Тема: Ферменты как биологичексие катализаторы. Кинетика ферментативных реакций

Скачать 79.82 Kb.

Название	Тема: Ферменты как биологичексие катализаторы. Кинетика ферментативных реакций
Дата публикации	05.05.2015
Размер	79.82 Kb.
Тип	Практическая работа

100-bal.ru > Биология > Практическая работа

ЗАНЯТИЕ № 3

ТЕМА: Ферменты как биологичексие катализаторы. Кинетика ферментативных реакций.

Цель: Установить основные принципы обнаружения ферментов в биологических объектах (на примере амилазы и уреазы). Ознакомиться с основными свойствами ферментов и кинетикой ферментативных реакций. Дать количественную оценку активности некоторых гидролитических ферментов, имеющих клиническое значение.

Ферменты – биологические катализаторы белковой природы. Синтезируются клетками организма. Все ферменты – термолабильны, т.е. оптимум действия 0º- 45º С. Ферменты специфичны (различают абсолютную и относительную специфичность); для своего действия требуют строго определенного значения рН. Ферменты обладают высокой каталитической активностью (например, холинэстераза за 1 сек расщепляет 300000 молекул ацетилхолина).

Ферменты обнаруживают и оценивают по двум критериям: по появлению продуктов реакции или по исчезновению субстратов. Ферменты проявляют специфичность в отношении субстратов и типа реакции. Активность ферментов зависит от температуры, рН среды, концентрации субстрата [S] и концентрации фермента [Е].

Количественная оценка активности ферментов в биологических жидкостях (кровь, моча, слюна) широко используются в клинической практике для диагностики и дифференциальной диагностики заболеваний. Как правило, активность ферментов увеличивается при заболеваниях печени, инфаркте миокарда и других видах патологии. При диагностике болезней, связанных с врожденной недостаточностью метаболизма, определение активности ферментов становится единственным критерием болезни.

Количественная оценка активности ферментов основывается на измерении количества образовавшегося продукта реакции или убыли субстрата в единицу времени, отнесенного к 1 мг белка или 1 мл биологической жидкости.

Вопросы для рассмотрения на занятии:

Ферменты, определение. Биологическая роль ферментов. Понятие апофермент, кофермент, субстрат, продукт реакции, активаторы и ингибиторы ферментов.
Особенности ферментативного катализа. Виды специфичности.
Кинетика ферментативных реакций. Зависимость скорости ферментативных реакций от температуры, рН среды, концентраций фермента и субстрата. Уравнение Михаэлиса – Ментен. Константа Михаэлиса, физический смысл.

Практическая работа

Опыт № 1: Обнаружение активности уреазы (КФ 3.5.1.5.) и установление ее специфичности.

Принцип метода. Уреаза катализирует гидролиз мочевины по следующей реакции:

NH₂–CO–NH₂ + H₂O

2 NH₃ + CO₂

В отличие от мочевины, уреаза не действует на тиомочевину – вещество, структурно сходное NH₂–CS–NH₂.

Техника выполнения.

Реактивы, № пробирки	1	2
1. Вытяжка арбузных семян	1 мл	1 мл
2. 1% растворр мочевины	1 мл	—
3. 1% раствор тиомочевины	—	1 мл
4. Фенолфталеин	2к	2 к

Содержимое обеих пробирок встряхивают, оставляют на несколько минут при комнатной температуре и наблюдают появление розово-малиновой окраски в пробирке с мочевиной (за счет защелачивания среды аммиаком) и отсутствие окраски в пробирке с тиомочевиной. В протоколе:

Опишите принцип определения уреазы
Сделайте вывод о виде специфичности уреазы

Опыт № 2: Термолабильность ферментов на примере амилазы слюны.

Амилаза слюны (К.Ф. 3.2.1.1.) расщепляет гидролитически крахмал по следующей схеме:

(С₆Н₁₀О₅)_n

декстрины

С₁₂Н₂₂О₁₁ ( мальтоза)

Активность амилазы слюны обнаруживают по исчезновению синего окрашивания крахмала при взаимодействии с раствором йода.

