Введение
Несмотря на бурное развитие антибактериальной терапии и появление множества новейших антибиотиков с широким спектром действия, проблема изучения патогенеза стафилококковой инфекции и поиска наиболее эффективных средств борьбы с ней продолжает оставаться актуальной [1,2,3,4]. Основными неспецифическими клетками-эффекторами в защите от бактериальных инфекционных агентов, в том числе стафилококков, являются полиморфноядерные лейкоциты [5,6,7]. В последнее время нарушение функциональной активности нейтрофилов и цитокинового баланса организма рассматривается как причины и как следствие тяжелой гнойной инфекции и сепсиса [8,9,10,11].
Биохимическими маркерами антибактериального иммунитета являются некоторые параметры свободно-радикальных процессов в крови больного,такие как продукция свободных радикалов кислорода [12,13] и азота [14,15,16,17] фагоцитирующими клетками крови, активность основных антиокислительных ферментов в лейкоцитах, антиокислительная емкость плазмы [18]. В зависимости от типа и интенсивности бактериального стимула продукция свободных радикалов и направление их генерации изменяются. Так, в острой фазе бактериальной инфекции тканевые фагоциты и лейкоциты крови продуцируют максимальное количество свободных радикалов преимущественно внеклеточно [19,20], что объясняется необходимостью быстрой внеклеточной инактивации бактерий путем окисления бактериальных структур и необратимого повреждения ряда функций бактериальной клетки. Однако, несмотря на повышенную генерацию радикалов в острый период заболевания, в литературе описано снижение фагоцитарной активности нейтрофилов больных бактериальными инфекциями (в том числе и стафилококковой этиологии) [21,22,23,24]. Понимание причин неэффективности работы фагоцитарного звена при различных формах инфекционного процесса открывает возможность коррекции иммунодефицита.
Чрезмерный избыток активных форм кислорода и оксида азота трансформирует эффект радикалов из защитного в цитотоксический [25,26,27,28,29]. Это может быть как причиной разного рода заболеваний, так и сопровождать течение патологических процессов, таких как перитонит, сепсис, септический шок [30,31,32,33]. В этом случае радикалы могут проявлять токсическое действие и участвовать в разрушении ткани в ходе воспалительного процесса, дополняя действие липидных медиаторов и протеаз и других воспалительных медиаторов [34,35,36]. Условия, при которых радикалы меняют свои защитные свойства на токсические, могут быть связаны с концентрацией медиаторов воспаления, таких как простагландины и лейкотриены [37,38], металлов переходной валентности [39,40], цитокиновым профилем организма [41,42], но при высокой антиоксидантной емкости цитотоксический эффект будет незначительным [43,44]. Однако в последние годы установлено, что при целом ряде патологических процессов происходит снижение активности антиоксидантной системы (гипоксия, стресс, гнойно-воспалительные заболевания брюшной полости, инфаркт миокарда) [45,46,47,48], что влечет за собой осложнения заболеваний.
Целью исследования на первом этапе было исследование особенностей свободно-радикального статуса пациентов с бактериальными (стафилококковыми) инфекциями разной степени тяжести.
Глава 1 Обзор теоретических и экспериментальных работ по исследуемой проблеме
1.1 Свободные радикалы в патогенезе бактериальной (стафилококковой) инфекции
За последние десятилетия накопилось большое количество экспериментальных данных, доказывающих участие свободных радикалов в патогенезе инфекционных (и в частности стафилококковых) заболеваний [49,50,51,52,53].
Все радикалы, образующиеся в нашем организме, можно разделить на 3 категории (таблица 1).
Первичные радикалы, образующиеся из молекул за счет реакций одноэлектронного окисления с участием металлов переменной валентности. Это компоненты дыхательной цепи, такие как радикалы убихинона (коэнзимаQ), супероксид (О2-.) и окись азота (NO).
Вторичными радикалами являются те, которые образуются, как правило, из первичных: перекиси водорода, липоперекисей, гипохлорита в присутствии ионов двухвалентного железа.
