Глава 6 Разработка научно-методических материалов для специальных курсов «Свободно-радикальные процессы в живых системах: в норме и патологии» и «Антиоксиданты – проблемы и перспективы клинического применения» для чтения на 4 и 5 курсах медицинских факультетов ВУЗов РФ и других медицинских образовательных учреждений
Работы изданы, приложены в электронном виде
Заключение
Исследование свободно-радикального статуса инфекционных заболевариях, имеет особое значение, так как закладывает основу для проведения грамотной патогенетически обоснованной терапии. Кроме того, определение оксидантного статуса организма необходимо проводить в динамике инфекционного процесса, так как полученные в разные периоды заболевания данные являются основанием для прогноза течения и характера патологического процесса и важны при назначении некоторых фармакологических препаратов.
При изучении свободно-радикального статуса больных различными формами стафилококковой инфекции мы учитывали и то, что любое инфекционное заболевание обусловлено иммунодефицитным состоянием, которое усугубляется при неблагоприятоном течении заболевания и выражается в снижении количества и подавлении функций Т-лимфоцитов [21], нарушении соотношения субпопуляций лимфоцитов [21], а также в подавлении факторов неспецифической антиинфекционной резистентности [22].
Проведенные нами исследования показали существование значительных нарушений свободно-радикальных процессов при стафилококковых инфекционных заболеваниях. Интегральное взаимодействие макро- и микроорганизма носит динамический характер и воспалительная реакция в начале в виде локального ответа на инфекцию (группы больных с ангинами, ягодичными постинъекционными абсцессами, флегмонами, маститами), при сепсисе приводит к хаотическому нарушению всех механизмов противоинфекционной защиты и повреждению собственных органов и тканей.
Примером компенсированного подъема активности свободно-радикальных процессов являются результаты изучения состояния прооксидантной и антиоксидантной систем у больных с ягодичными абсцессами.
Повышение внеклеточного выброса радикалов (активные формы кислорода и оксид азота) в острый период заболевания происходило параллельно с подъемом активности антиоксидантной системы. Показатели активности каталазы, супероксид дисмутазы и антиоксидантной активности плазмы нормализовались уже ко вторым суткам.
Доля внутриклеточных радикалов и фагоцитарные показатели у больных этой группы в острый период снижены более чем в два раза, но имеют положительную динамику и нормализуются к моменту выписки из стационара.
Таким образом, при этой форме локализованной стафилококковой инфекции происходит повышение продукции радикалов, что объясняется необходимостью быстрой внеклеточной инактивации бактерий путем окисления структур микроорганизмов.
Для предотвращения опосредованной свободными радикалами самодеструкции клеток-фагоцитов и воспалительного повреждения подлежащих тканей происходит индукция генов, кодирующих ферменты антирадикальной защиты и регистируется повышенный уровень каталазы, супероксид дисмутазы и общей антиокислительной емкости плазмы.
Однако при более тяжелых по характеру и течению гнойно-воспалительных заболеваниях (фолликулярная и лакунарная ангины, лактационный мастит, генерализованная стафилококовая инфекция) выявлены существенные нарушения состояния свободно-радикальной системы.
При изучении свободно-радикального статуса фагоцитов при различных формах локализованной стафилококковой инфекции мы отдавали себе отчет, что, изучая нейрофильные или лейкоцитарные пулы клеток крови, нами исследуются последствия местной воспалительной реакции, то есть последствия локального повреждения. Но и по эти признаки оказались ценными в качестве, как диагностических, так и прогностических критериев оценки тяжести заболевания.
Несмотря на то, что выброс АФК при абсцессах и флегмонах ограничен небольшой областью, часть реактивных оксидантов неизбежно проникает в окружающую ткань и кровь, вызывая системные реакции. Кроме того, известно, что в случае образования больших количеств NO, последний реагирует с супероксидным радикалом, образуя другую активную форму кислорода – пероксинитрит (ONOO-) [23]. Токсичный сам по себе, пероксинитрит может неэнзиматически продуцировать высокореакционоспособные гидроксильные радикалы, включая тем самым, оксид азота в образование новых активных форм кислорода.
