Автореферат диссертации на соискание ученой степени
Скачать 421.26 Kb.
|
На правах рукописи МУРУГИН ВЛАДИМИР ВЛАДИМИРОВИЧКОМПЛЕКС МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ NK-КЛЕТОК В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ 03.03.03 – иммунология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва, 2012 г. Работа выполнена в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.
Защита состоится 24 октября 2012 г. в 14 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций - Д 208.017.01 в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России по адресу: 115478, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, корп. 2. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России. Автореферат разослан 20 сентября 2012 г. Ученый секретарь Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций доктор медицинских наук Сеславина Лия Сергеевна ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность. NK-клетки являются важной составляющей иммунной системы; они играют важнейшую роль в противовирусном и противоопухолевом иммунитете. Нарушения функционирования NK-клеток лежат в основе патогенеза многих первичных и вторичных иммунодефицитов. Поэтому выявление функциональных дефектов NK-клеток позволит более детально оценить их вклад в патогенез этих заболеваний. В настоящее время в лабораторной практике широко применяется только один стандартный метод оценки функциональной активности NK-клеток - тест на NK-активность фракции мононуклеарных клеток (МНК) по киллингу MHC-I-негативных клеток-мишеней. В то же время NK-активность определяется целым рядом параметров: процентным содержанием NK-клеток среди МНК, содержанием в литических гранулах NK-клеток перфорина и гранзимов, способность NK-клеток дегранулировать (т.е. высвобождать перфорин и гранзимы из гранул). Все эти параметры могут быть связаны с патогенезом заболеваний и имеют большую клиническую значимость. В связи с этим разработка комплекса методов исследования NK-клеток, позволяющего оценить все эти параметры, является чрезвычайно актуальной задачей. Методологической основой данного комплекса методов является проточная цитометрия. Применение этого комплекса для обследования пациентов с первичными иммунодефицитами и инфекционными заболеваниями может быть использовано для совершенствования схем диагностики и лечения. Цель работы. Разработка и применение комплекса методов исследования NK-клеток у здоровых лиц, при вирусных инфекциях и первичных иммунодефицитах. Задачи
Научная новизна. NK-клетки играют важную роль в защите от вирусных инфекций и злокачественных опухолей, а также в патогенезе ряда первичных и вторичных иммунодефицитов. Однако адекватная оценка функции NK-клеток в клинических условиях затруднена из-за отсутствия необходимой методологической базы. Научная значимость данной работы состоит в том, что впервые разработан и результативно применен методологический подход, позволяющий комплексно оценить ключевые функциональные параметры NK-клеток. Это позволило уточнить вклад NK-клеток в патогенез некоторых первичных и вторичных иммунодефицитов. Получен ряд обладающих новизной результатов. Так, впервые прямо показан дефект дегрануляции NK-клеток у детей с первичным иммунодефицитом - синдромом Вискотта-Олдрича, что сопровождается снижением NK-активности при нормальном внутриклеточном содержании CD107a и перфорина в NK-клетках. Впервые показано отсутствие значимых нарушений дегрануляции NK-клеток и NK-активности у детей с хронической гранулематозной болезнью. Также впервые обнаружен дефект дегрануляции NK-клеток у больных с часто рецидивирующим герпесом, наблюдающийся независимо от стадии заболевания (обострение или ремиссия). Впервые обнаружено снижение дегрануляции NK-клеток у лиц пожилого возраста по сравнению с молодыми донорами. Нарушение дегрануляции NK-клеток у пожилых лиц не сопровождается снижением NK-активности и внутриклеточного содержания CD107a в NK-клетках. Кроме того, в работе впервые показано, что CD107a является более чувствительным и специфичным маркером дегрануляции, чем CD63. Подтверждено, что CD107a является адекватным маркером дегрануляции NK-клеток. Разработанный комплекс методов позволяет принимать более обдуманные решения по диагностике и тактике лечения первичных и вторичных иммунодефицитов, сопровождающихся нарушением функции NK-клеток. Результаты, полученные с помощью этого комплекса