Оценка пластичности протеома плазмы крови здорового человека в экстремальных условиях жизнедеятельности
Скачать 453.97 Kb.
|
На правах рукописи Трифонова Оксана Петровна ОЦЕНКА ПЛАСТИЧНОСТИ ПРОТЕОМА ПЛАЗМЫ КРОВИ ЗДОРОВОГО ЧЕЛОВЕКА В ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ 14.03.08 Авиационная, космическая и морская медицина 03.01.09 Математическая биология, биоинформатика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем РАН (ГНЦ РФ - ИМБП РАН) и в Учреждении Российской академии медицинских наук Институте биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН (ИБМХ РАМН) Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Ларина Ирина Михайловна доктор биологических наук Лисица Андрей Валерьевич Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Воронков Юрий Иванович доктор биологических наук, доцент Ильина Елена Николаевна Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Защита состоится «29» сентября 2011 г. в 10.00 на заседании диссертационного совета Д 002.111.01 при Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем РАН (ГНЦ РФ - ИМБП РАН), г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76а С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ - ИМБП РАН, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76а Автореферат разослан «26» августа 2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета, д.б.н. Левинских М.А. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Анализ протеома плазмы крови позволяет выявлять белковые биомаркеры, практическая значимость которых определяется перспективой использования в сфере молекулярной диагностики и мониторинга эффективности лечения широкого спектра заболеваний (N.L. Anderson, N.G. Anderson, 2002). Крупномасштабное изучение протеома плазмы крови было проведено под эгидой международной организации HUPO (Human Proteome Organization). В рамках проекта HUPO Plasma Proteome Project (HPPP) было идентифицировано 7884 белка, как обобщенный результат 95 исследовательских проектов (Omenn G.S. et al., 2005, Klie S. et al., 2008). За последние 10 лет при исследовании различных заболеваний протеомными методами в плазме и сыворотке крови было выявлено более 200 потенциальных биомаркеров, однако, только единицы из них обладали высокой специфичностью. Первым и на настоящий момент единственным примером практического применения результатов протеомики стал многопараметрический тест OVA1, одобренный в 2009 году Американским агентством FDA для диагностики рака яичников (Anderson N.L., 2010, Hortin G.L. et al., 2010). Одной из причин такой низкой эффективности протеомных исследований является проблема биологической вариабельности контрольного биоматериала, остро стоящая в клинической протеомике. При обнаружении в крови белков, потенциальных биомаркеров, необходимо знать, какой степенью изменчивости обладает концентрация данных белков в норме (так называемая пластичность протеома), а также - границы внутри- и межиндивидуальных различий1. Anderson&Anderson в 2002 году согласно опубликованным данным о вариабельности ряда белков, таких как протромбин, миоглобин, гаптоглобин, интерлейкин, С-реактивный белок, липопротеины выдвинули гипотезу, что индивидуальные изменения уровня белков во времени должны быть как минимум вдвое ниже чем вариабельность внутри популяции (Anderson N.L., Anderson N.G., 2002). Недавно Todd H. Corzett с соавторами (2010) провели статистический анализ внутрииндивидуальной вариабельности протеома плазмы крови с помощью дифференциального гель электрофореза (Corzett T.H. et al., 2010). Их результаты показали, что групповая вариабельность значительно превышает индивидуальные изменения протеома во времени, которые, в свою очередь, сравнимы с технической погрешностью метода. Однако авторы не принимали во внимание ни состояние здоровья, ни образ жизни, ни пол обследуемых. Помимо значительных отличий между протеомными профилями индивидуумов и естественных изменений индивидуального протеома во времени, существуют вариации, связанные с адаптивным ответом на изменение внешних условий (Anderson N.L., Anderson N.G., 2002). Характеристика изменений белковой композиции плазмы крови является основой для изучения молекулярного ответа человека в новых условиях существования. При выполнении космических полетов, а также при участии в модельных экспериментах («сухая» иммерсия, длительная изоляция и др.) организм человека реагирует на непривычные для него условия. Изменения затрагивают все системы органов, что отражается на качественном и количественном составе белков крови. Так с помощью различных биохимических методов были выявлены изменения гормонов белковой природы (инсулина, соматотропина, ренина и других) (Ларина И.