Защитным щитом для организма в этом случае служит антиоксидантная система [24]. Так, свободно-радикальный статус фагоцитов больных с ангиной характеризовался максимальным внеклеточным выбросом радикалов (оксид азота, АФК) нейтрофилами в острый период воспалительного процесса, на фоне подъема (в первые сутки), а затем резкого спада активности антиоксидантной системы (СОД и КАТ нейтрофилов периферической крови больных, антиокислительная емкость плазмы). Активность антиоксидантных ферментов нормализовалась к седьмым суткам, в отличие от показателей радикал-формирующей способности нейтрофилов (они остаются слегка повышенными и перед выпиской из стационара).
Полученные данные согласуются с данными Тихомировой О.В., изучавшей активность антиоксидантной системы у детей с лакунарной ангиной и показавшей максимальный спад активности СОД в лимфоцитах на четвертые сутки и тенденцией к повышению перед выпиской [25].
Различные сроки спада активности антиоксидантной системы в таких элементах крови, как нейтрофил и лимфоцит, вероятно, связаны с тем, что нейтрофилы являются клетками первой защиты организма [26] и изменения в их метаболизме осуществляет запуск биохимических каскадных реакций, приводящих к изменению функционирования и иммуннокомпетентных клеток (Т,В-лимфоциты).
Фагоцитарные показатели больных с фолликулярной и лакунарной ангиной снижены по сравнению с контролем. По гипотезе Рябиченко Е.В. с соавторами [27], возможно, внеклеточный выброс оксидантов задействует все энергетические ресурсы клеток, определяя их неполноценность и, как следствие, приводит к нарушению фагоцитоза.
По нашему же предположению, причиной столь сильного снижения эффективности фагоцитоза является нарушение в перераспределении радикалов в клетке.
Для проверки истинности подобной гипотезы мы применили метод оценки внутриклеточной продукции радикалов с помощью флуоресцентного красителя гидроэтидина.
Было обнаружено, что доля внутриклеточных активных форм кислорода значительно снижена в нейтрофилах больных по сравнению со здоровыми, причем степень снижения внутриклеточных радикалов коррелировала со степенью тяжести инфекционного процесса.
Из полученных данных мы заключили, что в активной фазе гнойно-воспалительного процесса происходит мощный выброс свободных радикалов кислорода и азота, которые могут инактивировать и уничтожать микроорганизмы во внеклеточном пространстве.
При этом смещается равновесие вневнутриклеточная продукция микробицидных радикалов в сторону внеклеточного процесса. В результате образующегося внутриклеточного дефицита радикалов страдает завершенность фагоцитоза и создаются условия для длительной персистенции бактерий внутри фагоцитов.
Поглощенные фагоцитами стафилококки оказываются защищенными от бактерицидных факторов сыворотки крови, фракция внутриклеточных радикалов мала и не является помехой для внутриклеточного размножения стафилококков. Кроме того, наряду с повышенным внеклеточным образованием супероксид аниона и оксида азота обнаружено значительное (более чем в два раза) снижение доли внутриклеточных АФК, особенно в острый период заболевания, что и приводит к неэффективному внутриклеточному перевариванию бактерий (снижены все изучаемые фагоцитарные показатели), являясь предпосылкой их длительной персистенции в организме. Исследованные параметры свободно-радикального статуса достоверно больше изменены в группе больных с более тяжелыми гнойно-воспалительными процессами и являлись одними из показателей тяжести течения инфекционного процесса.