Техника выполнения.

Реактивы,мл № пробирки	1	2	3
1. 1 % раствор крахмала	0,5 (10к)	0,5	0,5
2. Слюна (разведение 1: 10 ) без кипячения	0,5	–	–
3.Слюна (разведение 1:10) после кипячения 2–3 мин.	–	0,5	–
4. Дистиллированная вода (контроль)	–	–	0,5
Инкубируют все пробирки в течение 10 минут
5. Раствор йода	0,05 (1 К)	0,05	0,05

Запишите свои наблюдения.
Опыт № 3: Влияние рН на активность амилазы слюны.

Техника выполнения. В 3 пробирки наливают по 2 мл буферных растворов с различными значениями рН: 1,0; 7,0; 10,0. Затем в каждую пробирку добавляют по 1 мл слюны (разведение 1:10) и по 1 мл 1 % раствора крахмала. Через 10 минут инкубации содержимое всех пробирок проверяют на наличие крахмала реакцией с йодом. Укажите значение рН, при котором произошло полное расщепление крахмала. Нарисуйте график зависимости активности амилазы от рН среды.
Опыт № 4: Количественное определение диастазы (амилазы) в моче амилокластическим методом (по Каравею).

В клинической практике широко применяется количественное определение диастазы (панкреатической амилазы) в моче. Появление этого фермента в моче связано с деструкцией клеток поджелудочной железы при различной патологии и попадании фермента в кровь, а затем через почки в мочу. Уровень диастазы в моче характеризует обширность и глубину поражения поджелудочной железы и, следовательно, тяжесть заболевания. В связи с этим диастаза мочи резко повышается при острых и хронических панкреатитах.

Принцип метода: α-амилаза гидролизует крахмал с образованием конечных продуктов, не дающих цветной реакции с йодом. При взаимодействии крахмала с йодом образуется окрашенный комплекс, оптическая плотность которого при 640 нм пропорциональна концентрации негидролизированного крахмала. Активность α-амилазы оценивают по уменьшению интенсивности окраски.
Ход определения. В пробирки вносят реактивы по следующей схеме:

	Контроль (К), мл	Опытная проба (О), мл
Субстратно-буферный раствор	0,5	0,5
Прогреть 5 мин. При 37 ºС в водяном термостате; все последующие компоненты вносить в пробы, стоящие в термостате.
Образец	–	0,1
С момента внесения образца выдержать точно 7,5 мин. При 37 ºС.
Раствор соляной кислоты 0,1 н.	4,0	4,0
Образец	0,1	–
Раствор йода 0,01 н.	0,5	0,5

Определяют оптическую плотность холостой опытной проб при 670 нм (600–700 нм, красный светофильтр), относительно дистиллированной воды в кювете с толщиной слоя 1 см. Окраска стабильна в течении 10 мин. Активность α-амилазы выражают в миллиграммах или граммах крахмала, гидролизованного 1 л исследуемого образца за 1 сек инкубации при 37 ºС. Расчет производится по формуле:

Активность, мг/л*сек =

 44,4 ,

где А_к– оптическая плотность контрольной пробы;

А_о– оптическая плотность опытной пробы;

Нормальные величины:

В сыворотке (плазме) крови 3,3–8,9 мг/л*сек;

В моче до 44 мг/л*сек.

ЗАНЯТИЕ № 4

ТЕМА: Ферменты. Биологическая роль. Механизм и особенности фермен-тативного катализа. Кинетика ферментативных реакций.

Цель: Рассмотреть современные представления о строении ферментов, их биологической роли и особенностях ферментативного катализа. Составить представление о механизме действия ферментов, изучить строение и участие в метаболизме кофакторов и коферментов.