К вторичным радикалам относятся, прежде всего, гидроксильный радикал и липидные радикалы, участвующие в реакциях цепного окисления ненасыщенных жирнокислотных цепей липидов биологических мембран и липопротеидов плазмы крови. Третичные радикалы – это радикалы, которые образуются при действии вторичных радикалов на молекулы антиоксидантов и других легко окисляющихся соединений [54].
Первичные радикалы специально вырабатываются нашим организмом и выполняют жизненно важные функции: перенос электрона в дыхательной цепи (убихинон), защита от микроорганизмов (супероксид) и регуляция кровяного давления (оксид азота), тогда как вторичные радикалы оказывают цитотоксическое действие и наносят организму большой вред [55].
Роль третичных радикалов может быть различной.
Таблица 1 - Метаболизм свободных радикалов.
Образование радикалов
|
Удаление радикалов
|
Первичные радикалы:
семихиноны
супероксид
оксид азота
|
Восстановители
СОД
Гемоглобин
|
Радикалообразующие молекулы:
Перекись водорода
Перекиси липидов
Гипохлорит
ионы Fe2+
|
Каталаза, пероксидазы
Глутатионпероксидаза
Церуроплазмин, ферритин, комплексоны
|
Вторичные радикалы:
Гидроксил
Липидные радикалы
|
Ловушки радикалов
Ловушки радикалов
|
Третичные радикалы
|
|
При рассмотрении вопросов участия свободных радикалов в патогенезе инфекций, вызванных S.aureus, более подробно коснемся вопросов о роли активных форм кислорода и оксида азота.
Активные формы кислорода. Физико-химические характеристики АФК. Свободным радикалом называется частица – атом или молекула, имеющая на внешней орбитали один или несколько неспаренных электронов. Образование радикалов из устойчивых молекул обусловлено появлением на свободной орбитали нового электрона или удалением электрона из пары. Эти процессы обычно происходят в результате реакций окисления или восстановления. Если электроны принадлежат к разным атомам и образуют между ними химическую связь, то разъединение этих электронов может также приводить к образованию свободных радикалов.
Супероксиданион радикал - восстанавливает трехвалентное железо до двухвалентного, которое весьма токсично, так как разлагает перекиси липидов, перекись водорода и гипохлорит с образованием активных вторичных радикалов. Взаимодействуя с NO образует весьма токсичное соединение – пероксинитрит [56,57,58]. Гидроксильный радикал реагирует практически со всеми окружающими молекулами, но только малое число из всех возможных взаимодействий приводит к биологически значимому эффекту (инактивация ферментов, появление новых антигенных свойств у макромолекул, окисление тиоловых групп белков и др.). Время полужизини гидроксил радикала в биологических системах составляет несколько микросекунд, а радиус диффузии около 100нм. Молекула перекиси водорода достаточно стабильна и не несет электрического заряда, сочетание этих свойств позволяет легко проникать через биологические мембраны, в отличие от других АФК. Проникая внутрь клетки, прекись может взаимодействовать с ионами железа и меди. Цитотоксичность перекиси связана, в основном, с тем, что в присутствии ионов железа, перекись водорода является источником гидроксил радикалов. Повреждающее действие синглетного кислорода проявляется в окислении аминокислотных остатков гистидина, триптофана, тирозина, цистеина, метионина, в поперечном сшивании и окислении ненасыщенных жирных кислот мембран.
Механизмы генерации активных форм кислорода. Контакт фагоцитирующих клеток (тканевые макрофаги, моноциты, нейтрофилы крови, купферовские клетки печени, остеокласты костной ткани) с корпускулярными частицами или растворимыми стимуляторами приводит к резкому изменению метаболического профиля клетки [59]. К наиболее ярким сдвигам относится резкое повышение расхода глюкозы в реакциях гексозомонофосфатного шунта (ГМФШ). Одновременно возрастает потребление клеткой кислорода и образование его активных форм (АФК) – мощных биооксидантов: синглетного кислорода - О1, супероксидного радикала – О2-., гидроксильного радикала ОН., пероксида водорода Н2О2. Внезапность и скорость, с которой возникают эти реакции, послужили для образного сравнения их с взрывом. «Кислородный взрыв» - это одно из универсальных проявлений реактивности фагоцитов .