Наиболее драматичная картина по силе и характеру патогенетических изменений получена при изучении свободно-радикального статуса больных с генерализованной инфекцией. По мере расшифровки механизмов антиинфекционной защиты и накопления новых данных при рассмотрении проблемы сепсиса происходит постепенная трансформация понимания сути септического процесса: от ведущей и единственной роли инфекционного агента к признанию существенного значения реактивности организма. Вероятно, одним из пусковых механизмов в развитии системного воспалительного ответа является гиперергическая стресс-реакция. Действительно, в обеих подгруппах больных с генерализованной стафилококковой инфекцией, нейтрофилы продуцировали больше радикалов, но активность этих процессов не сравнима с таковой у больных с локализованной инфекцией: в подгруппе больных с сепсисом нейтрофилы продуцируют более чем в двенадцать раз превосходящие нормальные количества супероксидного аниона, в подгруппе больных с тяжелым сепсисом количество продуцируемого супероксид аниона превосходит нормальный показатель более чем в 15 раз; уровень нитратов и нитритов в плазме крови выше нормы в 15 (подгруппа больных с сепсисом) и в 18 раз (подгруппа больных с тяжелым сепсисом). Высокие концентрации оксида азота и активных форм кислорода, дополняя действие липидных медиаторов и протеаз, при генерализованной инфекции включаются в цепную реакцию, приводящую к гибели клеток, поражению тканей и вторичной активации нейтрофилов. При сравнении показателей активности радикал-формирующей способности нейтрофилов больных разных подгрупп обнаружено, что продукция супероксиданион радикала и оксида азота во второй подгруппе (тяжелый сепсис) достоверно выше (р<0,01). К седьмому-четырнадцатому дню показатели активности свободно-радикальных процессов у больных с сепсисом и тяжелым сепсисом снижаются незначительно и к моменту выписки из стационара остаются повышенными. Выявленный подъем активности процессов генерации радикалов у больных с генерализованной инфекцией не приводит к быстрому и эффективному уничтожению патогенных бактерий. Процент выживших бактерий после фагоцитоза в обеих группах схож: каждый четвертый-пятый микроорганизм продолжает персистировать внутриклеточно, защищенный от сывороточных бактерицидных компонентов крови человека. Причиной столь низкой фагоцитарной эффективности генерализованной стафилококковой инфекции (в обеих подгруппах) оказалось, как и в других группах, снижение количества внутриклеточных активных форм кислорода. Однако при генерализованной инфекции степень снижения количества внутриклеточных активных метаболитов кислорода оказалась максимальной: у больных сепсисом составляет всего 10% от показателя здоровых доноров, у больных с тяжелым сепсисом - 8% (p<0.001).
Другим подтверждением развивающегося оксидативного стресса у больных с генерализованной стафилококковой инфекцией служит также изменение уровня антиоксидантных ферментов (каталазы, супероксид дисмутазы). Действительно, в первой подгруппе больных со стафилококковой инфекций на пике воспаления (при поступлении в стационар) были обнаружены повышенные по сравнению с нормой показатели активности КАТ и СОД, была увеличена также антиоксидантная емкость плазмы. На фоне интенсивно начатого лечения (вторые сутки) активность КАТ, СОД и антиоксидантная емкость плазмы больных с сепсисом резко падали ниже нормального уровня (р<0,01).
Затем на пятые, седьмые и на четырнадцатые сутки происходило постепенное увеличение всех измеряемых антиоксидантных параметров, но к 30 суткам ни один из показателей состояния антиоксидантной системы не достигал нормальной величины (р<0,01).
В группе больных с «тяжелым сепсисом» доказательством перехода фазы гипервоспаления в фазу «супрессии» являются значительно сниженные параметры активности КАТ и СОД и антиоксидантной емкости плазмы уже в первые сутки, что говорит об истощении антиоксидантного потенциала организма и декомпенсированной стадии заболевания.
Таким образом, стафилококковая инфекция, в особенности ее генерализованная форма, приводит к значительному дисбалансу свободных радикалов и их ингибиторов в крови.