методов, дают возможность предположить локализацию генетического дефекта у пациентов с первичными иммунодефицитами и, таким образом, определить направление генотипирования. При вторичных иммунодефицитах результаты комплексного исследования NK-клеток могут учитываться при выборе терапии, направленной на коррекцию функциональных нарушений NK-клеток. Практическая значимость. В работе подтверждено, что разработанный комплекс методов обладает клинической значимостью в оценке функции NK-клеток при первичных иммунодефицитах и вирусных инфекциях. Методы, входящие в комплекс, дают возможность установить причину нарушения функции NK-клеток (снижение процентного содержания NK-клеток среди мононуклеаров, снижение способности NK-клеток к дегрануляции, снижение экспрессии цитотоксических белков NK-клетками). В зависимости от результатов исследования может проводиться целенаправленная диагностика, а также лечение, направленное на коррекцию выявленных нарушений. Разработанный комплекс методов исследования NK-клеток может применяться в лабораториях клинической иммунологии для выявления функциональных дефектов в системе NK-клеток при первичных и вторичных иммунодефицитах. Кроме того, методологическая база, примененная в данной работе, может служить основой для дальнейшего расширения комплекса методов исследования NK-клеток, в который может быть включено исследование экспрессии цитокинов при активации NK-клеток, а также исследование более широкого спектра цитотоксических белков. Результаты диссертационной работы легли в основу методического пособия по оценке клеточного иммунитета. Полученные данные могут быть использованы в образовательном процессе для студентов медицинских ВУЗов, в учебных программах повышения квалификации в системе последипломного образования. Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ. Материалы исследований были представлены на X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009) и XI Международном конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2011). Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 134 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, описания результатов исследований, их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 230 источников, и приложения. Работа содержит 36 таблиц и 19 рисунков. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯХарактеристика обследованных групп. Возраст всех групп ниже представлен как медиана [10—90 процентили]. 1. Группа пациентов с синдромом Вискотта-Олдрича — 15 мальчиков в возрасте 4 [1—14] лет, наблюдающихся в отделении иммунопатологии Детской городской клинической больницы №9 им. Г.Н.Сперанского г.Москвы (зав. отделением — профессор, д.м.н. А.П.Продеус). 8 пациентов на момент исследования получали иммуносупрессивную терапию. 2. Группа пациентов с хронической гранулематозной болезнью - 9 мальчиков в возрасте 9 [4—14] лет, наблюдавшихся в отделении клинической иммунологии Республиканской детской клинической больницы (зав. отделением — профессор, д.м.н. И.В.Кондратенко). 7 больных на момент исследования получали массивную антимикробную терапию. 3. Группа пациентов с часто рецидивирующим герпесом - 34 человека в возрасте 33 [24—50] лет, из них 11 мужчин и 23 женщины, наблюдавшихся в отделении аллергологии и иммунотерапии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России (зав. отделением — профессор, д.м.н. А.Е.Шульженко). Большинство пациентов с ЧРГ имели генитальную локализацию высыпаний с частотой обострений от 2 до 6 в год. Подгруппа из 24 пациентов была исследована в динамике: в ходе обострения и во время ремиссии. Остальные 10 человек были исследованы только в обострении. 4. Три группы здоровых доноров, давших добровольное согласие на участие в исследовании:
Исследование дегрануляции NK-клеток. Дегрануляцию NK-клеток оценивали методом проточной цитометрии по экстернализации маркера CD107a после стимуляции in vitro. Использовали методику Alter et al. (2004) с модификациями. МНК выделяли из венозной крови на градиенте плотности фиколл-урографина, отмывали средой 199 (оба реагента ПанЭко, Россия) и ресуспендировали в полной культуральной среде (ПКС), которая представляла собой RPMI-1640 (Панэко) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (РАА, Австрия) и 2 мМ L-глутамина (Sigma, США). В 96-луночные круглодонные планшеты вносили: моненсин (Sigma; конечная концентрация 10 мкМ), FITC-меченные антитела к CD107a (клон H4A3, BD Pharmingen, США; конечное разведение 1/200) и МНК (5×105 клеток на лунку). В качестве индукторов дегрануляции NK-клеток использовали рецептор-зависимый стимул — клетки K562 (5×105 клеток на лунку, соотношение эффектор:мишень = 1:1), а также рецептор-независимый стимул — форбол-12-миристат-13-ацетат + иономицин (ФМА+ИОН; конечные концентрации 100 нг/мл и 0,5 мкг/мл соответственно; оба Sigma). Максимальную дегрануляцию индуцировали ФМА+ИОН в комбинации с цитохалазином Б (ЦБ, Sigma, конечная концентрация 5 мкг/мл). В лунку отрицательного контроля вместо индукторов дегрануляции добавляли равный объем ПКС. Для контроля окраски на CD107a в еще одну контрольную лунку не добавляли антитела к CD107a. Циклогексимид (ЦГ, Sigma, конечная концентрация 10 мкг/мл) добавляли к МНК за 15 мин до добавления индукторов дегрануляции. После добавления всех ингредиентов содержимое лунок однократно перемешивали, после чего планшет центрифугировали для осаждения клеток и инкубировали 4 ч в СО2-инкубаторе (5% СО2, 37°С). Затем планшет еще раз центрифугировали, отбирали супернатант и ресуспендировали клетки в фосфатно-солевом буфере (ФСБ, Панэко) с 0,02% азидом натрия и 0,02% ЭДТА для диссоциации клеточных агрегатов (5 мин, КТ). Затем клетки отмывали в ФСБ с 0,5% бычьим сывороточным альбумином (БСА, Панэко) и окрашивали PC5-меченными антителами к CD3 и PE-меченными антителами к CD56 (Beckman Coulter, США) для идентификации NK-клеток. Образцы анализировали на проточном цитометре Cytomics FC500 с программным обеспечением CXP (все Beckman Coulter). NK-клетки идентифицировали как CD3–CD56+ лимфоциты. Рассчитывали процент CD107a+ NK-клеток по отношению ко всем NK-клеткам и ко всем МНК. При исследовании фенотипа дегранулирующих NK-клеток докрашивание клеток после инкубации проводили PC5-меченными моноклональными антителами (МАТ) к CD3, PC7-меченными МАТ к CD56 и одним из следующих МАТ, меченных PE: CD8, CD57, CD94, CD159a, CD335 (все Beckman Coulter). При оценке CD63 в качестве маркера дегрануляции использовали PE-меченные МАТ к CD63 вместе с FITC-меченными МАТ к CD107a. После инкубации клетки докрашивали PC5-меченными МАТ к CD3 и PC7-меченными МАТ к CD56. Исследование NK-активности. NK-активность МНК исследовали методом проточной цитометрии по киллингу клеток-мишеней K562, меченных CFSE (5-,6-карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинимидиловый эфир, Molecular Probes, США). Для мечения клетки K562 (107/мл в ФСБ) инкубировали с CFSE (0,6 мкМ) в течение 10 мин в темноте при 37°C, после чего отмывали, ресуспендировали в ПКС и добавляли в 96-луночный круглодонный планшет по 8×103 клеток на лунку. МНК добавляли к клеткам-мишеням так, чтобы соотношение эффектор:мишень (Э:М) составило 50:1, 25:1, 12,5:1, 6,25:1 и 3,125:1. Для контроля спонтанной гибели клеток-мишеней использовали лунки, куда вместо МНК добавляли ПКС. Планшет центрифугировали для осаждения клеток и инкубировали 4 ч в СО2-инкубаторе. Затем клетки ресуспендировали и окрашивали пропидий-йодидом (PI, Sigma, конечная концентрация 1 мкг/мл, 10 мин при КТ в темноте). Пробы анализировали на проточном цитометре Cytomics FC500; определяли процент погибших мишеней (PI++CFSE+ событий) по отношению ко всем CFSE+ событиям. Процент киллинга рассчитывали по формуле: % погибших мишеней в опыте – % спонтанной гибели % киллинга = ————————————————————————×100%. 100% – % спонтанной гибели Литическая единица-20 (ЛЕ20) — это количество МНК, необходимое для киллинга 20% мишеней K562. Количество ЛЕ20 на 105 МНК рассчитывали по формуле: 105 ЛЕ20 на 105 МНК = —————————, 8×103×Э:М20 где 8×103 — количество мишеней на лунку; Э:М20 — соотношение Э:М, при котором киллинг составил бы 20%. Если 20%-ный киллинг не достигался при Э:М=50:1, то количество ЛЕ20 на 105 МНК приравнивали к 0. Внутриклеточная окраска на CD107a и перфорин. Свежевыделенные МНК ресуспендировали в ФСБ c 0,5% БСА и окрашивали PC5-меченными МАТ к CD3 (1/50) и PE-меченными МАТ к CD56 (1/50). Затем клетки отмывали в ФСБ и фиксировали 4% параформальдегидом на ФСБ (15 мин., 4°C), после чего пермеабилизировали с помощью 0,1% сапонина на ФСБ с 0,5% БСА и окрашивали внутриклеточно антителами к CD107a и перфорину (разведение антител 1/100). В каждом опыте делали изотип-контроль внутриклеточной окраски, используя иммуноглобулины того же изотипа и метки, что и специфические антитела. Клетки анализировали на проточном цитометре Cytomics FC500. Экспрессию внутриклеточных молекул представляли как средняя интенсивность флуоресценции (СИФ) клеток при окраске специфическими антителами минус СИФ при окраске изотип-контролем. Сочетанный анализ дегрануляции и внутриклеточной экспрессии перфорина и гранзима A. Чтобы оценить остаточные уровни перфорина и гранзима A в NK-клетках после дегрануляции, реакцию дегрануляции ставили с FITC-меченными МАТ к CD107a, докрашивали клетки PC5-меченными МАТ к CD3 и PC7-меченными МАТ к CD56, после чего фиксировали и пермеабилизировали. Внутриклеточную окраску проводили с помощью PE-меченных МАТ к гранзиму A и перфорину (оба 1/50). Клетки отмывали и анализировали на цитометре Cytomics FC500 как описано выше. Статистическая обработка результатов. Использовали программы GraphPad Instat 3.06 и Statsoft Statistica 6.0. Все данные представляли как медиана (10-й — 90-й процентиль). Если в группе было менее 10 измерений, то вместо 10-го и 90-го процентилей указывали минимум и максимум группы. Две группы сравнивали при помощи U-теста Манна-Уитни. Три группы сравнивали с помощью теста Крускала-Уоллиса; при получении в этом тесте значения p<0,05 проводили попарное сравнение групп с помощью U-теста Манна-Уитни. Парные измерения сравнивали с помощью теста Уилкоксона. Корреляции оценивали с помощью критерия Пирсона. Различия и корреляции считали достоверными при p<0,05. Корреляции считали слабыми при |r|<0,4, средней силы — при |r|=0,4÷0,7, сильными — при |r|>0,7. | ||||||||||||||||||||
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | Е. Б. Особенности гражданско-правового регулирования договора патентной... Абдакимова, Д. А. Источники международного права интеллектуальной собственности : автореферат диссертации на соискание ученой степени... | | Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата филологических наук. Саратов, 1974 Котюрова М. П. Лингвистическое выражение связности речи в научном стиле (сравнительно с художественным) : Автореферат диссертации... |
| Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных... Ведущая организация – фгоу впо кемеровский государственный сельскохозяйственный институт |  | А. Г. Свинаренко Котюрова М. П. Лингвистическое выражение связности речи в научном стиле (сравнительно с художественным) : Автореферат диссертации... |
| Тема доклада Котюрова М. П. Лингвистическое выражение связности речи в научном стиле (сравнительно с художественным) : Автореферат диссертации... | | Литература Автореферат диссертации на соискание ученой степени ... |
| 14. 01. 17 – Хирургия автореферат диссертации на соискание ученой... «Средняя общеобразовательная школа №19 с углубленным изучением отдельных предметов» | | Автореферат Диссертации На соискание ученой степени кандидата психологических наук по теме Оборудование: изображения гербов на листах, кроссворд, выставка литературы, энциклопедия, таблички, учебник по истории Саплина Е.... |
| Аннотации рабочих программ дисциплин Котюрова М. П. Лингвистическое выражение связности речи в научном стиле (сравнительно с художественным) : Автореферат диссертации... | | Учебник: Русский язык. 9 класс Котюрова М. П. Лингвистическое выражение связности речи в научном стиле (сравнительно с художественным) : Автореферат диссертации... |
| Тема урока Кол-во часов Котюрова М. П. Лингвистическое выражение связности речи в научном стиле (сравнительно с художественным) : Автореферат диссертации... | | Клинико-экспериментальное исследование 14. 00. 35 – детская хирургия... «Средняя общеобразовательная школа №19 с углубленным изучением отдельных предметов» |
| 14. 01. 17 – хирургия автореферат диссертации на соискание ученой... «Новоубеевская основная общеобразовательная школа» Дрожжановского муниципального района Республики Татарстан | | К общим закономерностям диффузии стилей вводные замечания Котюрова М. П. Лингвистическое выражение связности речи в научном стиле (сравнительно с художественным) : Автореферат диссертации... |
| Иностранный язык (английский, немецкий, французский языки) Котюрова М. П. Лингвистическое выражение связности речи в научном стиле (сравнительно с художественным) : Автореферат диссертации... | | Из фонда Национальной библиотеки Беларуси Абдакимова, Д. А. Источники международного права интеллектуальной собственности : автореферат диссертации на соискание ученой степени... |