Первичным метаболитом восстановления кислорода является супероксид анион-радикал [60]. В 60-х годах была выдвинута теория «супероксид-зависимой токсичности кислорода». Согласно этой теории предполагалось, что образование супероксида является основной причиной повреждений, вызываемых молекулярным кислородом и его производными. Реакциями, определяющими свойства супероксид аниона являются следующие реакции:
депротонирования субстрата (HX)
О2-. +НХ <=>НО2. +Х-
окисление
Х-+ О2-.<=> Х. + О22-
восстановление
О2-. +Х <=> О2 +Х-
Основной же реакцией, определяющей свойства супероксид аниона, является реакция протонирования:
О2-. +Н+<=> НО2.
Протонированная форма супероксид аниона - НО2. является более сильным восстановителем, чем О2-..
По приведенным в литературе обширным данным, можно заключить, что супероксид анион и его протонированная форма достаточно сильные окислители: быстро окисляются гидрохиноны, аскорбат, а также ионы переменной валентности [61,62]. В других реакциях супероксид анион может выступать в качестве восстановителя. Взаимодействие О2-. с нитросиним тетразолием, люминолом, цитохромом «с» протекает с высокими значениями констант скорости реакции. Эти реакции используются для спекртрофотометрического и хемилюминесцентного методов. Химическая активность супероксида аниона сильно зависит от условий окружающей среды: полярности, рН, температуры. Однако, исходя из того, что супероксид анион, находящийся в неполярном окружении, легко окисляет углеводороды, можно предположить, что теория токсичности кислородных радикалов, в соответствии с которой основным звеном повреждения является диоксид, имеет немало оснований. Другой вопрос, каков конкретно механизм реакций супероксид аниона с биологическими субстратами и какие превращения претерпевает молекула супероксида в этих реакциях.
В любой системе, где вырабатывается супероксид анион, можно предполагать также и образование перекиси водорода в результате реакции дисмутации. Действительно, основные источники супероксид аниона в биологических системах – реакции с участием ксантиноксидазы, митохондриальных и микросомальных цепей электронов – одновременно служат источником Н2О2 [63,64]. Тем не менее, концентрация Н2О2 остается низкой, поскольку она зависит не столько от скорости образования Н2О2, сколько от скорости разложения перекиси водорода в присутствии ионов переменной валентности (реакция Фентона). Кроме того, Н2О2 является субстратом глутатион-пероксидазы и каталазы, которые катализируют следующие реакции:
глутатион
2GSH+ Н2О2 ------------>>GSSG+ Н2О
пероксидаза
(здесь GSH и GSSG – восстановленный и окисленный глутатион)
каталаза
2Н2О2------------>>2 Н2О+ О2
Благодаря активации фагоцитов особенно велика концентрация Н2О2 в очагах воспаления. В отличие от супероксид аниона пероксид водорода не является радикалом (т.е. не имеет неспаренных электронов), поэтому Н2О2 называют умеренным окислителем. Цитотоксическое действие Н2О2, по-видимому, обусловлено тем, что он в присутствии ионов переменной валентности может быть источником ОН. радикалов, образование которых происходит в реакции Фентона:
Н2О2+Fe +2------------>> ОН. + ОН-+Fe +3
Эта реакция является основной реакцией образования ОН. радикалов в биологических системах. Другой важной реакцией образования ОН. радикалов может быть реакция Хабера-Вайса:
О2-.+ Н2О2 +Н + ------------>>1О2 + Н2О+ ОН.
ОН..+ Н2О2 ------------>> Н2О+Н ++ О2-.
В условиях, близких к физиологическим, скорость реакции Хабера-Вайса определяется содержанием солей железа в исследуемой системе.
Возможно, наиболее важным проявлением токсического действия ОН. радикалов является пероксидация липидов [65]. О2-. и ОН. радикалы участвуют также в процессе разрушения цепочки ДНК, причем наблюдается неспецифический разрыв связи (в любом нуклеотиде) [66,67]. Гидроксильный радикал реагирует с дезоксирибозой, рибозой, пуриновыми и пиримидиновыми основаниями нуклеиновых кислот, расщепление которых приводит к разрыву ДНК [68,69].
