Оценка пластичности протеома плазмы крови здорового человека в экстремальных условиях жизнедеятельности
Скачать 453.97 Kb.
|
Получение и анализ изображений гелей. Изображение гелей получали с помощью калибровочного денситометра Molecular Imager® GS-800™ (Bio-Rad) в режиме трансмиссии с разрешением 300 точек на дюйм. Анализ изображений гелей с определением интенсивности белковых пятен проводили с помощью программного пакета GelEditor (ИБМХ РАМН). Сводные данные интенсивности пятен по всем гелям переносили в Exсel для дальнейшего анализа. Анализ данных. Все данные в работе представлены как среднее арифметическое значение ± стандартное отклонение (M±SD). Для оценки достоверности изменений и воспроизводимости метода вычислялся коэффициент вариации (CV) интенсивности для каждого пятна как отношение стандартного отклонения величины к ее среднему значению (CV=SD/M*100%). Анализ распределения образцов по кластерам проводили с помощью иерархического кластерного анализа методом невзвешенного попарного арифметического среднего (программа Statistica 6.0). Расстояние между объектами (образцами плазмы крови) вычисляли с использованием коэффициента корреляции между профилями интенсивности белковых пятен на геле. Робастность результатов кластерного анализа оценивали путем моделирования выборок из эмпирического распределения значений интенсивности белковых пятен. Статистический анализ проводили с использованием непараметрического критерия Уилкоксона (программа Statistica 6.0). Межгрупповые отличия считали достоверными при p<0,05. Идентификация белковых пятен методом масс-спектрометрического анализа пептидных фрагментов (PMF). Вырезанные вручную из геля белковые пятна отмывали обесцвечивающим буфером (100 мМ бикарбоната аммония (NH4HCO3) в 50 % растворе ацетонитрила), дегидратировали 100% аценитрилом и подвергали трипсинолизу. Элюат пептидов смешивали с матрицей (2,5-дигидроксибензойная кислота (DHB)) и наносили на MALDI мишень AnchorChip. Масс-спектрометрический анализ проводили на масс-спектрометре с время-пролетным анализатором Autoflex III TOF (Bruker Daltonics) в рефлекторном режиме в диапазоне масс 800 – 4500 Да. Полученные спектры обрабатывали с помощью программы FlexAnalysis 3.0 (Bruker Daltonics). Определение пиков в спектре осуществлялось алгоритмом SNAP после предварительного вычитания базовой линии типа «top hat» и сглаживания за счет удаления шумов с помощью математического фильтра методом Savitzki-Golay. В масс-лист включались только пики, для которых отношение сигнал/шум превышало 5. Перекалибровку масс-спектров проводили по пикам аутолиза трипсина с массой 842,509 Да и 2211,104 Да. Поиск белков по набору масс пептидов проводили в программе Mascot v.2.1 (MatrixScience, Великобритания). Параметры поиска были следующие: база данных – NCBIr, вид организма – Homo sapiens, используемый фермент – трипсин, возможные модификации - Oxidation M, Propionamide C и точность определения масс пептидов – 100 ppm. Идентификацию белка считали достоверной, если вычисленный для него эмпирический критерий «Mascot score» превышал 63. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Протеомная карта обедненной фракции плазмы крови здорового человека Для создания протеомной карты здорового человека использовали двумерные электрофореграммы 60 образцов обедненной фракции плазмы крови, полученной после удаления мажорных и концентрирования минорных белков с использованием микрогранул ProteoMiner™ (Bio-Rad). Данный метод позволил значительно снизить концентрацию таких высокопредставленных белков, как альбумин и иммуноглобулины. Всего было получено 150 двумерных электрофореграмм, то есть по 2-3 повтора на каждый из анализируемых 60 образцов. После окрашивания гелей Coomassie Brilliant Blue подсчитывали количество визуализированных белковых пятен на всех двумерных электрофореграммах. При подсчете не было выявлено статистически достоверных различий показателя среднего количества регистрируемых белковых пятен ни между экспериментами, ни между группами образцов в одном эксперименте (табл. 1). Таблица 1. Среднее количество регистрируемых белковых пятен на электрофореграмме обедненной фракции плазмы крови в группах образцов
