Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России»
Скачать 2.62 Mb.
|
| . На участие АФК в антимикробной деятельности макрофагов указывают 2 категории явлений: 1) существование корреляции между способностью макрофагов генерировать АФК и ингибировать размножение внутриклеточных паразитов [80,81,82]; 2) наличие связи между антиоксидантной защитой некоторых микроорганизмов и их резистентностью к влиянию АФК [83,84]. Нейтрофилы и моноцитарно-макрофагальные клетки ответственны за неспецифическую резистентность организма при различных инфекционных патологиях, что определяется их способностью к поглощению и обезвреживанию микроорганизмов. Все антимикробные и антипаразитарные факторы фагоцитов можно разделить на две группы: кислород-зависимые и кислород-независимые [85,86]. К числу последних относятся - лизоцим, катионные белки, нейтральные протеиназы (эластаза, катепсин G), молочная кислота, аргиназа, сериновая протеаза и др. Кислороднезависимые механизмы бактерицидности играют существенную роль в защите от микроорганизмов. Замечено, что гипоксия в очаге воспаления, а также отсутствие генерации лейкоцитами активных форм кислорода у больных с наследственной формой хронического гранулематоза снижают, но полностью не подавляют способность фагоцитов убивать микроорганизмы [87]. Это, прежде всего, связывают с дефензинами – катионными белками, встраивающимися в бактериальную стенку и образующими каналы, подобные комплементу [88]. Дефензимы действуют в течении короткого периода в начале слияния фагосомы с лизосомой. Гистоны и лизосомные катионные белки лейкоцитов также обладают высокой бактерицидной активностью. Их действие основано на нарушении структуры и функции мембран микробной клетки. Впервые 15-30 минут (обратимая фаза) вследствие нарушения проницаемости мембран во внешнюю среду «вытекает» часть эндогенных компонентов микробной клетки. Вторая фаза (необратимая) длится 1-5 часов и связана с деструкцией стенки миробной клетк. По данным электронной микроскопии, у клеток S.aureus возникают разрывы цитоплазматической мембраны, резко изменяется клеточная стенка, уменьшается область, в которой располагается ядерный материал. Основой другого механизма, ответственного за деструкцию бактерий, является способность фагоцитов к респираторному взрыву. Баланс между этими двумя системами обеспечивает полноценное участие фагоцитарных клеток в противоинфекционной защите организма. Активные формы кислорода (АФК) имеют важное значение в бактерицидном действии фагоцитирующих клеток. Характерным примером, подтверждающим жизненно важное значение кислород-зависимых механизмов в противомикробной защите, является заболевание хронический гранулематоз [89]. Причиной этого заболевания является врожденный дефект НАДФН-оксидазы. В отсутствии НАДФН-оксидазы фагоциты не могут продуцировать О2-., а значит и Н2О2 , ОН., НОCl. Сходные процессы происходят и в случае врожденного дефекта миелопероксидазы. В результате неполноценной оксидазной системы лейкоциты таких больных не способны убивать определенные микроорганизмы (представителей родов Staphylococcus, Klebsiella, Candida, Pseudomonas, Serratia, Salmonella), вследствие чего возникает рецидивирующий инфекционный процесс, часто переходящий в сепсис. Прежде лица, страдающие хроническим гранулематозом, редко доживали до юношеского возраста. Лечение современными антибиотиками изменило течение заболевания, и в настоящее время основные проблемы связаны с осложнениями недолеченных хронических инфекций, включая легочный фиброз, бронхоэктаз, стриктуры желудочно-кишечного и мочевого тракта. Как правило, инфекции у больных с выраженным дефектом кислород-зависимой антимикробной функцией фагоцитов протекают особенно тяжело и часто приводят к летальному исходу. При стафилококковой инфекции первой на внедрение бактерий отвечает система НАДФН-оксидазы [90]. Механизм активации радикал-продуцирующих клеток при бактериальной инфекции в основном рецептор-зависимый. Известно, что пептидогликан и его детерминанты обладают иммуностимулирующими и адъювантными свойствами. Janeway C.A. и Medzhitov R. доказали участие Toll-подобных рецепторов в адаптивном ответе иммунной системы на микробную агрессию [91]. При фагоцитозе инвагинация мембраны приводит к