Показатели функционального состояния NK-клеток при СВО. У больных СВО, по сравнению со здоровыми донорами, была резко снижена доля NK-клеток, дегранулирующих в ответ на стимуляцию клетками K562 (почти до значений спонтанной дегрануляции) (рис. 2, таблица 7). Ответ на нерецепторную стимуляцию (ФМА+ИОН, ФМА+ИОН+ЦБ) был снижен менее значительно. Снижение дегрануляции у больных СВО не зависело от проводимой на момент исследования иммуносупрессивной терапии. Внутриклеточное содержание CD107a и перфорина — маркеров литических гранул — укладывались в диапазон значений донорской группы. Следовательно, снижение экстернализации CD107a NK-клетками при СВО обусловлено не снижением исходного содержания CD107a и/или литических гранул, а нарушением дегрануляции. В соответствии с резко сниженной дегрануляцией, NK-активность МНК у больных СВО была резко снижена (% киллинга мишеней, количество ЛЕ20 на 105 МНК) (таблица 8). Корреляции между NK-активностью МНК и показателями дегрануляции NK-клеток, имеющиеся в группе доноров, в группе больных СВО полностью отсутствовали (таблица 9). Процентное содержание всех NK-клеток среди МНК у больных СВО составило 5,3 (1,1–22,2)%, что было ниже, чем у доноров (9,4 (5,2–19,1)%), однако из-за большого разброса значений в группе СВО различие не было достоверным.
Таким образом, при СВО снижена дегрануляция NK-клеток преимущественно в ответ на рецепторный стимул (K562), что сопровождается резким снижением NK-активности. Это говорит о том, что при СВО нарушено в первую очередь образование иммунологического синапса, тогда как механизмы, отвечающие за перемещения гранул в NK-клетках, относительно сохранны.
Таблица 7. Процент NK-клеток, дегранулирующих в ходе инкубации с указанными активаторами, по отношению ко всем NK-клеткам. Показаны медианы, в скобках — 10-й и 90-й процентили.
Группа
|
Без активаторов
|
К562
|
ФМА+ИОН
|
ФМА+ИОН+ЦБ
|
Доноры
(n=28)
|
0,5
(0,2–0,9)
|
14,1
(7,1–24,1)
|
11,6
(5,1–23,5)
|
65,8
(15,3–88,6)
|
СВО
(n=15)
|
0,6
(0,1–1,0)
|
1,6
(1,1–3,4)***
|
5,8
(0,5–10,1)*
|
32,6
(5,7–64,6)**
|
ХГБ
(n=9)
|
0,7
(0,2–1,2)
|
9,7
(3,8–15,7)
|
24,6
(13,7–32,3)
|
46,0
(11,5–59,4)*
|
*р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001 при сравнении с соответствующим показателем в группе здоровых доноров (тест Манна-Уитни).
Таблица 8. NK-активность МНК больных СВО и ХГБ по сравнению со здоровыми донорами. Показаны медианы, в скобках — 10-й и 90-й процентили.
Группа
|
% киллинга мишеней при данном соотношении Э:М
|
ЛЕ20
на 105 МНК
|
3,125:1
|
6,25:1
|
12,5:1
|
25:1
|
50:1
|
Доноры
|
6,2
(2,1–12,4)
|
10,9
(4,9–23,9)
|
19,8
(11,6–49,6)
|
33,2
(16,9–66,0)
|
46,5
(26,5–74,1)
|
1,0
(0,3-2,3)
|
СВО
|
8,4
(0,0–17,4)
|
5,7
(0,0–10,2)**
|
7,2
(0,0–14,5)**
|
5,5
(0,2–17,5)***
|
5,6
(0,0–27,7)***
|
0,0
(0-0,3)***
|
ХГБ
|
7,4
(1,4–17,7)
|
6,5
(0,9–25,4)
|
13,9
(4,6–39,2)
|
23,3
(11,7–46,5)
|
36,6
(19,3–63,9)
|
0,7
(0,2-2,5)
|
*р<0,05; **р<0,01; ***р<0,001 при сравнении с соответствующим показателем в группе здоровых доноров (тест Манна-Уитни).
Таблица 9. Коэффициенты корреляции между указанными параметрами NK-клеток в исследованных группах.
