двумя субблоками, локализованными в GC-богатых районах; показано, что теломерная ДНК описторхид (TTAGGG)n локализована только в теломерных районах их хромосом; - наличие кластеров хромосомоспецифичных повторов для хромосом 1 и 2 O. felineus и M. xanthosomus; показано, что хромосомы описторхид, несмотря на небольшой размер их генома, содержат большое количество диспергированных повторов; Проведение морфометрического анализа хромосом описторхид позволило установить, что их кариотипы обладают схожей морфологией и имеют одинаковое хромосомное число (2n=14) за исключением виверровой двуустки O. viverrini (2n=12), в кариотипе которой присутствует метацентрическая хромосома средних размеров; . Разработанный метод приготовления препаратов пахитенных хромосом позволил впервые предложить номенклатуру хромосом для описторхид (O. felineus, O. viverrini, M. xanthosomus, M. bilis). Сравнительный анализ хромомерной организации мелких хромосом описторхид (O. felineus, O. viverrini, M. bilis, M. xanthosomus) выявил наличие видоспецифических внутрихромосомных перестроек (преимущественно перицентрических инверсий). Установлено, что хромосома 3 виверровой двуустки O. viverrini возникла в ходе слияния хромосом 3 и 7 возможного предкового кариотипа описторхид. Список работ, опубликованных по теме диссертации: Zadesenets K.S., Katokhin A.V., Mordvinov V.A., Rubtsov N.B. Telomeric DNA in chromosomes of five opisthorchid species. // Parasitology International. 2012. 61(1). P.81-83. Zadesenets K.S., Karamysheva T.V., Katokhin A.V., Mordvinov V.A., Rubtsov N.B. Distribution of repetitive DNA sequences in chromosomes of five opisthorchid species (Trematoda, Platyhelminthes). // Parasitology International. 2012. 61(1). P. 84-86. Zadesenets K.S., Katokhin A.V., Mordvinov V.A., Rubtsov N.B. Comparative cytogenetics of opisthorchid species (Trematoda, Opisthorchiidae). // Parasitology International. 2012. 61(1). P. 87-89. Богомолов А.Г., Задесенец К.С., Карамышева Т.В., Подколодный Н.Л., Рубцов Н.Б. Визуализация хромоспецифичных последовательностей ДНК при проведении FISH микродиссекционных ДНК-проб с метафазными хромосомами. // Вавиловский журнал генетики и селекции. – 2012. – 16(2). – С. 202-211. Мордвинов В.А., Катохин А.В., Брусенцов И.И., Романов К.В., Шеховцов С.В., Татьков С.И., Фурман Д.П., Сивков А.Ю., Помазной М.Ю., Львова М.Н., Шаманина М.Ю., Задесенец К.С., Рубцов Н.Б. Исследование генетического разнообразия возбудителей биогельминтозов человека, передающихся через рыбу, ракообразных и продукты их переработки. // Итоговая конференция по приоритетному направлению “Живые системы”. Москва, 2009. Задесенец К.С., Карамышева Т.В., Рубцов Н.Б., Катохин А.В., Мордвинов В.А. Молекулярно-цитогенетический анализ хромосом видов Opisthorchis felineus и Metorchis xanthosomus. // III Межрегиональная конференция паразитологов Сибири и Дальнего Востока, посвященная 80-летию проф. К.П.Федорова. Новосибирск, 2009. Rubtsov N.B., Zadesenets K.S. Chromosome organization in the Opisthorchiidae (Trematoda). // 7th International conference on bioinformatics of genome regulation and structure\system biology (BGRS/SB’2010). Novosibirsk, 2010. Задесенец К.С., Карамышева Т.В., Рубцов Н.Б., Катохин А.В., Мордвинов В.А. Хромосомы описторхид (Trematoda, Opisthorchiidae). // V Международная конференция по кариосистематике беспозвоночных животных (KARYO V). Новосибирск, 2010. Задесенец К.С., Карамышева Т.В., Катохин А.В., Мордвинов В.А., Рубцов Н.