Скачать 421.26 Kb.
|
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕВалидация CD107a как маркера дегрануляции NK-клеток. NK-клетки экстернализируют CD107a при активации (Alter et al., 2004). Хотя роль CD107a как маркера дегрануляции была всесторонне изучена для CD8+ Т-клеток (Betts et al, 2003), для NK-клеток аналогичная работа не была проведена. Появление CD107a на поверхности NK-клеток может быть как результатом дегрануляции (т.е. внутриклеточного перераспределения уже имеющегося CD107a), так и следствием синтеза de novo (т.е. процесса, не связанного с дегрануляцией). Однако ЦГ (ингибитор синтеза белка) не влиял на экстернализацию CD107a, вызванную К562 и ФМА+ИОН+ЦБ (таблица 1), что исключает появление CD107a на поверхности в результате синтеза de novo. Таблица 1. Процент NK-клеток, экстернализирующих CD107a при 4-часовой инкубации с указанными активаторами и ЦГ. Показаны медианы (минимум—максимум).
Если CD107a является маркером дегрануляции, то его появление на поверхности NK-клетки должно сопровождаться падением внутриклеточного содержания белков цитотоксических гранул, в частности гранзима А. Однако Tomescu et al. (2009) сообщили об одинаковом содержании перфорина и гранзимов в CD107a+ и CD107a– NK-клетках после дегрануляции. Для изучения этого вопроса исследовали внутриклеточный уровень гранзима A (СИФ) в NK-клетках, стимулированных К562 или ФМА+ИОН+ЦБ (рис. 1). При инкубации с клетками K562 уровень гранзима A в NK-клетках, не экстернализирующих CD107a (CD107aneg) существенно не менялся по сравнению с неактивированными NK-клетками, тогда как в NK-клетках с высокой экстернализацией CD107a (CD107ahigh) снижался более чем в 2 раза. При активации ФМА+ИОН+ЦБ уровень гранзима A в CD107aneg NK-клетках даже несколько возрастал, тогда как в CD107aint (экстернализирующих промежуточные уровни CD107a) и в CD107ahigh NK-клетках он был, соответственно, в 2 и 4 раза ниже, чем в CD107aneg. Таким образом, чем выше экстернализация CD107a, тем меньше остаточное содержание гранзима A в NK-клетках, что подтверждает роль CD107a как маркера дегрануляции. Рисунок 1. Экстернализация CD107a и внутриклеточное содержание гранзима A в CD3–CD56+ NK-клетках здорового донора после 4-часовой инкубации без активаторов, с клетками К562 (1:1) или с ФМА+ИОН+ЦБ. Регионами на графиках выделены клетки, не экспрессирующие поверхностный CD107a (neg, от negative), экспрессирующие промежуточные (int, от intermediate) и высокие (high) уровни СD107a. Цифры на графиках — СИФ гранзима A в соответствующих регионах. Аналогичные данные были получены и для внутриклеточного содержания перфорина. Киллинг MHC-I-негативных мишеней, таких, как клетки K562, осуществляют только NK-клетки. Действительно, при инкубации МНК с клетками K562 только NK-клетки (СD3–CD56+) экстернализировали CD107a; СD3+CD56+ Т-клетки отвечали слабо, а СD3+CD56– Т-клетки не отвечали вовсе (таблица 2). Таблица 2. Экстернализация CD107a различными субпопуляциями лимфоцитов здоровых доноров (до 50 лет) при 4-часовой инкубации. Показаны медианы, в скобках — 10-й и 90-й процентили. N=40.
Учитывая вышеизложенное, была проанализирована связь между экстернализацией CD107a NK-клетками и NK-активностью МНК. Была выявлена корреляция между процентом NK-клеток, экстернализирующих CD107a, и NK-активностью у здоровых доноров (таблица 3). Коэффициент корреляции был выше, если процент CD107a-экстернализирующих NK-клеток выражали по отношению ко всем МНК (r=0,72, p<0,001), а не по отношению к NK-клеткам (r=0,42, p<0,05). Это легко объяснимо тем обстоятельством, что для оценки NK-активности использовались МНК, а не изолированная популяция NK-клеток. Была выявлена также тривиальная связь между NK-активностью и процентом NK-клеток среди МНК (r=0,64, p<0,001), однако эта корреляция была слабее, чем корреляция между NK-активностью и процентом CD107a-экстернализирующих NK-клеток (выраженным по отношению ко всем МНК). NK-активность не коррелировала с СИФ CD107a на CD107a+ NK-клетках и c внутриклеточным содержанием CD107a и перфорина в NK-клетках до дегрануляции. В совокупности, приведенные данные подтверждают, что CD107a является информативным маркером дегрануляции NK-клеток. Таблица 3. Коэффициенты корреляции (r) между NK-активностью МНК и указанными параметрами NK-клеток у здоровых доноров.
*p < 0,05, ***р< 0,001 CD63 как маркер дегрануляции NK-клеток. Сравнивали кинетику появления CD107a и CD63 на поверхности NK-клеток в ходе инкубации. Оказалось, что при стимуляции клетками К562 маркер CD107a раньше появляется на мембране NK-клеток, чем CD63. Так, в течение первых 15 минут инкубации с К562 экстернализация CD107a и CD63 наблюдается, соответственно, на 3,8 (2,6-9,8)% и 0,7 (0,5-1,2)% NK-клеток, в течение первых 30 минут — на 4,3 (3,3-10,5)% и 1,8 (0,5-3,7)%. При более длительной инкубации (2 и 4 ч) процент NK-клеток, экстернализировавших СD63, становится незначительно выше, чем процент экстернализировавших CD107a. При стимуляции ФМА+ИОН+ЦБ процент NK-клеток, экстернализировавших CD107a, был минимум в 1,5 раза выше, чем процент CD63+ клеток, во все сроки инкубации. При инкубации без индукторов дегрануляции экстернализация CD107a наблюдалась менее чем на 1% NK-клеток. Однако экстернализация CD63 в этих условиях постепенно нарастала и к 4 ч составляла 2,6 (1,3-7,4) %. Учитывая более высокую спонтанную экстернализацию CD63 и менее выраженную индуцированную, особенно при активации ФМА+ИОН+ЦБ, а также относительно позднее появление CD63 на поверхности NK-клеток, CD63 является менее чувствительным и менее специфичным маркером дегрануляции NK-клеток, чем CD107a. Показатели функционального состояния NK-клеток у лиц пожилого возраста. У пожилых лиц (65 лет и старше) по сравнению с молодыми (40 лет и моложе) было резко снижено процентное содержание NK-клеток, дегранулирующих в ответ как на рецепторный стимул (клетки К562), так и на нерецепторные стимулы — ФМА+ИОН и ФМА+ИОН+ЦБ, причем указанные межвозрастные различия наблюдались как у мужчин, так и у женщин (таблица 4). Внутриклеточная экспрессия CD107a в NK-клетках у пожилых не была снижена, что исключает роль этого фактора в снижении экстернализации CD107a. Таблица 4. Процент NK-клеток, дегранулирующих в ходе инкубации с указанными активаторами (по отношению ко всем NK-клеткам). Показаны медианы, в скобках — 10-й—90-й процентили.
*p < 0,05, **p < 0,01, ***р <0,001 при сравнении с соответствующей подгруппой молодых доноров (тест Манна-Уитни). Несмотря на сниженную дегрануляцию NK-клеток, показатели NK-активности МНК в двух возрастных группах практически не различались (таблица 5). Нормальная NK-активность при сниженной дегрануляции у пожилых не объяснялась повышенным содержанием NK-клеток среди МНК: у пожилых доноров процент NK-клеток составил 8,0 (2,9—15,4)% от всех МНК, у молодых — 9,0 (5,1—16,8)% (p = 0,41). Таблица 5. NK-активность МНК у пожилых и молодых доноров. Даны проценты киллинга мишеней K562 для различных соотношений Э:М, а также количество ЛЕ20 на 105 МНК (медианы, в скобках — 10-й—90-й процентили).
Также у пожилых лиц, по сравнению с молодыми, была нарушена корреляция между дегрануляцией NK-клеток и показателями NK-активности, при сохранной корреляции между процентом NK-клеток среди МНК и NK-активностью (таблица 6). В целом, данные позволяют предположить, что хотя киллинг клеток K562 и у молодых, и у пожилых осуществляется NK-клетками, киллерная активность NK-клеток у пожилых в меньшей степени зависит от дегрануляции. Таблица 6. Коэффициенты корреляции между указанными параметрами NK-клеток в исследованных группах.
*p < 0,05, **р< 0,01, ***p < 0,001. |
Е. Б. Особенности гражданско-правового регулирования договора патентной... Абдакимова, Д. А. Источники международного права интеллектуальной собственности : автореферат диссертации на соискание ученой степени... | Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата филологических наук. Саратов, 1974 Котюрова М. П. Лингвистическое выражение связности речи в научном стиле (сравнительно с художественным) : Автореферат диссертации... | ||
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных... Ведущая организация – фгоу впо кемеровский государственный сельскохозяйственный институт | А. Г. Свинаренко Котюрова М. П. Лингвистическое выражение связности речи в научном стиле (сравнительно с художественным) : Автореферат диссертации... | ||
Тема доклада Котюрова М. П. Лингвистическое выражение связности речи в научном стиле (сравнительно с художественным) : Автореферат диссертации... | Литература Автореферат диссертации на соискание ученой степени ... | ||
14. 01. 17 – Хирургия автореферат диссертации на соискание ученой... «Средняя общеобразовательная школа №19 с углубленным изучением отдельных предметов» | Автореферат Диссертации На соискание ученой степени кандидата психологических наук по теме Оборудование: изображения гербов на листах, кроссворд, выставка литературы, энциклопедия, таблички, учебник по истории Саплина Е.... | ||
Аннотации рабочих программ дисциплин Котюрова М. П. Лингвистическое выражение связности речи в научном стиле (сравнительно с художественным) : Автореферат диссертации... | Учебник: Русский язык. 9 класс Котюрова М. П. Лингвистическое выражение связности речи в научном стиле (сравнительно с художественным) : Автореферат диссертации... | ||
Тема урока Кол-во часов Котюрова М. П. Лингвистическое выражение связности речи в научном стиле (сравнительно с художественным) : Автореферат диссертации... | Клинико-экспериментальное исследование 14. 00. 35 – детская хирургия... «Средняя общеобразовательная школа №19 с углубленным изучением отдельных предметов» | ||
14. 01. 17 – хирургия автореферат диссертации на соискание ученой... «Новоубеевская основная общеобразовательная школа» Дрожжановского муниципального района Республики Татарстан | К общим закономерностям диффузии стилей вводные замечания Котюрова М. П. Лингвистическое выражение связности речи в научном стиле (сравнительно с художественным) : Автореферат диссертации... | ||
Иностранный язык (английский, немецкий, французский языки) Котюрова М. П. Лингвистическое выражение связности речи в научном стиле (сравнительно с художественным) : Автореферат диссертации... | Из фонда Национальной библиотеки Беларуси Абдакимова, Д. А. Источники международного права интеллектуальной собственности : автореферат диссертации на соискание ученой степени... |