Более того, направление продукции свободных радикалов нейтрофилами становится преимущественно внеклеточным, что не способствует внутриклеточному киллингу и приводит к воспалительному свободно-радикальному поражению клеток и тканей организма хозяина. Некоторые изменения параметров активности антиоксидантной системы (отсутствие подъема значений каталазы, супероксид дисмутазы и антиокислительной емкости плазмы в острый период) могут служить прогностическими критериями особо тяжелого течения гнойно-воспалительного процесса. Мы полагаем, что оптимальным является подход к оценке функционального состояния макрорганизма не с точки зрения «недостаточности» каких-либо органных функций – более грубых и часто неообратимых нарушений, а с точки зрения начальных проявлений отклонений от нормы,когда на клеточном уровне первоначально защитные функции радикалов превращаются в токсические для собственных органов и тканей. Нарушение равновесия в системе «прооксиданты-антиоксиданты» необходимо учитывать как в прогнозе течения заболевания, так и при проведении лечебных мероприятий и профилактике осложнений при различных формах стафилококковой инфекции.
Такая стратегия позволит быстрее уловить перемены в состоянии больного, определить способность организма больного к самостоятельному поддержанию гомеостаза и оперативней вносить необходимые коррективы в терапию.
Совокупность представленных данных указывает и на то, что, несмотря на бактерицидные свойства радикалов, на разных стадиях стафилококкового инфекционного процесса, ингибирование синтеза оксида азота и АФК может оказаться полезным.
Таким образом, патогенетической основой неблагоприятного развития инфекционного процесса стафилококковой этиологии служит, во-первых, нарушение перераспределения внеклеточных и внутриклеточных радикалов с формированием дефицита последних, последствием чего является нарушение процесса элиминации возбудителя из организма, и, во-вторых, снижение защиты собственных органов и тканей от внеклеточных радикалов за счет истощения активности антиоксидантной системы.
В качестве возможных регуляторов радикальных процессов в нейтрофилах мы применили препараты иммуноцитокинов, опираясь на широко известные результаты положительного влияния различных препаратов цитокинов на течение и исход гнойно-воспалительных процессов (реаферон, ронколейкин, лейкинферон, виферон, беталейкин) [28].
Механизм действия ИЛ-1 и ИНФ-γ связан с активацией естественных защитных реакций путем стимуляции в первую очередь неспецифических, а затем специфических звеньев иммунитета [28,28]. ИЛ-1 и ИНФ-γ при стафилококковой инфекции одними из первых цитокинов продуцируются различными клетками в ответ на внедрение патогенов. В ряде случаев синтеза эндогенных цитокинов оказывается недостаточно для полной и эффективной борьбы и инфекционным агентом. Отчасти такое положение может быть связано с активным противодействием микроорганизмов полноценному развитию механизмов противоинфекционной защиты.
В целях регуляции радикал-формирующей способности нейтрофилов и, опираясь на полученные раннее данные о том, что препараты некоторых иммуноцитокинов увеличивают количество внутриклеточных радикалов в перитонеальных макрофагах крыс [30], мы применили рекомбинантные препараты - интерлейкин-1β и интерферон-γ, а также естественный комплекс цитокинов Суперлимф для предстимуляции нейтрофилов больных стафилококковой инфекцией разных групп. Все препараты иммуноцитокинов значительно увеличивали фракцию внутриклеточных АФК: в группах больных с лакунарной ангиной, с околочелюстными флегмонами и генерализованной инфекцией иммуноцитокины повышали внутриклеточную генерацию АФК в три-четыре раза, приводя значения практически в норму.
При сравнении иммуноцитокинов по силе воздействия обнаружено, что Суперлимф увеличивал измеряемый показатель сильнее (р<0.05) во всех экспериментальных группах. Относительная легкость активации нейтрофилов, моноцитов\макрофагов и быстрота экспрессии ими цитокиновых рецепторов и генов имеет ясный биологический смысл: эти клетки обеспечивают первую линию противоинфекционной защиты, которая служит фундаментом для любых форм иммунного ответа. Снимщиковой И.А. с соавторами [29] показана прямая антибактериальная активность препарата «Суперлимф»: в дозах 5-10мкг\мл препарат обладал высокой антистафилококковой и антистрептококовой активностью.