Контрольная работа: «Коферменты. Структура и биороль»

Тиаминпирофосфат (ТПФ)
Никотинамидадениндинуклеотид (НАД⁺), НАДФ⁺.
Флавинмононуклеотид и флавинадениндинуклеотид (ФМН и ФАД)
Пиридоксальфосфат (ПФ)
Биотин

Вопросы для рассмотрения на занятии:

Ферменты, определение. Биологическая роль ферментов. Понятие апофермент, кофермент, субстрат, продукт реакции, активаторы и ингибиторы ферментов.
Классификация и номенклатура ферментов.
Строение ферментов. Активный центр ферментов, состав, формирование, роль. Функциональные группы аминокислот, входящих в его состав.
Особенности ферментативного катализа. Виды специфичности.
Механизм действия ферментов.
Кинетика ферментативных реакций. Зависимость скорости ферментативных реакций от температуры, рН среды, концентраций фермента и субстрата. Уравнение Михаэлиса – Ментен. Константа Михаэлиса, физический смысл.
Энзимодиагностика. Органоспецифические ферменты. Изоферменты. Происхождение и физиологическое значение наличия изоферментов. Изоферменты лактатдегидрогеназы, креатинкиназы и др. Принципы определения и медицинское значение изоферментов. Энзимотерапия. Применение ферментов как лекарственных препаратов для лечения болезней.

Самостоятельная работа

Заполнить таблицу «Применение ферментов в медицине».

Основные разделы	Ферменты. Название	Примеры использования в медицинской практике
Диагностика
Лечение
Использование ферментов в качестве аналитических реактивов

Рефераты

Применение ферментов в диагностике и лечении различных заболеваний.
Изоферменты. Происхождение, принципы определения и медицинское значение.

Добавить документ в свой блог или на сайт

Похожие:

	Введение в основу настоящей программы положены следующие дисциплины:... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования		Программа-минимум кандидатского экзамена по специальности 02. 00.... В основу настоящей программы положены следующие дисциплины: "Катализ", "Кинетика химических реакций"
	Метаболизм: фазы и стадии. Общий путь катаболизма Формирование представлений о метаболизме как совокупности взаимосвязанных ферментативных реакций в клетке, специфических и общей...		«Витамины» Кузина Людмила Одна из основных функций витаминов заключается в том, что они являются составной частью коферментов и необходимы для важнейших ферментативных...
	«Скорость химических реакций. Катализаторы» Прошу записать на доске уравнение данного химического процесса. После этого возвращаемся к первой пробирке, где уже видны признаки...		Рабочая программа дисциплины «прикладная термодинамика и кинетика» Целями освоения дисциплины «Прикладная термодинамика и кинетика» являются приобретение студентами знаний и компетенций в области...
	Программа учебной дисциплины «прикладная термодинамика и кинетика» Целями освоения дисциплины «Прикладная термодинамика и кинетика» являются приобретение студентами знаний и компетенций в области...		Урок химии в 8 классе. Тема урока: «Типы химических реакций на примере свойств воды» Цель урока: изучить состав и строение молекулы воды, физические и химические свойства, значение воды для живых организмов, а так...
	Урок: «Скорость химических реакций. Факторы, влияющие на скорость химических реакций» Цель урока: ввести понятие о скорости химических реакций, ознакомить с факторами, влияющими на скорость химических реакций		Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цель урока: повторить классификацию веществ, типы химических реакций и признак их классификации, научить обучающихся применять полученные...
	Тема: Классификация химических реакций. Реакции, идущие без изменения... ...		Тема: Скорость химических реакций. Факторы, влияющие на скорость химических реакций Цели занятия: дать представление о научных основах по обеспечению пожарной и взрывной безопасности, изучить пожарно-техническую и...
	Тема: «Патофизиология боли» Биологическое значение боли как сигнала опасности и повреждения. Вегетативные компоненты болевых реакций		Урока: Образовательная Образовательная: обобщить представления о химической реакции как о процессе превращения одного или нескольких веществ в другие вещества;...
	Урок по химии 8 класс Тема: Генетическая связь между классами неорганических веществ Продолжить формировать умения пользоваться рядом напряжения металлов и таблицей растворимости и периодической системой Д. И. Меделеева...		Тема : основные углеводы организма Распределите ферменты в порядке действия на крахмал и продукты его расщепления при прохождении по пищеварительной системе

Школьные материалы