М. 2000; 2003; Григорьев А.И. с соавт., 1999), компонентов иммунной системы (иммуноглобулинов, факторов комплемента) (Гусева Е.В., Ташпулатов Р.Ю, 1979, 1980; Рыкова М.П. с соавт., 2001, 2004, 2006), белков системы свертывания крови (Фомин, А.Н., 1981) и «острой» фазы (Ларина О.Н., 1992; 2006), ферментов, в т.ч. протеолитических (Тигранян с соавт., 1987). Протеомный анализ для оценки изменений белкового состава жидкостей тела здорового человека во время космических полетов и наземных модельных экспериментов начали применять совсем недавно. Впервые, в нашей лаборатории для анализа изменений протеома сыворотки крови здоровых добровольцев был применен метод прямого масс-спектрометрического профилирования после предварительного фракционирования на магнитных частицах (Пахарукова Н.А. с соавт., 2010, Pakharukova N.A. et al., 2011). Метод позволяет анализировать одновременно несколько десятков пептидов, белков и белковых фрагментов, однако может применяться только для определения молекул с весом до 17 кДа. Широко распространенным методом анализа сложных белковых смесей в широком диапазоне молекулярных весов является двумерный гель-электрофорез (2-DE) (O’Farrell P.H., 1975). С помощью 2-DE можно осуществлять визуальное картирование протеома плазмы крови, проводить относительный количественный анализ и поиск дифференциально экспрессируемых белков. Несмотря на активно ведущиеся исследования по протеомному профилированию патологических состояний, понятие «норма» в протеомике до сих не определено. Можно полагать, что качественный и количественный состав белков может изменяться в пределах заложенной на генетическом уровне нормы реакции, однако систематизированные представления о мере пластичности/консерватизма протеома плазмы крови здорового человека при воздействии на его организм различных факторов среды или условий жизнедеятельности в настоящий момент отсутствуют. Целью работы являлась качественная и количественная оценка вариабельности белков плазмы крови здорового человека при воздействии на организм различных факторов, включая факторы, моделирующие эффекты микрогравитации. В рамках достижения указанной цели решались следующие задачи:
Научная новизна Впервые было проведено исследование по выявлению пределов вариабельности протеома плазмы крови, характерных для нормального человека, в том числе связанных с экстремальными воздействиями. С помощью метода двумерного электрофореза были оценены изменения в протеоме плазмы крови здоровых людей в ходе наземных экспериментов по моделированию отдельных факторов космического полета - 7-суточная «сухая» иммерсия и 105-суточная изоляция в гермообъекте. Впервые показано, что колебания состава протеома проявляются как признаки адаптивной пластичности протеома, в частности, в период восстановления после перенесенного воздействия. Практическая значимость работы В работе решена проблема оценки пластичности протеома плазмы крови, препятствующая медицинскому освоению результатов протеомных исследований. Определены доверительные интервалы коэффициента вариации, в пределах которых количественные изменения белкового состава крови не связаны с молекулярным механизмом развития болезни, а отражают физиологическую норму реакции организма. Установлено, что для отдельных белков масштаб этих колебаний сопоставим с изменением уровня белков плазмы, наблюдаемым при патологии. Получена важная информация с точки зрения исследования индивидуальных защитных механизмов, повышающих функциональные резервы здорового человека при воздействии неблагоприятных факторов окружающей среды, в том числе и факторов космического полета. Положения диссертации, выносимые на защиту