Для клинико-лабораторного исследования эффективности терапии иммуноцитокинами был выбран препарата Суперлимф, максимально увеличивающий антимикробный потенциал нейтрофилов in vitro (по сравнению с препаратами рекомбинанатных иммуноцитокинов). Было получено, что комплекс иммуноцитокинов «Суперлимф» повышает долю внутриклеточных радикалов в лейкоцитах больных и приводит к более быстрому очищению от микробов, бактериальных токсинов. Препарат «Суперлимф» способствовал устранению дисбаланса суммарной внутриклеточной генерации радикалов, что приводит к увеличению эффективности внутриклеточного киллинга. Локальная иммунокоррекция препаратом «Суперлимф» являлась эффективным способом лечения больных с гнойно-воспалительными заболеваниями, позволяющим по сравнению с традиционной терапией быстрее купировать гнойно-воспалительный процесс и сократить сроки лечения пациентов.
Обзор имеющихся литературных данных показывает, что основной причиной низкой чувствительности стафилококков к защитному действию иммунной системы является их адаптационная способность продуцировать вещества, ингибирующие продукцию и/или активность факторов иммунитета. Так внеклеточная продукция протеина А, обнаруженная у S.aureus, снижает опсонизирующий потенциал компонентов сыворотки крови человека.
Стафилококки выделяют факторы, ингибирующие активацию комплемент, продукцию и активность лизоцима, а также продукцию интерферонов лимфоцитами. Адаптационные способности стафилококков позволяют им эффективно защищаться от повреждающего действия активных форм кислорода, продуцируемых фагоцитирующими клетками, стимулированными бактериальными клетками или компонентами бактериальных стенок.
Известно, что первичными бактерицидными факторами, выделяемыми фагоцитами, являются перекись водорода и продукты ее свободнорадикального разложения, такие как гипохлорит и гидроксильный радикалы [31]. Стафилококки приспосабливаются выживать в среде с повышенной концентрацией перекиси водорода путем индукции генов раннего ответа на окислительное повреждение.
Белковыми продуктами этих генов являются, среди прочих, фермент каталаза, разлагающий перекись водорода до нейтральных продуктов: воды и молекулярного кислорода, и глутатионпероксидаза (нейтрализует перекись водорода путем окисления восстановленного глутатиона). Так увеличение синтеза и активности каталазы тесно коррелирует с выживаемостью стафилококков и кишечной палочки в среде с высокой концентрацией перекиси водорода [32].
Напротив, генетически-модифицированные линии бактерии, утратившие гены, кодирующие белок каталазы, оказывались исключительно чувствительными к бактерицидному действию перекиси водорода.
Основные исследования механизмов борьбы с патогенами (стафилококками), ограничивались изобретением различных антимикробных веществ и воздействий (антибактериальные препараты, немедикаментозные методы). Согласно нашему предположению, одним из эффективных способов борьбы со стафилококками может быть избирательное подавление индукции бактериальных антиокислительных ферментов, либо избирательное угнетение факторов персистенции. В связи с чем, актуальным является целенаправленный поиск препаратов, угнетающих защитные ферменты бактерий. Это составит новизну и определит перспективность полученных результатов.
Однако наиболее объективным показателем эффективности фагоцитарной реакции является оценка внутриклеточногокиллинга. Полученные данные в представленной работе позволили выявить зависимость степени влияния препаратов от источника выделения штаммов S.aureus. Обнаружено, что исследованные препараты увеличивают эффективность внутриклеточного киллинга штаммов стафилококков, выделенных из зева и раневого отделяемого. При изучении влияния препаратов иммуноцитокинов на фагоцитоз бактерий, выделенных из крови, положительный эффект не зарегистрирован. Исследуемые имуноцитокины не обладали прямым антимикробным действием, так как не влияли на способность бактерий к колониеобразованию (данные не приводятся).
По нашим представления подобная разница в степени влияния иммуноцитокинов на процесс внутриклеточного киллинга бактерий различного происхождения может быть связан с персистентными характеристиками бактериальных штаммов, выделенных из разных источников. Поэтому в дальнейшем были исследованы персистентные характеристики штаммов S.aureus и корреляционые связи степени их выраженности с устойчивостью к фагоцитозу.
