Глава 3 Оценка свободно-радикального статуса крови больных со стафилококковой инфекцией разной степени тяжести (локальные инфекции – абсцессы, флегмоны; синдром системного воспалительного ответа (ССВО), тяжелый сепсис) в динамике инфекционного заболевания (1, 2, 5, 7, 10, 14, 30 сутки): определение радикалообразующей активности нейтрофилов (ХЛ), измерение супероксид радикала нейтрофилами (реакция восстановления супероксидом цитохрома с), исследование уровня оксида азота (с помощью реактива Гриса), определение внутриклеточной составляющей кислородных радикалов методом флуоресцентных красителей, изучение активности антиоксидантных ферментов лейкоцитов
Исследование свободно-радикального статуса фагоцитов больных фолликулярной и лакунарной ангиной. Биохимическими маркерами антибактериального и, в частности антистафилококкового иммунитета, являются некоторые параметры свободно-радикальных процессов в крови больного, такие как продукция свободных радикалов кислорода и азота фагоцитирующими клетками, активность основных антиокислительных ферментов в лейкоцитах, антиокислительная емкость плазмы. В настоящей части работы изучали свободно-радикальный статус фагоцитов больных инфекционными заболеваниями, вызванными одним возбудителем - S.aureus, но различными по локализации и тяжести течения. В динамике инфекционного процесса оценивали активность параметров свободно-радикального статуса (радикал-формирующую способность нейтрофилов и активность антиоксидантной системы) наряду с оценкой эффективности фагоцитарных функций нейтрофилов больных.
Нейтрофилы больных фолликулярной и лакунарной ангиной в острой фазе воспалительного процесса (момент поступления в стационар) внеклеточно продуцировали значительно превосходящие нормальные количества супероксидного анион-радикала и оксида азота (рисунок 1). Об этом судили по степени внеклеточного восстановления белка – цитохрома с, который специфически реагирует с супероксидом, и по суммарному уровню нитратов\нитритов в плазме крови. У больных с лакунарной ангиной оба показателя радикал-формирующей способности нейтрофилов достоверно выше, по сравнению с показателями больных с фолликулярной ангиной (p<0,05), что говорит о большей активности воспалительного процесса в первом случае. К пятому и, особенно к седьмому дню количество супероксидных радикалов понижается, но не сравнивается с показателями здоровых доноров (p<0,01) (таблица 34). Динамика изменений плазменной концентрации нитратов/нитритов совпадает с изменением уровня супероксид аниона в разные периоды инфекционного заболевания. Количество нитратов/нитритов перед выпиской больного из стационара также достоверно выше показателей доноров (р<0,01) (таблица 34).
Таким образом, обнаружено, что уровень показателей радикал-формирующей способности нейтрофилов наиболее высокий в остром периоде воспалительного процесса. У больных с лакунарной ангиной в отличие от больных с фолликулярной ангиной параметры свободно-радикального статуса фагоцитов на 7 сутки (перед выпиской) не приходят в норму (р<0,01). Активные формы кислорода (АФК) и оксид азота (NO) являются мощным бактерицидным фактором.
Для нас представляло интерес изучение фагоцитарной активности нейтрофилов. Обнаружено, что количество фагоцитирующих клеток и эффективность внутриклеточного киллинга снижены в обеих подгруппах больных по сравнению с здоровыми донорами (р<0,05).
Так как свободные радикалы продуцируются благодаря различным ферментным системам и могут генерироваться как внеклеточно, так и внутриклеточно, на следующем этапе мы оценили активность внутриклеточной генерации АФК. Для регистрации внутриклеточной продукции свободных радикалов был использован слабо флуоресцирующий краситель гидроэтидин, который окисляется внутри цитоплазмы перекисью водорода и другими активными формами кислорода, давая при этом сильно флуоресцирующее соединение. Было обнаружено, что доля внутриклеточной концентрации кислородных радикалов значительно снижена в нейтрофилах больных по сравнению со здоровыми донорами (рисунок 2).