Апробация работы Основные положения диссертационной работы были представлены на 8 научных конференциях, в том числе и международные: 3-я протеомная конференция стран Центральной и Восточной Европы (Будапешт, Венгрия, 6-9 октября, 2009 г.); Российско-французско-белорусская конференция «Нейрососудистые изменения, вызванные воздействием условий внешней среды: молекулярно-клеточные и функциональные подходы» (Анже, Франция, 10-12 марта 2010 г.); 31-ый международный симпозиум по гравитационной физиологии (Триест, Италия, 13-18 июня, 2010 г.); I Международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, 17-19 ноября 2010 г.); 18-й международный симпозиум «Человек в космосе» (Хьюстон, США, 11-15 апреля 2011г.). Публикации По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах из перечня Высшей аттестационной комиссии Российской Федерации. Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследований с обсуждением, заключения, выводов, списка литературы и приложения. В диссертации приведены 11 таблиц и 24 рисунка. Список использованной литературы содержит 71 отечественных и 122 зарубежных источников. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Материалы исследования Исследовали образцы плазмы крови 16 здоровых добровольцев, прошедших врачебно-экспертную комиссию ИМБП РАН и допущенных к участию в модельных экспериментах: 1 – 7-суточная «сухая» иммерсия - 5 мужчин в возрасте 23 - 29 лет, пробы крови отбирали за 7 суток до начала эксперимента, на 7-е сутки проведения эксперимента и через 7 суток после окончания эксперимента (период реадаптации); 2 – 105-ти суточная изоляция в гермообъекте – 6 мужчин в возрасте 26 - 41 лет, пробы крови отбирали за 6-7 суток до начала эксперимента, на 17, 51-52 и 85-86 сутки проведения эксперимента и на 7-8-е сутки после окончания эксперимента (период реадаптации); 3 – внутрииндивидуальная вариабельность в норме – 5 мужчин в возрасте 26 – 48 лет, пробы крови отбирали на 1-е, 14-е и 21-е сутки в привычных условиях жизнедеятельности. Процедуры и методики исследований были рассмотрены Комиссией по биомедицинской этике при ГНЦ РФ - ИМБП РАН, а от испытателей, принимавших участие в исследовании, было получено письменное Информированное согласие. Методы исследования Получение образцов плазмы крови. Пробы крови у испытуемых отбирали из локтевой вены утром натощак. ЭДТА плазму крови получали стандартным методом, замораживали и хранили при -80°С до проведения дальнейших протеомных исследований. Получение обедненной фракции плазмы крови методом удаления мажорных и концентрирования минорных белков. Обедненную фракцию плазмы крови получали с помощью микрогранул ProteoMiner™ (Bio-Rad, США). 1 мл плазмы крови добавляли к спин-колонке с микрогранулами, дальнейшие шаги выполняли согласно инструкции производителя. На выходе получали 300 мкл элюата, замораживали и хранили при -20°С. Проверку качества обеднения плазмы крови проводили по наличию пиков одно – (m/z=66,5 кДа) и двухзарядного (m/z=33,3 кДа) ионов альбумина с помощью прямого масс-спектрометрического профилирования цельной плазмы и обедненной фракции, полученной после обработки микрогранулами ProteoMiner™. Для этого подкисленные растворы плазмы и обедненной фракции пропускали через обращеннофазовые наконечники ZipTip C18 (Millipore, Франция). Полученный элюат смешивали с матрицей (синаповая кислота (SA)) в соотношении 1:1 и наносили на MALDI мишень AnchorChip (Bruker Daltonics, Германия). Спектры получали в линейном режиме на масс-спектрометре с времяпролетным анализатором Autoflex III TOF (Bruker Daltonics, Германия) в диапазоне масс 18 – 120 кДа. Проведение двумерного электрофореза. Для выравнивания анализируемых двумерных электрофореграмм по общему белку перед проведением анализа методом двумерного электрофореза концентрацию белка в образцах обедненной фракции плазмы крови определяли по методу Брэдфорда (Bradford M.M., 1976) на вертикальном фотометре УНИПЛАН™ (Пикон, Россия). Измерение проводили по оптической плотности растворов при длине волны 530 нм. Пересчет оптической плотности в концентрацию осуществляли линейной аппроксимацией