Обнаружено, что выявленная ранее зависимость устойчивости штаммов стафилококков к внутриклеточномукиллингу от источника выделения, не связана с такими факторами персистенции как антилизоцимная, антиинтерфероновая и антикомплементарная активности, но выявлена прямая корреляционая связь между активностью каталазы и высеваемостью после фагоцитоза (к-0.9).
Таким образом, повышенная устойчивость штаммов золотистого стафилококка, выделенных из крови, объясняется их высокой каталазной активностью. Для прогноза тяжести течения инфекционного процесса и подбора эффективной терапии наряду с иммунными показателями больного важное прогностическое значение имеет антиоксидантный статус бактерий. Одним из наиболее оптимальных путей борьбы с каталазоактивными микроорганизмами является поиск препаратов, ингибирующих каталазу, так как действие иммуноцитокинов, увеличивающих долю внутриклеточных активных форм кислорода, не привело к выраженному положительному результату.
Мы поставили задачу найти препарат растительного происхождения, снижающий исходную активность бактериальной каталазы. Суспензию S.aureus инкубировали с каждым препаратом и оценивали каталазную активность в отмытых бактериальных клетках йодометрическим и хемилюминесцентным методами.
Параллельно определяли эффективность внутриклеточногокиллинга стафилококков нейтрофилами по способности поглощенных бактерий к колониеобразованию. Максимальным эффектом обладал препарат БиоРекс, снижавший каталазную активность S.aureus на 35 %. Одновременно с ингибированием каталазы происходило существенное, в 500 раз, увеличение внутриклеточного киллинга стафилококков штамма 241 (количество выживших после фагоцитоза бактерий – от 5х106кл\мл в контроле до 104кл\мл).
Эффект препарата был дозозависимым. Таким образом, фитопрепарат на основе папайи может рассматриваться как непрямой антибиотик, ослабляющий адаптационные\приспособительные возможности стафилококков.
Перед апробированием эффективности местного действия Биорекса при гнойно-воспалительных заолеваниях мы оценили наличие и выраженность антиоксидантных свойств препарата БиоРекс в модельных (Фентон, ксантин-ксантиноксидаза) и клеточных системах (цельная кровь).
БиоРекс обладает способностью ингибировать продукцию супероксид аниона, гидроксиланиона и уменьшать ХЛ цельной крови доноров. Антиоксидантными свойствами в данных системах обладали все изучаемые составные части БиоРекса, но наиболее ярко они были выражены у листьев папайи и цветов папайи.
Таким образом, препарат БиоРекс обладает комплексом свойств, необходимых для лечения гнойно-воспалительных процессов: является антиоксидантным препаратом, что способствует ранозаживлению и ингибирует каталазу стафилококков, что делает бактерии более уязвимыми для иммунной системы.
Клиническую эффективность комплексной терапии с использованием препарата БиоРекс оценивали в трех балльной системе. К 3-4 дню при терапии Биорексом значительно уменьшалась отечность и гиперемия слизистых, уменьшались размеры миндалин.
При этом отмечалось быстрое исчезновение болезненности при глотании, чувство саднения в глотке. Ко 2-3 дню при местной терапии БиоРексом совместно с антибактериальной и дезинтоксикационной терапией значительно уменьшилась выраженность гноетечения и отека.
При этом отмечалось быстрое очищение раны от некротизированных тканей и уменьшение размеров инфильтрата.Ранняя грануляция и эпителизация раны. Достоверность отличий между группами БиоРекс и Плацебо на 3,5,7,14 сутки р<0,05.
Известно, что само по себе инфицирование стафилококком угнетает активность супероксид дисмутазы и глутатионредуктазы в эритроцитах [33]. При оценке свободно-радикального статуса больных различными формами стафилококковой инфекции нами был обнаружен дефицит антиоксидантной мощности организма, более выраженный при тяжелых гнойно-воспалительных процессах. Для восстановления уровня антиоксидантов применили препарат – «комплекс антиоксидантных витаминов и аминокислот», состоящий из высокоактивных субстанций – метионина, селена, витамина Е и коэнзима Q. В настоящее время выделено несколько тысяч фенольных соединений, среди которых наиболее выраженным антиоксидантным эффектом обладает витамин Е (α-токоферол). Токоферолы эффективно ингибируют супероксидный анион-радикал, синглетный кислород, пероксирадикалы, гидроксилрадикалы и индуцированные ОН-радикалами процессы ПОЛ [34].