восстановление ЦХ с, (нМ/мин)
количество нитратов/нитритов в плазме крови, (мкМ/мл)
фолликулярная ангина
лакунарная ангина
здоровые доноры
Рисунок 1- Показатели радикалформирующей способности нейтрофилов больных фолликулярной и лакунарной ангиной в острой фазе инфекционного процесса.
Так как свободные радикалы продуцируются благодаря различным ферментным системам и могут генерироваться как внеклеточно, так и внутриклеточно, на следующем этапе мы оценили активность внутриклеточной генерации АФК.
Для регистрации внутриклеточной продукции свободных радикалов был использован слабо флуоресцирующий краситель гидроэтидин, который окисляется внутри цитоплазмы перекисью водорода и другими активными формами кислорода, давая при этом сильно флуоресцирующее соединение.
Было обнаружено, что доля внутриклеточной концентрации кислородных радикалов значительно снижена в нейтрофилах больных по сравнению со здоровыми донорами (рисунок 2).
Таблица 34 - Радикалообразующая способность нейтрофилов больных с фолликулярной и лакунарной ангиной в динамике инфекционного заболевания (x±m).
Нейтрофилы
периферической крови
|
Число пациентов
|
Восстановление
цитохрома с, (нМ\мин)
|
Концентрация нитратов и нитритов в 1 мл плазмы, (мкМ)
|
1*
|
2
|
5
|
7
|
1
|
2
|
5
|
7
|
Больные с фолликулярной ангиной
|
40
|
6,2
±0,51
|
6,0
±0,31
|
5,5
±0,21
|
2,2
±0,52
|
55,0
±10,51
|
50,0
±8,51
|
35,0
±4,51,2
|
26,0
±5,51
|
Больные с лакунарной ангиной
|
35
|
7,5
±0,51
|
7,0
±0,31
|
5,5
±0,11,2
|
3,5
±0,41,2
|
75,0
±7,51
|
55,0
±9,51,2
|
42,0
±5,51,2
|
39,0
±4,51,2
|
Здоровые доноры
|
30
|
1,3
±0,5
|
-
|
-
|
-
|
10,0
±2,5
|
-
|
-
|
-
|
*- дни пребывания в стационаре
1-p<0,01 – относительно показателей здоровых доноров
2- p<0,05 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки).
Особенно заметен спад генерации внутриклеточных радикалов в первые два дня пребывания больных в стационаре (период разгара воспалительного процесса). Как и в случае с исследования внеклеточной генерации радикалов, у больных с лакунарной ангиной показатели изменены сильнее (рис.2).
К седьмому дню лечения в стационаре доля внутриклеточных радикалов в нейтрофилах больных лакунарной ангиной ниже нормы на 15%, в нейтрофилах больных с фолликулярной ангиной ниже нормы на 12 %.
Из полученных данных мы заключили, что в активной фазе инфекционного процесса в миндалинах происходит мощный выброс радикалов нейтрофилами (продукция супероксиданион радикала, повышенный выброс внеклеточных кислородных радикалов, повышение концентрации нитратов/нитритов в плазме). внутриклеточного уничтожения инфекта.
Рисунок 2 - Внутриклеточная продукция активных форм кислорода нейтрофилами больных фолликулярной и лакунарной ангиной в динамике инфекционного процесса, (Rin\RΣ, (%)).