Среднее количество регистрируемых пятен на всех 150 двумерных электрофореграммах, полученных в ходе выполнения данной работы, составило 120±15. Эти данные соответствуют результатам других исследований, в которых изучали плазму крови человека методом 2-DE, с учетом размера гелей (13,3×8,7 см) и способа визуализации белков (Coomassie Brilliant Blue) (Ahmed N. et al., 2003, Kalenka A. et al., 2006, Archakov A. et al., 2009). На основании приведенных в таблице 1 данных можно утверждать, что условия модельных экспериментов не влияли на количество регистрируемых белковых пятен на двумерной электрофореграмме, и в ходе проведения исследования были достигнуты условия воспроизводимости анализа плазмы крови методом двумерного электрофореза. Для белковых пятен, регистрируемых на полученных двумерных электрофореграммах, анализировали встречаемость на всех 150 гелях. Результаты анализа приведены на гистограмме, показанной на рисунке 1.  Рисунок 1. Гистограмма распределения частоты встречаемости регистрируемых белковых пятен на полученных гелях обедненной фракции плазмы крови здоровых добровольцев. Видно, что 40% белковых пятен наблюдали на всех полученных гелях (100%). Более 70% пятен наблюдались не менее чем на половине гелей, и только 30% встречались менее чем на 50% гелей. Редко встречающиеся пятна чаще всего характеризовались низким уровнем интенсивности, и их низкая воспроизводимость может объясняться как технической погрешностью метода протеомного анализа, так и пределом чувствительности выбранного метода визуализации белковых пятен (Coomassie Brilliant Blue, до 10-7-10-8М). Оценка воспроизводимости аналитического метода (определение технической погрешности 2-DE). Воспроизводимость метода двумерного электрофореза анализировали с помощью расчета коэффициента технической вариации. Для этого по техническим повторам анализа образцов оценивали разброс стандартного отклонения относительно средней величины интенсивности каждого пятна на двумерной электрофореграмме. На гистограмме распределения коэффициента технической вариации интенсивности белковых пятен, наблюдавшихся на полученных двумерных электрофореграммах, видно, что для 45% пятен коэффициент составил менее 20%, и только для 22 пятен из 140 проанализированных (16%) он превысил 30% (рис. 2).  Рисунок 2. Гистограмма распределения коэффициента технической вариации метода для регистрируемых белковых пятен на двумерных электрофореграммах обедненной фракции плазмы крови. В среднем по всем образцам коэффициент технической вариации интенсивности белковых пятен составил 22%, что совпадает с данными других авторов, использовавших метод двумерного электрофореза для анализа протеома плазмы крови человека (Corzett T.H. et al., 2006, Winkler W. et al., 2008). Аннотирование мастер-геля. В качестве мастер-геля была взята двумерная электрофореграмма с максимальным количеством регистрируемых белковых пятен. На таком геле было визуализировано 140 белковых пятен, 70 из которых выявлялись более чем на 70% всех полученных в ходе данной работы электрофореграмм. Результаты идентификации пятен методом масс-спектрометрического картирования пептидных фрагментов показали, что на полученной протеомной карте наиболее интенсивно окрашенные группы пятен относились к следующим белкам плазмы крови: витронектин, протромбин, сывороточный альбумин, α-, β- и γ-цепи фибриногена и аполипопротеины A-I, A-IV и Е. Путем сопоставления результатов масс-спектрометрической идентификации белковых пятен на мастер-геле с аннотированными электрофореграммами плазмы крови человека, депонированными в базе данных SWISS-2DPAGE (http://www.expasy.ch/swiss-2dpage/viewer), было установлено, что полученная протеомная карта обедненной фракции плазмы крови совпадает с типовой картиной разделения белков плазмы крови методом 2-DE. Для дальнейшего анализа были определены 70 пятен с высокой частотой встречаемости (регистрировались не менее чем на 70% гелей) и относительно низкой погрешностью измерений (коэффициент технической вариации не более 25%). Анализ внутри- и межиндивидуальной вариабельности протеома плазмы крови здоровых людей в норме