Другой компонент «комплекса» – селен - входит в состав глутатионпероксидазы [34]. При недостатке селена в рационе питания уменьшается уровень глутатионпероксидазы, что приводит к снижению устойчивости организмов к окислительному повреждению.
Данные эпидемиологических исследований демонстрируют наличие обратной связи между содержанием селена в питьевой воде и смертностью от сердечно-сосудистых заболеваний и количеством гнойно-воспалительных процессов у населения. Убихинон или коэнзим Q относится к низкомолекулярным антиоксидантам, в литературе известно его положительное влияние на многие радикалзависимые патологические процессы [35].
Таким образом, на основе знаний о составе «комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот» и действии его отдельных компонентов на многие патологические состояния, мы решили исследовать его влияние на свободно-радикальный статус фагоцитов больных стафилококковой инфекций с наиболее выраженным дефицитом антиоксидантных показателей, предварительно изучив его влияние в биологическом эксперименте.
Препарат был протестирован в опытах in vitro и биологическом эксперименте, где было показано, что «комплекс» уменьшает токсическую и, в частности гепатоксическую нагрузку на организм. С другой стороны, препарат не снижал выход клеток в очаг воспаления и не влиял на содержание полиморфноядерных лейкоцитов и фагоцитирующих клеток в очаге.
Несмотря на содержание таких антиоксидантов как селен и витамин Е, «комплекс» не влиял на интенсивность радикалообразования, однако при этом восстанавливал до нормальных значений уровень СОД-активности клеток перитонеального экссудата. Следует также отметить и тенденцию к повышению индекса фагоцитоза в группах животных, принимавших «комплекс» (как на фоне перитонита, так и в контрольных группах).
При оценке показателей свободно-радикального статуса фагоцитов больных из разных групп обнаружено, что препарат не влиял на радикал-продуцирующую способность нейтрофилов периферической крови больных. Свободно-радикальные показатели активности клеток больных из разных групп сравнения достоверно не отличались (p>0.05).
При оценке антиоксидантных показателей обнаружено, что «комплекс» полностью предотвращал падение уровня активности каталазы, СОД нейтрофилов на 2-3 сутки, в этот период также увеличивалась антиоксидантная емкость плазмы больных, принимавших исследуемый препарат.
При оценке фагоцитарных показателей больных из разных групп следует отметить тенденцию к повышению числа фагоцитирующих клеток, эффективность фагоцитоза бактерий не изменялась.
На основании полученных данных можно утверждать, что при пероральном применении «комплекс» уменьшает общую интоксикацию организма. Он также действует как регулятор свободно-радикальных процессов в организме, восстанавливая уровень активности СОД макрофагов и эритроцитов, и способность фагоцитов к осуществлению дыхательного взрыва.
Результаты проведенного генетического исследования позволили установить, что баланс активации/инактивации радикалов складывается из соотношения активностей реакций биотрансформации ксенобиотиков (CYP1A1, GSTT1, GSTM1, GSTP1) и может влиять на степень риска развития осложнений [36-42]. В целом, полученные нами результаты исследования полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков у больных с септическими процессами свидетельствуют об общности некоторых аспектов, а также о том, что свойства факторов риска проявляют: патологический аллель CYP1А1*4, нулевые генотипы GSTT1 и GSTM1, функционально неполноценные аллели eNOS – C774T, G894T. В случае комбинаций CYP1A1*4 с негативными аллельными вариантами системы глутатион-транферазы, степень нарушения свободно-радикальных процессов усугубилась. В группе больных с распространенными флегмонами было выявлено, что наибольшие проценты пациентов встречались с комбинациями GSTM1 «-» СYPA1*4 и GSTТ1 «-» СYPA1*4 полиморфных генов. При исследовании интенсивности ХЛ, выявлено достоверное уменьшение суммарного радикалообразования в группах с комибинацией полиморфных генов (р<0,05). Сниженные показатели радикалообразования являются одной из причин уменьшения противодействия микробам при гнойном процессе и создают предпосылки для развития осложнений в виде генерализованной инфекции. Антиоксидантная активность плазмы крови пациентов исследуемых групп коррелировала с данными по ХЛ.