Однако при этом смещается равновесие между внеклеточной и внутриклеточной продукцией микробицидных радикалов в сторону внеклеточного выброса, что сказывается на эффективности. С другой стороны, гиперпродукция свободных радикалов во внеклеточное пространство неизбежно должна была привести к адаптационному повышению активности антиоксидантных ферментов и, как результат, к увеличению общей антиоксидантной емкости плазмы крови. Действительно, в группе больных с лакунарной ангиной на пике воспаления (при поступлении в стационар) были обнаружены повышенные по сравнению с нормой показатели активности каталазы и супероксид дисмутазы, также была увеличена антиоксидантная емкость плазмы (таблицы 36,37). На фоне начатого лечения больных с лакунарной ангиной (вторые сутки) активность обоих ферментов и антиокислительная емкость плазмы резко падали ниже уровня нормы. Затем на пятые-седьмые сутки происходила постепенная нормализация всех измеряемых антиоксидантных параметров. Для другой группы больных (с фолликулярной ангиной) не было выявлено достоверного увеличения вышеуказанных показателей. Однако отмечалась характерная динамика антиоксидантов нейтрофилов и плазмы, зависящая от времени пребывания в стационаре (таблицы 35,36).
Таблица 35 - Показатели активности антиоксидантных ферментов у больныхс фолликулярной и лакунарной ангиной в динамике инфекционного заболевания (x±m).
Группа
|
Число пациентов
|
Каталаза, ед\г мин
|
СОД, ед\г белка
|
1*
|
2
|
5
|
7
|
1
|
2
|
5
|
7
|
Больные с фолликулярной ангиной
|
40
|
3,7
±0,5
|
3,4
±0,3
|
3,5
±0,4
|
3,4
±0,2
|
1,3
±0,1
|
0,9
±0,2
|
1,0
±0,2
|
1,3
±0,1
|
Больные с лакунарной ангиной
|
35
|
4,31
±0,1
|
3,11,2
±0,1
|
3,72
±0,2
|
3,5
±0,4
|
1,51
±0,1
|
0,91,2
±0,1
|
1,0
±0,1
|
1,2
±0,1
|
Здоровые доноры
|
30
|
3,5
±0,3
|
-
|
-
|
-
|
1,2
±0,1
|
-
|
-
|
-
|
*- дни пребывания в стационаре
1-p<0,01 – относительно показателей здоровых доноров
2- p<0,05 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки).
Таблица 36 - Антиоксидантная емкость плазмы крови больных фолликулярной и лакунарной ангиной в динамике инфекционного заболевания (x±m).
Группа
|
Число пациентов
|
Антиоксидантная емкость плазмы,%
|
1*
|
2
|
5
|
7
|
Больные с фолликулярной ангиной
|
40
|
58,0±2,5
|
48,5±1,51
|
50,0±1,01
|
57,0±2,5
|
Больные с лакунарной ангиной
|
35
|
63,5±1,01
|
45,0±1,01,2
|
58,0±1,5
|
55,0±1,0
|
Здоровые доноры
|
30
|
58,0±1,5
|
-
|
-
|
-
|
*- дни пребывания в стационаре
1-p<0,01 – относительно показателей здоровых доноров
2- p<0,05 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки).
Итак, свободно-радикальный статус больных с ангиной характеризуется повышенным внеклеточным выбросом радикалов в острый период воспалительного процесса, на фоне подъема (в первые сутки), а затем резкого спада активности антиоксидантной системы. Активность антирадикальных ферментов нормализуется к седьмым суткам, в отличие от показателей радикал-формирующей способности нейтрофилов (они остаются слегка повышенными и перед выпиской из стационара).
Доля внутриклеточных АФК у больных ангиной в острый период снижена более чем в два раза, что приводит к неэффективному внутриклеточному перевариванию бактерий и является предпосылкой их длительной персистенции в организме.
Все исследованные параметры свободно-радикального статуса фагоцитов достоверно больше изменены в группе больных с лакунарной ангиной и являются одними из показателей тяжести течения инфекционного процесса.
Изучение свободнорадикального статуса фагоцитов больных с хирургическими инфекциями мягких тканей. Больные с хирургическими инфекциями мягких тканей были разделены на три подгруппы по локализации гнойного процесса и степени тяжести (ягодичные абсцессы, одонтогенные околочелюстные флегмоны, гнойные маститы).
Рисунок 3 - Показатели радикалформирующей способности нейтрофилов больныхс флегмонами челюстно-лицевой области |