Внутрииндивидуальная вариабельность. Изменчивость протеома плазмы крови изучали у 5 здоровых мужчин за три недели их обычной жизнедеятельности. Обработка значений интенсивности анализируемых белковых пятен на двумерных электрофорераммах по трем точкам эксперимента показала, что средний коэффициент внутрииндивидуальной вариабельности в течение периода обследования составил 22±13%. Этот уровень вариабельности сравним с погрешностью метода анализа, что подтверждается графиком рассеяния среднего коэффициента внутрииндивидуальной вариации относительно коэффициента технической вариации интенсивности анализируемых белковых пятен (рис.3).   Рисунок 3. Распределение среднего коэффициента внутрииндивидуальной вариации относительно коэффициента технической вариации интенсивности белковых пятен на 2D электрофореграмме для образцов плазмы крови, полученных от 5 здоровых добровольцев на 1-е, 14-е и 21-е сутки обследования в обычных условиях жизни. Видно, что практически все точки на графике рассеяния расположены близко к линии, проведенной под углом 45°. Следовательно, средние индивидуальные колебания интенсивности соизмеримы с различиями между техническими повторами для большинства анализируемых белковых пятен. Полученные данные показывают, что в заданных условиях проведения исследования (выборка из 5 человек и достаточно ограниченное время мониторинга – на протяжении 3-х недель) не наблюдалось существенных изменений в составе протеома плазмы крови, обусловленных изменчивостью во времени. Анализ данных об изменении интенсивности белковых пятен индивидуально для каждого из 5 добровольцев указал на неинформативность усредненных показателей. Несмотря на то, что средний уровень внутрииндивидуальной вариабельности для некоторых пятен оказался незначителен, а для других был сравним с технической погрешностью метода анализа, в ряде случаев индивидуальные колебания оказались значимыми. Так, у одного добровольца интенсивность пятна кластерина на 14-й день обследования уменьшилась более чем в 2 раза по сравнению с 1-м днем, а на 21-й день – вернулась к первоначальному значению. У другого добровольца интенсивность этого пятна, наоборот, увеличилась в 1,5 раза на 14-й день обследования. В то же время у остальных трех добровольцев изменение интенсивности пятна кластерина в течение 3-х недель было совсем незначительным, в пределах 10-15%. Таким образом, профиль наблюдаемых изменений во времени для каждого человека индивидуален. Межиндивидуальная (групповая) вариабельность в норме. Для определения межиндивидуальных различий в протеоме плазмы крови здоровых людей в норме были проанализированы обедненные фракции образцов плазмы крови 16 мужчин, полученные в период их обычной жизнедеятельности. Аналогично предыдущей задаче, для каждого пятна вычисляли коэффициент вариации интенсивности между индивидуумами и сравнили с коэффициентом технической вариации метода (рис. 4).   Рисунок 4. Распределение коэффициента межиндивидуальной вариации относительно коэффициента технической вариации интенсивности белковых пятен на двумерной электрофореграмме для образцов плазмы крови, полученных от 16 здоровых добровольцев. При сравнении графика на рис. 4 с ранее полученными данными по внутрииндивидуальной вариабельности (рис. 3) очевидно, что общее количество пятен, характеризующихся высокой межиндивидуальной вариабельностью, значительно превысило количество пятен, характеризующихся высокой внутрииндивидуальной изменчивостью. В среднем коэффициент межиндивидуальной вариации составил 50±19%, что более чем в два раза выше, чем аналогичный показатель для индивидуальной вариабельности и для технической погрешности метода. Масс-спектрометрическая идентификация была проведена для пятен, расположенных на рис. 4 ниже линии, проведенной под углом 45°, с коэффициентом межиндивидуальной вариации более 50%, что как минимум в два раза превышает погрешность метода. Таких белковых пятен оказалось 37; результаты масс-спектрометрической идентификации приведены в таблице 2. Таблица 2. Белки плазмы крови, характеризующиеся высокой межиндивидуальной вариабельностью в норме. Коэффициент вариации усредняли по 16 образцам.