При оценке клинических особенностей течения распространенного гнойного заболевания у пациентов с разным генотипом был выявлен более затяжной характер воспаления при комбинациях GSTM1 «-» СYPA1*4 и GSTТ1 «-» СYPA1*4 полиморфных генов
В группе больных с генерализованной бактериальной инфекцией наибольшее количество больных было с комбинацией полиморфных генов GSTM1 «-» СYPA1*4 и GSTТ1 «-» СYPA1*4. В случае комбинаций CYP1A1*4 с негативными аллельными вариантами системы глутатион-транферазы, степень нарушения свободно-радикальных процессов усугубилась.
Однако, небольшое количество пациентов с генерализованной инфекцией, попавших выборку из-за ограниченных сроков выполнения НИР не позволяет считать данные выводы исчерпывающими. Для уточнения влияния на радикалообразование и антиоксидантную защиту других комбинаций, не попавших в настоящее исследование, следует продолжить работу по набору пациентов и исследованию влияния полиморфных генов и их генотипов на характер течения бактериальной инфекции.
Значение подобных исследований заключается в том, что на их основе можно ранжировать популяции по уровням риска развития мультифакториальных заболеваний и более эффективно организовать профилактические мероприятия, в том числе у здоровых лиц с выявленной генетической предрасположенностью к развитию дисбаланса редокс-статуса.
Так как конечная и единственная цель любого фундаментального исследования сводится к оптимизации терапии пациентов, то на основе представленной читателю информации можно сделать выводы о наиболее перспективных направлениях исследований и апробированные методы с успехом применять на практике.
В результате реализации НИР были создан клинико-лабораторный комплекс биохимических и молекулярно-генетических показателей для прогноза индивидуального риска и развития осложнений течения бактериальной инфекции, состоящий из:
перечня наиболее диагностически и прогностически значимых параметров оценки сводно-радикальных процессов на разных стадиях заболевания с учетом степени тяжести бактериальной инфекции;
генетических особенностей индивида (полиморфизм аллелей генов цитохрома Р-450, глутатионтрансферазы, эндотелиальной синтазы, окиси азота), позволяющих прогнозировать течение заболевания;
разработан комплект документов для разработки алгоритмов индивидуального подбора составляющих компонентов комплексной терапии больных бактериальными инфекциями включающий:
рекомендации по подбору препаратов для комплексной терапии при нарушениях свободно-радикального статуса пациента;
методические указания по изучению факторов персистенции возбудителей инфекционных заболеваний и алгоритмы подбора лекарственных веществ с непрямым антибактериальным эффектом;
схемы назначения препаратов в зависимости от особенностей показателей свободно-радикального и молекулярно-генетического статуса пациента и особенностей бактериальной микрофлоры – возбудителя инфекционного заболевания;
разработан профилактический комплекс мероприятий у здоровых лиц с выявленными молекулярно-генетическими маркерами сниженной детоксикационной (антирадикальной) защиты, включающий:
рекомендации по диагностике генетической предрасположенности к снижению антирадикальной защиты;
методические указания по изучению свободно-радикального статуса с описанием материалов и методов для исследования;
схемы профилактического назначения препаратов здоровым лицам с генетической предрасположенностью к развитию нарушений свободно-радикального статуса.
разработана программа внедрения результатов исследований в образовательный процесс;
разработаны научно-методические материалы для специальных курсов «Свободно-радикальные процессы в живых системах: в норме и патологии» и «Антиоксиданты – проблемы и перспективы клинического применения» для чтения на 4 и 5 курсах медицинских факультетов ВУЗов РФ и других медицинских образовательных учреждений.
|