образованию фагосомы, где фермент локализован уже на внутренней стороне мембраны. В процессе окислительного метаболизма генерируются супероксид анион, перекись водорода, гидроксил анион, синглетный кислород. При изучении механизма инактивации золотистого стафилококка фагоцитами показано, что к основным бактерицидным факторам относится гидроксильный радикал, О2-. , и перекись водорода. Они участвуют в пероксидации липидов [92,93] и в процессе разрушения цепочки ДНК. Гидроксильный радикал реагирует с дезоксирибозой, рибозой, пуриновыми и пиримидиновыми основаниями нуклеиновых кислот, расщепление которых приводит к разрыву ДНК [94,95]. Перекись водорода обладает слабым бактерицидным действием в отношении стафилококка, но ее активность резко повышается в присутствии фермента миелопероксидазы. Миелопероксидаза является основной бактерицидной системой полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПМЯЛ). Это железосодержащий катионный белок с молекулярной массой 122кД, локализованный в азурофильных гранулах и фагосомах. В системе миелопероксидазы (в нейтрофилах), образуется гипохлорит-ион, также обладающий высокой реактивностью в отношении стафилококков. Бактерицидное действие миелопероксидазы проявляется только при наличии в среде перекиси водорода и галогенов. В основе механизма ее бактерицидного действия лежит галогенизация белков бактерий. Реакция протекает по следующей схеме: миелопероксидаза Х- +Н2О2+АН-------------------> АХ+ОН-+Н2О, где Х- - галогены (I-,Cl-,Br-), A – белки бактерий. Концентрация компонентов миелопероксидазной системы в нейтрофилах возрастает при фагоцитозе. Перекись водорода образуется в результате окисления глюкозо-6-фосфата через гексозомонофосфатный шунт. При фагоцитозе ее образование в нейтрофилах увеличивается в 2-4 раза по сравнению с нормой. Йод поступает в нейтрофилы в виде гормонов щитоцидной железы. При недостаточной концентрации ионов йода в бактерицидной миелопероксидазной системе в процесс вовлекаются хлориды и бромиды. Гипохлорит может взаимодействовать с супероксидом с образованием других токсичных кислородных метаболитов, например, синглетного кислорода. Липофильные хлорамины, продукты взаимодействия гипохлорита с аминами, чрезвычайно токсичны, благодаря своей способности проникать через клеточные и бактериальные мембраны и атаковать внутриклеточные мишени. Кроме того, гипохлорит инактивирует железо- и серосодержащие белки. Одна из форм супероксиддисмутазы стафилококков содержит железо в активном центре, и взаимодействие с гипохлоритом ослабляет активность антиоксидантного фермента бактерий 96. Сходной активностью с гипохлоритом в отношении стафилококков обладает и пероксинитрит 97. Пероксинитрит – это продукт взаимодействия супероксида и NO 98. Это сильнейший оксидант, и благодаря отсутствию неспаренных электронов достаточно стабилен. Он эффективно окисляет SH-группы, липиды, ДНК, и белки 99,100,101. Для стафилококков пероксинитрит более токсичен, чем NO и даже гидроксильный радикал 102. Однако повышение оксидантного статуса организма не означает одновременного увеличения сопротивляемости к патогенным бактериям и, в частности, к стафилококкам. Так, при исследовании фагоцитарной активности нейтрофилов больных с генерализованной стафилококковой инфекцией отмечается увеличение продукции кислородных метаболитов при значительном снижении фагоцитарной и бактерицидной активности клеток 103. Кроме того, обнаружено, что грамположительные бактерии, в силу структурных особенностей строения их клеточной стенки не подвержены бактерицидной активности сывороточных факторов 104,105. Это дает возможность бактериям длительно персистировать в организме, в том числе и внутриклеточно. Поиск причин неэффективности защитных радикальных систем, возможно, откроет и пути коррекции этих патологических состояний. По гипотезе Рябиченко Е.