Синглетный кислород атакует соединения с двойной связью, и подобно гидроксильному радикалу, способен летально поражать биологические системы, с которыми он вступает во взаимодействие – окисляет белки, аминокислоты, липиды, нуклеиновые кислоты [70].
Основной механизм образования АФК сводится к резкому повышению образования НАДФН в клетке в результате активации гексозо-монофосфатного шунта и окисления НАДФН ферментным комплексом НАДФН-оксидазой [71]. Последняя, будучи мембраносвязанным ферментом, осуществляет одноэлектронное восстановление молекулярного кислорода до супероксидного радикала на внешней поверхности плазматической мембраны за счет окисления НАДФН на ее внутренней стороне [72]. При этом нарабатывается новая порция НАДФН, замыкая положительную обратную связь.
Таким образом, основными системами продукции АФК в фагоцитах являются мембраносвязанная НАДФН-оксидаза цитолеммы, устойчивая к цианиду, электронно-транспортные цепи митохондрий, начальные этапы циклооксигеназного и липооксигеназного путей метаболизма арахидоновой кислот.Также система «миелопероксидаза-галоген-пероксид водорода», где продуцируются высокотоксичные галоид-производные оксиленного кислорода. Местом образования АФК могут быть также электроно-транспортные цепи микросом, суммарная мощность которых не меньше чем мощность дыхательной цепи митохондрий.
Внутриклеточная продукция активных форм кислорода. В настоящее время большинство исследований окислительного метаболизма фагоцитов касается внеклеточной генерации активных метаболитов кислорода [73,74,75]. Однако, известно, что часть радикалов образуется внутриклеточно [76,77,78]. О механизме внутриклеточной генерации АФК, несмотря на интенсивные исследования, нет до сих пор однозначного мнения. Из работ 80-х годов известно, что источником внутриклеточных радикалов могут быть О2-. радикалы, продуцируемые НАДФН-оксидазой снаружи клетки [79]. Супероксидный радикал и перекись водорода не входят непосредственно в цитоплазму, а продуцируются дискретно только в местах тесного контакта объекта фагоцитоза с плазмолеммой. Стимулированные нейтрофилы генерируют перекись либо на внешней стороне поверхности плазмолеммы, либо на внутренней поверхности фагосомы.
Стимулированные макрофаги также обладают способностью вырабатывать перекись водорода во внутриклеточных везикулах. Kobzik L. С соавторами придерживается мнения, что внутриклеточная генерация АФК происходит в результате разобщения дыхательной цепи митохондрий. Folling F. с соавторами отдают предпочтение миелопероксидазе нейтрофилов, которая по их мнению, может продуцировать АФК внутрь клетки. В перитонеальных макрофагах метаболиты арахидоновой кислоты продуцируются как наружу, так и внутрь клетки. Причем вначале стимуляции одинаковое количество радикалов производных арахидоновой кислоты образуется и снаружи и внутри плазмалеммы, а затем внеклеточная продукция активных метаболитов кислорода снижается, хотя внутриклеточная остается на том же уровн. Dahlren C. с соавторами в работах по изучения вне- и внутриклеточной продукции радикалов приходит к заключению, что источники внутриклеточных радикалов могут быть различными в зависимости от типа и дозы активирующего агента. Биологическая роль внутриклеточной генерации АФК в большинстве работ связывается с уничтожением поглощенных микроорганизмов. Однако, состояние свободно-радикального статуса и оценка внутриклеточной генерации АФК при инфекционных патологиях, характеризующихся длительной персистенцией микробов в организме практически не изучены. Поглощенные фагоцитом микроорганизмы при дефиците внутренних радикалов оказываются защищенными от сывороточных бактерицидных факторов и размножаются внутри клетки, вызывая вялотекущие хронические процессы, плохо поддающиеся традиционному лечению.
Роль активных форм кислорода в антистафилококковом иммунитете |