методом наименьших квадратов калибровочной прямой, построенной с использованием стандартных растворов бычьего сывороточного альбумина. Для разделения белков по изоэлектрической точке аликвоты образца обедненной фракции плазмы крови, соответствующие 200 мкг белка, разводили буфером (7М мочевина, 2М тиомочевина, 4% CHAPS, 0,5% Амфолит рН 3-10 и 50мМ ДТТ) до конечного объема 200 мкл и наносили на 11 см стрип с иммобилизованным нелинейным градиентом рН 3-10 (Bio-Rad). Изоэлектрическое фокусирование проводили на приборе Protean IEF Cell (Bio-Rad) по следующей схеме: активная регидратация в течение 14 часов, 250 В в течение 30 минут, 5500 В до 35000 Вч и 800 В в течение 10 часов. Затем стрипы промывали в уравновешивающем буфере (6М мочевина, 50мМ Tris-HCl pH 6,8, 20% глицерин и 2% SDS) сначала с добавлением 1% ДТТ, а потом 2,5% акриламида по 30 минут соответсвенно. Для разделения белков на основании различия их размеров (молекулярных масс) и пространственных конфигураций стрипы переносили на самодельные 4%-12% Tris-HCl полиакриламидные гели (13,3×8,7 см). Разделение проводили в ячейке Criterion Dodeca Cell (Bio-Rad) в несколько стадий: 15 минут при 50 В, 30 минут при 150 В и около 40 минут при 175 В при постоянном охлаждении. Гели окрашивали 0,1% раствором Coomassie Brilliant Blue (CBB) R-250 (Sigma). Для усреднения технической погрешности метода каждый образец анализировали в двух-трех повторах. |
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | V-я Международная научно-практическая конференция психологическая... Гбоу впо «тихоокеанский государственный медицинский университет» Минздрава России |  | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Кровь, её состав и значение в обеспечении жизнедеятельности организма. Клеточные элементы крови эритроциты, лейкоциты, тромбоциты.... |
| Порядок проведения егэ Количество неизмененного вещества, которое достигло плазмы крови, относительно исходной дозы препарата | | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Реализация этих требований гарантирует сохранение работоспособности и здоровья человека, готовит его к действиям в экстремальных... |
| Положение о пункте проведения единого государственного экзамена Количество неизмененного вещества, которое достигло плазмы крови, относительно исходной дозы препарата | | Темы рефератов Взаимодействие человека и среды обитания. Эволюция... Основные составляющие здорового образа жизни и их влияние на безопасность жизнедеятельности личности |
| Конспект урока "Группы крови. Переливание крови. Донорство" (Тема... ... | | Учебной дисциплины пс рпуд рабочая программа учебной дисциплины (модуля)... ... |
| Тесты по фармакологии фармакокинетика что включает в себя понятие фармакокинетика? Количество неизмененного вещества, которое достигло плазмы крови, относительно исходной дозы препарата | | Учебно-методический комплекс учебной дисциплины «Безопасность жизнедеятельности» Безопасность жизнедеятельности – это область научных знаний, изучающая общие опасности, угрожающие каждому человеку и разрабатывающая... |
| Задачи: Продолжить формирование понятия о внутренней среде и ее компонентах.... Проанализировать функции плазмы и форменных элементов крови, ввести понятия «фагоцитоз», «антигены», «антитела» | | Учебно-методический комплекс фтд. 05 Реабилитация людей, оказавшихся в экстремальной ситуации Целью курса является изучение особенностей психической деятельности человека в экстремальных условиях военных действий для оптимизации... |
| Экстремальная медицина, безопасность жизнедеятельности Проблем, угроз и рисков, связанных с жизнедеятельностью человека в повседневных условиях | | Безопасность жизнедеятельности и медицина катастроф Проблем, угроз и рисков, связанных с жизнедеятельностью человека в повседневных условиях |
| Безопасность жизнедеятельности и медицина катастроф Проблем, угроз и рисков, связанных с жизнедеятельностью человека в повседневных условиях | | Доклад Тема: Рациональное питание: масла растительного происхождения Актуальность работы заключается в том, что здоровье человека во многом зависит от его питания. Рациональное питание одна из главных... |