В. и соавт., возможно, выброс вне клетки оксидантов задействует все энергетические ресурсы, определяя неполноценность уничтожения и персистенцию инфекционного агента в организме 106. Причины могут лежать и в нарушении направления потоков генерации АФК. Повышенный внеклеточный выброс радикалов не участвует во внутриклеточном киллинге бактерий в фагосомах, а сниженный внутриклеточный пул АФК будет неэффективен. Кроме того, нельзя не учитывать и степень выраженности антиоксидантных свойств бактерий, которые благодаря имеющимся ферментам, инактивируют АФК. Роль антиоксидантной системы макроорганизма при стафилококковой инфекции. Существует устойчивое представление о том, что свободные радикалы в биологических системах представляют исключительную опасность. Однако многие нормальные физиологические процессы нуждаются в участии радикальных интермедиаторов кислорода. Так, чрезвычайно важно участие АФК и NO в процессе обезвреживания экзогенных агентов: бактерий, вирусов, простейших, грибов [107,108]. При стафилококковой инфекции, как при любом антигенном раздражении в макроорганизме также наблюдается всплеск защитных радикальных процессов [109,110]. Однако, если радикалы образуются длительно и в большом количестве параллельно с истощением возможностей антиоксидантной системы, либо происходит одномоментный мощный выброс радикалов в локальных участках клетки или организма, имеющих слабую антиокислительную защиту, то возможно радикальное повреждение клеток и тканей [111,112,113,114]. Несмотря на то, что выброс АФК ограничен небольшой областью, например, при локальных стафилококковых инфекциях, часть реактивных оксидантов неизбежно поступает в окружающие ткани и кровь, вызывая существенные повреждения. Кроме того, любой воспалительный процесс сопровождается повышенным выбросом в кровоток компонентов комплемента, лейкотриенов, цитокинов и других провоспалительных медиаторов [115]. Патогенное действие АФК было бы гораздо более внушительным, если бы в организме не существовало своеобразного противовеса радикальному окислению в виде антиоксидантной системы. Организм справляется с «излишками свободных радикалов» за счет системы естественной антиоксидантной защиты [116,117]. Потеря естественной толерантности может быть обусловлена следующими факторами: во-первых, синергичными взаимоотношениями бактериальных продуктов (эндо- и экзотоксинов и др.), что может привести к еще более выраженному выбросу оксидантов фагоцитами; во-вторых, нарушением взаимоотношений нейтрофилов с тромбоцитами, способными модулировать и прекращать внеклеточный выброс АФК, индуцированный хемоаттрактантами; и, в-третьих, снижением антиоксидантного статуса организма, что определяет резистентность клеток и тканей к поражающему действию АФК. Последствия такой биохимической атаки были бы необратимыми, если бы не действие антиоксидантов. Найден целый класс веществ, препятствующих разрушительному эффекту радикалов. По определению B. Halliwell и J. Guttegidge антиоксидантом является «любая субстанция, присутствующая в незначительной концентрации по сравнению с окисляемым субстратом, значительно сдерживающая или полностью подавляющая окисление данного субстрата» [118]. Все антиоксиданты можно разделить на две группы: ферментные и неферментные. К последним относятся токоферолы, каротиноиды, хиноны, аскорбиновая кислота и металлосвязывающие белки. К ферментным антиоксидантам относятся супероксид дисмутаза (СОД), каталаза, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа. Одним из ключевых ферментных антиоксидантов является СОД [119,120,121,122]. Впервые способность СОД, выделенной из эритроцитов быка, катализировать реакцию дисмутации супероксид аниона была описана МакКордом и Фридовичем [123]. Этот фермент имеет молекулярную массу 32 кД и состоит из 2-х субъединиц, каждая из которых содержит по 1 атому Zn и Cu. Реакция с СОД состоит из двух стадий и заключается в переносе электрона с одного О2-. радикала на другой. Промежуточным акцептором этого электрона служит атом меди, входящий в активный центр СОД. Схематически этот процесс можно представить следующим образом: СОД-Сu2++ О2-.----------->> СОД-Сu++ O2 СОД-Сu++ О2-.