Примечание: CV – коэффициент вариации; * - согласно данным Gene Ontology (GO). Среди идентифицированных белков встречаются аполипопротеины A-I, Е и кластерин (аполипопротеин J), которые характеризовались и относительно высокой внутрииндивидуальной вариабельностью, которая в 1,5 раза превышала техническую погрешность метода. Высокая межиндивидуальная вариабельность различных форм аполипопротеинов может объясняться особенностями как липидного и энергетического обмена, так и двигательной активности у здоровых лиц. Кроме того, высокая изменчивость аполипопротеинов А-I и Е в крови здоровых добровольцев может быть связана с различным содержанием жиров и холестерина в рационе в течение обследования. Остальные белки, такие, как аполипопротеин A-IV, α-, β-цепи фибриногена, плазминоген, витронектин, фрагменты фактора С4 комплемента и другие, не были выявлены при исследовании внутрииндивидуальной изменчивости. Это указывает, что биологическая вариабельность протеома превышает внутрииндивидуальную изменчивость. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Похожие:
 | V-я Международная научно-практическая конференция психологическая... Гбоу впо «тихоокеанский государственный медицинский университет» Минздрава России |  | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Кровь, её состав и значение в обеспечении жизнедеятельности организма. Клеточные элементы крови эритроциты, лейкоциты, тромбоциты.... |
| Порядок проведения егэ Количество неизмененного вещества, которое достигло плазмы крови, относительно исходной дозы препарата | | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Реализация этих требований гарантирует сохранение работоспособности и здоровья человека, готовит его к действиям в экстремальных... |
| Положение о пункте проведения единого государственного экзамена Количество неизмененного вещества, которое достигло плазмы крови, относительно исходной дозы препарата | | Темы рефератов Взаимодействие человека и среды обитания. Эволюция... Основные составляющие здорового образа жизни и их влияние на безопасность жизнедеятельности личности |
| Конспект урока "Группы крови. Переливание крови. Донорство" (Тема... ... | | Учебной дисциплины пс рпуд рабочая программа учебной дисциплины (модуля)... ... |
| Тесты по фармакологии фармакокинетика что включает в себя понятие фармакокинетика? Количество неизмененного вещества, которое достигло плазмы крови, относительно исходной дозы препарата | | Учебно-методический комплекс учебной дисциплины «Безопасность жизнедеятельности» Безопасность жизнедеятельности – это область научных знаний, изучающая общие опасности, угрожающие каждому человеку и разрабатывающая... |
| Задачи: Продолжить формирование понятия о внутренней среде и ее компонентах.... Проанализировать функции плазмы и форменных элементов крови, ввести понятия «фагоцитоз», «антигены», «антитела» | | Учебно-методический комплекс фтд. 05 Реабилитация людей, оказавшихся в экстремальной ситуации Целью курса является изучение особенностей психической деятельности человека в экстремальных условиях военных действий для оптимизации... |
| Экстремальная медицина, безопасность жизнедеятельности Проблем, угроз и рисков, связанных с жизнедеятельностью человека в повседневных условиях | | Безопасность жизнедеятельности и медицина катастроф Проблем, угроз и рисков, связанных с жизнедеятельностью человека в повседневных условиях |
| Безопасность жизнедеятельности и медицина катастроф Проблем, угроз и рисков, связанных с жизнедеятельностью человека в повседневных условиях | | Доклад Тема: Рациональное питание: масла растительного происхождения Актуальность работы заключается в том, что здоровье человека во многом зависит от его питания. Рациональное питание одна из главных... |