Б. Анализ распределения повторенных последовательностей в хромосомах O. felineus и M. xanthosomus. // Международная научная конференция “Теоретические и практические проблемы паразитологии”. Москва, 2010. Zadesenets K.S., Karamycheva T.V., Katokhin A.V., Mordvinov V.A., Rubtsov N.B. Chromosomes of five species of liver flukes (Platyhelminthes, Trematoda). // 18th International Chromosome Conference 2011. Manchester, UK, 2011. Pakharukova M.Y., Ershov N.I., Vavilin V.A., Zadesenets K.S., Katokhin A.V., Merkulova T.I., Mordvinov V.A. Organization of xenobiotic-metabolizing system phase 1 in Opisthorchis felineus (Trematoda, Platyhelminthes). // 12th International Symposium on Flatworm Biology. Stockholm, Sweden, 2012. Bogomolov A.G., Zadesenets K.S., Karamysheva T.V., Podkolodny N.L., Rubtsov N.B. Fluorescence in situ hybridization with chromosome-derived DNA probes on Opisthorchis felineus and Metorchis xanthosomus chromosomes without suppression of repetitive DNA sequences. // 8th International conference on bioinformatics of genome regulation and structure\system biology (BGRS/SB’2012). Novosibirsk, 2012. Задесенец К.С., Карамышева Т.В., Катохин А.В., Мордвинов В.А., Рубцов Н.Б. Структурно-функциональная организация хромосом описторхид (Platyhelminthes, Trematoda). // Хромосома - 2012. Новосибирск, 2012. Задесенец К.С., Дюкалова М.Б., Виноградова М.С., Катохин А.В., Мордвинов В.А., Рубцов Н.Б. Комплексный микроскопический подход в изучении морфологии кошачьей двуустки Opisthorchis felineus (Rivolta, 1884). // “Современные проблемы общей паразитологии”. Москва, 2012.

Похожие:

	Методическая разработка к практическому занятию для студентов 1 курса... ...		Методическая разработка к практическому занятию для студентов 1 курса... ...
	Программа вступительного экзамена «Клеточная биология, цитология, гистология» Экзамен проходит по традиционной форме, в соответствии с содержанием курса гистологии и клеточной биологии		Программа вступительного экзамена по специальности «Клеточная биология, цитология, гистология» Программа вступительных испытаний при приеме на обучение по программам подготовки научно-педагогических кадров в аспирантуре сформирована...
	Система цитокинов и их рецепторов при хронических вирусных инфекциях:... Форма обучения: очная, заочная (сокращенная), очно-заочная (вечерняя), очно-заочная (вечерняя) сокращенная		Учебной дисциплины «гистология, эмбриология, цитология» Специальность... Дисциплина «Гистология, эмбриология, цитология», относится к циклу математических, естественнонаучных дисциплин. Основные знания,...
	Рабочая программа учебной дисциплины Гистология, эмбриология, цитология-гистология... Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования		Рабочая программа учебной дисциплины единство и разнообразие клеточных... Изучение данной дисциплины базируется на знании дисциплин профессионального блока «Ботаника», «Методы биологического эксперимента»,...
	Рабочая программа дисциплины опубликована на сайте ТюмГУ: Цитология... «Биология», профили ботаника, зоология, физиология, генетика, биоэкология; форма обучения – очная		Учебно-методический комплекс дисциплины сд. Дс. Ф. 4 Гистология сд... ...
	Рабочая программа составлена в соответствии с требованиями фгос во... Изучение данной дисциплины базируется на знании дисциплин профессионального блока «Ботаника», «Методы биологического эксперимента»,...		Гистология, эмбриология, цитология гистология полости рта Дать знания по цитологии, эмбриологии, общей и частной гистологии и умения их практического использования, необходимые для успешного...
	Урок-зачет по теме "Учение о клетке" в 10-м классе За 2 недели до зачёта 3 (6) ученика получают задание составить вопросы разного уровня сложности по разделам «Химическая организация...		Рабочая учебная программа дисциплины «Гистология, эмбриология, цитология,... Рабочая учебная программа разработана в соответствии с фгос впо по направлению подготовки (специальности) 060201. 65 Стоматология,...
	№1. Цитология занятие №2. Строение клетки: клеточная оболочка. Цитоплазма Предмет и задачи цитологии, ее значение в системе биологических и медицинских наук		Рабочая программа составлена в соответствии с требованиями фгос во... Изучение данной дисциплины базируется на знании дисциплин профессионального блока «Методы биологического эксперимента», «Цитология...