----------->> СОД-Сu2++Н2О2 Zn 2+ не участвует в каталитическом цикле, ходя входит в активный центр. Кроме Zn и Cu-СОД были обнаружены и другие виды СОД, содержащие ионы Mn2+ или Fe3+. Время жизни экзогенной СОД, введенной в организм, составляет только 3-4 минуты. Увеличение пребывания фермента в организме достигается путем иммобилизации на полимерном носителе, либо путем заключения его в липосому. Каталаза (КАТ) способна ослабить токсичность, связанную с перекисью водорода, и с производными перекиси. В основе действия каталазы лежит реакция: каталаза 2Н2О2------------>>2 Н2О+ О2 Это наблюдается и в модельных системах, и в суспензиях фагоцитирующих клеток, которые продуцируют Н2О2 и повреждают бактерии, эритроциты, опухолевые клетки. Каталаза представляет собой гемовый фермент, состоящий из четырех субъединиц с общей молекулярной массой около 240 кД [124]. Механизм взаимодействия каталазы с перекисью связан с образованием промежуточных продуктов (соединение-1). Пероксидазы также являются ферментами, разрушающими Н2О2 , при этом окислению подвергается субстрат (АН2): Н2О2+ АН2------------>>2 Н2О+А Пероксидазы различаются по субстратам окисления и строению активного центра. Глутатион-пероксидаза осуществляет следующую реакцию: Н2О2+ 2GSН------------>>2 Н2О+GSSG Глутатион-пероксидаза эритроцитов имеет молекулярную массу 84кД и состоит из четырех субъединиц, каждая из которых содержит атом селена в виде Se-цистеина, то есть аминокислоты цистеина, у которой атом серы замещен на атом селена [125]. Кроме того, существует большой класс гем-содержащих пероксидаз, использующих в качестве субстрата различные доноры атомов водорода – гваякол, бензидин, о-дианизидин. К этому классу ферментов относятся пероксидаза хрена, миелопероксидаза, лактопероксидаза и др. Известно, что само по себе инфицирование макроорганизма стафилококком угнетает активность супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы в эритроцитах, снижая защитный потенциал организма [126]. Гиперпродукция свободных радикалов в острой стадии инфекционного процесса неизбежно должна привести к адаптационному повышению антиоксидантных ферментов и, как результат, увеличению общей антиоксидантной емкости плазмы крови. В последние годы установлена тесная взаимосвязь между многими патологическими состояниями (гипоксией, стрессом, воспалениями, инфарктом миокарда) и процессами усиленного образования радикалов [127,128]. В связи с этим активно изучается состояние основных компонентов антиоксидантной системы у различных категорий больных, отражающее степень окислительного стресса и депрессии защитных механизмов организма. Большое количество экспериментальных и клинических работ свидетельствует, что при различных формах инфекций активность антиоксидантных компонентов может, как повышаться, так и понижаться [129,130,131]. При изучении антирадикальной системы больных перитонитом, в том числе и стафилококковой этиологии, выявлено, что окислительный стресс вызывает разнонаправленные изменения активности антиоксидантных ферментов, что может отражать как степень их адаптации к сдвигам в системе прооксиданты-антиоксиданты, так и показывать характер дисбаланса ее составных частей. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы снижена на 11%, уровень каталазы снижен на 20%, в то время как активность супероксиддисмутазы повышена. Павлюченко И.И. с соавт. объясняет подобные данные проявлением дисбаланса и предлагает приводить уровень ферментов в виде отношения КАТ\СОД. Васильков В.Г. с соавторами обнаружили определенные взаимосвязи между показателями антиоксидантной системы и показателями крови (уровень Hb, альбумина, форменных элементов крови) у больных с хирургическими инфекциями [132]. Следствием нарушения антиоксидантного статуса организма при инфекции может быть снижение транспортной функции альбумина, так как молекула альбумина оказывается загруженной лигандами различной природы, среди которых большую роль играют продукты ПОЛ. Авторы отмечают также, что у пациентов со смертельным исходом (терминальная стадия перитонита) активность каталазы была сниженной. Подобные данные могут служить основой в установлении степени тяжести заболевания и являться прогностическим фактором и определять методы и способы коррекции нарушенных функций. Активно изучается состояние антиоксидантной системы и при критических состояниях, таких как системная воспалительная реакция или сепсис стафилококковой этиологии [133,134]. СОД и КАТ эритроцитов в острую стадию инфекционного процесса повышена более чем в два раза, однако на 3-4 сутки пребывания в стационаре уровень антиоксидантов значительно снижается [135,136,137]. Таким образом, выявление закономерностей изменения содержания антиоксидантных