Параметр 1
|
Параметр 2
(NK-активность)
|
Группы
|
|
Доноры
|
СВО
|
ХГБ
|
% NK-клеток среди МНК
|
% киллинга мишеней
при Э:М = 50:1
|
0,57*
|
–0,12
|
0,47
|
ЛЕ20 на 105 МНК
|
0,84***
|
–0,13
|
0,38
|
% NK-клеток, дегранул. в ответ на K562,
по отношению к NK-клеткам
|
% киллинга мишеней
при Э:М = 50:1
|
0,51*
|
0,2
|
0,51
|
ЛЕ20 на 105 МНК
|
0,37
|
–0,1
|
0,29
|
% NK-клеток, дегранул. в ответ на K562,
по отношению ко всем МНК
|
% киллинга мишеней
при Э:М = 50:1
|
0,72**
|
–0,1
|
0,82**
|
ЛЕ20 на 105 МНК
|
0,79***
|
–0,11
|
0,6
|
* p < 0,05, **р< 0,01, ***p < 0,001.
Показатели функционального состояния NK-клеток при ХГБ. В отличие пациентов с СВО, у пациентов с ХГБ проценты дегранулирующих NK-клеток, рассчитанные по отношению ко всем NK-клеткам, при стимуляции K562 достоверно не отличались от показателей здоровых доноров (таблица 7, рис. 2). При стимуляции ФМА+ИОН имелась тенденция к повышенной дегрануляции, тогда как при стимуляции ФМА+ИОН+ЦБ ответ был ниже, чем у здоровых доноров. Дегрануляция в ответ на все виды стимуляции не зависела от получения больными ХГБ антимикробной терапии. Процентное содержание NK-клеток среди МНК при ХГБ составило 5,4 (2,3–9,7)%, что было достоверно ниже, чем у здоровых доноров (9,4 (5,2–19,1)%; p < 0,05). NK-активность у больных ХГБ была несколько ниже, чем у доноров, однако достоверных отличий от донорской группы выявлено не было (таблица 8).
Рисунок 2. Экстернализация CD107a NK-клетками здорового донора (верхний ряд), больного СВО (средний ряд) и больного ХГБ (нижний ряд) при 4-часовой инкубации МНК в отсутствии активаторов, с клетками К562 (1:1), с ФМА+ИОН и ФМА+ИОН+ЦБ. Показаны только CD3–CD56+ NK-клетки. Цифры на графиках — проценты NK-клеток, экстернализировавших CD107a, по отношению ко всем NK-клеткам.
Корреляции между дегрануляцией NK-клеток и NK-активностью у пациентов с ХГБ были сохранены (таблица 9). Таким образом, нарушений дегрануляции NK-клеток при ХГБ выявлено не было.
Показатели функционального состояния NK-клеток при ЧРГ. У пациентов с ЧРГ и в стадии обострения, и в стадии ремиссии наблюдалось умеренное снижение процентов NK-клеток, дегранулирующих в ответ как на рецепторный стимул (K562), так и на нерецепторные стимулы (ФМА+ИОН и ФМА+ИОН+ЦБ) (таблица 10). При парном сравнении показателей дегрануляции, полученных у одних и тех же пациентов в динамике (в обострении и в ремиссии), достоверных различий выявлено не было.
Таблица 10. Проценты NK-клеток, дегранулирующих при инкубации с указанными активаторами, по отношению ко всем NK-клеткам. Показаны медианы, в скобках — 10-й—90-й процентили.
Группа
|
Без
активаторов
|
К562
|
ФМА+ИОН
|
ФМА+ИОН+ЦБ
|
Доноры
(n=40)
|
0,4
(0,1–0,8)
|
11,2
(5,1–21,8)
|
11,8
(5,2–23,9)
|
66,8
(32,5–88,5)
|
ЧРГ, обострение
(n=33)
|
0,5
(0,1–1,2)
|
7,7
(3,0–15,7)*
|
4,3
(1,3–12,5)***
|
49,4
(16,9–68,0)**
|
ЧРГ, ремиссия
(n=24)
|
0,3
(0,1–0,7)
|
8,2
(4,8–14,5)*
|
5,5
(1,7–11,0)***
|
39,1
(25,4–68,6)**
|
*p < 0,05, **p < 0,01, ***р< 0,001 при сравнении с соответствующим показателем в группе здоровых доноров (тест Манна-Уитни).
Таблица 11. NK-активность МНК у больных ЧРГ и доноров. Показаны медианы, в скобках - 10-й—90-й процентили.
Группа
|
% киллинга мишеней при данном Э:М
|
Кол-во ЛЕ20
на 105 МНК
|
3,125:1
|
6,25:1
|
12,5:1
|
25:1
|
50:1
|
Доноры
(n=51)
|
4,6
(1,3-10,1)
|
9,6
(4,0-22,3)
|
19,3
(10,1-39,6)
|
29,9
(15,7-61,6)
|
41,5
(26,4-72,7)
|
0,93
(0,36-2,6)
|
ЧРГ, обострение
(n=28)
|
4,2
(0,1-12,5)
|
9,2
(0,0-32,8)
|
18,2
(2,8-39,1)
|
29,8
(7,0-51,1)
|
35,3
(12,6-56,2)
|
0,77
(0-2,73)
|
ЧРГ, ремиссия
(n=23)
|
2,3
(0,0-14,2)
|
5,2
(1,1-29,7)
|
13,9
(3,7-46,1)
|
20,8
(9,8-60,4)
|
32,5
(17,5-72,8)*
|
0,41
(0-2,46)*
|
*р < 0,05 при сравнении с группой здоровых доноров (тест Манна-Уитни).
Таблица 12. Коэффициенты корреляции между указанными параметрами NK-клеток в трех исследованных группах.
Параметр 1
|
Параметр 2
(NK-активность)
|
Группы
|
Доноры
|
ЧРГ (обостр.)
|
ЧРГ (рем.)
|
% NK-клеток среди МНК
|
% убитых мишеней
при Э:М = 50:1
|
0,64***
|
0,59**
|
0,64**
|
ЛЕ20 на 105 МНК
|
0,76***
|
0,52**
|
0,74***
|
% NK-клеток, дегранулирующих
в ответ на K562,
по отношению к NK-клеткам
|
% убитых мишеней
при Э:М = 50:1
|
0,42*
|
0,42*
|
0,70***
|
ЛЕ20 на 105 МНК
|
0,42*
|
0,49*
|
0,66***
|
% NK-клеток, дегранулирующих
в ответ на K562,
по отношению ко всем МНК
|
% убитых мишеней
при Э:М = 50:1
|
0,72***
|
0,53*
|
0,79***
|
ЛЕ20 на 105 МНК
|
0,81***
|
0,56*
|
0,92***
|
Значения достоверностей для коэффициентов корреляции: *p < 0,05, **p < 0,01, ***р< 0,001.
Несмотря на снижение дегрануляции и в обострении, и в ремиссии, NK-активность МНК (по сравнению с донорами) была достоверно снижена только в стадию ремиссии. В стадию обострения заболевания показатели NK-активности не отличалась от таковых у доноров (таблица 11).
Внутриклеточные уровни маркеров литических гранул (CD107a и перфорина) в NK-клетках, а также процентное содержание NK-клеток среди МНК, у пациентов с ЧРГ не были изменены по сравнению со здоровыми донорами.
Во всех трех группах (здоровые доноры, ЧРГ в обострении, ЧРГ в ремиссии) имела место достоверная корреляция между NK-активностью МНК и процентным содержанием NK-клеток среди МНК, а также между NK-активностью и процентами NK-клеток, дегранулирующих в ответ на клетки K562 (таблица 12). Однако при обострении ЧРГ коэффициенты корреляции между NK-активностью и процентом всех NK-клеток среди МНК были ниже, чем у доноров и у пациентов с ЧРГ в стадии ремиссии. То же касалось и корреляции между NK-активностью и процентами дегранулирующих NK-клеток. Эти данные показывают, что NK-активность МНК при обострении ЧРГ в меньшей степени зависит от дегрануляции NK-клеток. Одной из причин этого может быть активация других, не связанных с дегрануляцией, механизмов цитотоксичности NK-клеток при обострении ЧРГ. Пониженная дегрануляция NK-клеток и обусловленное этим снижение NK-активности, наблюдаемые в ремиссии, могут создавать благоприятные условия для нового обострения ЧРГ. |