ферментов при инфекционном процессе необходимо для объективной оценки состояния больного и для грамотного и патофизиологически обоснованного назначения антиоксидантов в качестве терапетических средств. Физико-химические характеристики оксида азота и его биосинтез в организме. Оксид азота (NO.) – нетипичная сигнальная молекула. NO. - неорганическое, газообразное соединение со свойствами радикала (.N=O), имеет неспаренный электрон, что придает ему высокую реакционную способность 138,139. Показано, что NO присутствует в клетках и тканях человека и животных 140,141. Радикал NO может реагировать в биологических системах с кислородом, супероксидным анион-радикалом и ионами металлов переходной валентности 142,143. В связи с этим функциональный ответ клетки на действие NO многообразен и в значительной степени зависит не только от фенотипа клетки-мишени, но и от количества NO в клетке и окружающих молекул. Оксид азота хорошо растворим в воде и липидах, незначительные размеры молекулы NO позволяют ей легко и быстро диффундировать через мембраны, не нуждаясь в рецепторах 144. Время жизни не превышает 6-10 секунд, после чего он превращается при участии кислорода и воды в нитраты и нитриты. Оксид азота образуется в результате окисления кислородом гуанидиновой группы L-аргинина при участии фермента NO-синтазы (NOS). Кроме NO в реакции образуется цитруллин. Кислородные атомы как в NO, так и в цитруллине происходят из атмосферного кислорода. В процессе биосинтеза NO участвует 5 электронов. По своему механизму реакция подобна монооксидазной реакции с участием цитохрома Р-450. В ходе реакции образуется промежуточный продукт N-гидрокси-L-аргинин. Для активности NOS необходимы кальцийсвязывающий белок кальмодулин (СаМ), а также коферменты и простетические группы: тетрагидроптерин (BH4), NADP, FMN,FAD и гем. Таким образом, NOS – это биоптерофлавогемопротеин. В молекуле фермента выделяют 2 домена: оксигеназный (гемовый) домен на N-конце и редуктазный домен на С-конце. Редуктазный домен включается в транспорт электронов от NADPH, а в оксигеназном домене находится центр для связывания аргинина и активации кислорода. Между доменами расположен участок для связывания CaM, без которого любая форма фермента неактивна 145,146. Три изоформы NOS очищены, клонированы и охарактеризованы на молекулярном уровне 147,148. Две из них стационарные (конститутивные): нейрональная –nNOS (NOS1) и эндотелиальная – eNOS (NOS3). Необходимо отметить, что любая ткань может содержать более чем одну форму NOS, принимающих участие в образовании NO при различных физиологических состояниях. Конститутивные формы фермента поддерживают низкий стационарный уровень NO, который не превышает нескольких микромолей и необходим для нейротрансмиссии, поддержания электрической активности нервных клеток, что крайне важно для сохранения долговременной памяти; для вазорелаксации, эрекции, секреции гормонов, регуляции почечной гемодинамики 149,150. Индуцибельная форма фермента (iNOS) экспрессируется во многих клетках (макрофаги, нейтрофилы, клетки печени, гладкомышечные клетки) после иммунологических стимулов и при воспалении, например под влиянием медиаторов этих процессов – цитокинов, а также при действии на клетку эндотоксинов 151,152. По данным Маеда Х. и Акаике Т. существует два основных механизма индукции и активации iNOS: 1)действие липополисахаридов и тейхоевых кислот грамположительных и грамотрицательных бактерий и 2) действие брадикинина, который часто образуется при бактериальных инфекциях 153. При участии iNOS высвобождается большое количество NO. Стационарный уровень NO в этих тканях достигает сотней микромолей и поддерживается в течении от нескольких часов до нескольких дней в зависимости от длительности стимула. Оксид азота диффундирует через мембраны, и действуя на близлежащие клетки-мишени, усиливает апоптоз, убивает патогенные бактерии и координирует Т-клеточный иммунный ответ. Молекулярные основы действия оксида азота |
Похожие:
 | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |  | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Санкт-петербургский государственный электротехнический университет «лэти» им. В. И. Ульянова (ленина) |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования |
