Молекулярно-генетические особенности структуры генов патогенности возбудителей коклюша и дифтерии; совершенствование лабораторной диагностики этих инфекций
Скачать 0.83 Mb.
|
Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора», протокол № 6 от 23 октября 2008 г. Основные результаты исследований представлены и доложены на 4-х Российских и 15-ти международных конференциях: съездах Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002; 2007); Российских научно-практических конференциях «Инфекционные болезни на рубеже XXI века» (Москва, 2000), «Вакцинология – 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2006); на международных конференциях «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 1998; 2003; 2008); на Международных совещаниях Международной лабораторной рабочей группы ВОЗ по дифтерии и проекта по контролю за дифтерией в странах Европейского Союза (International meetings of the European Laboratory Working Group on Diphtheria, ELWGD and Diphtheria surveillance network, DIPNET – Халхидики, 1998; Брюссель, 2000; Вена, 2002; Копенгаген, 2004; Вольягмени, 2006; Ларнака, 2008).Основное содержание работы отражено в 40 научных публикациях.Работа выполнялась в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Эпидемиология, микробиология», Федеральной целевой программы «Предупреждение и борьба с социально значимыми заболеваниями (2007 – 2011 годы)», подпрограммы «Вакцинопрофилактика», Международных проектов IncoCopernicus, INTAS, Международного научно-технического центра (МНТЦ), деятельности Международной Лабораторной Рабочей Группы ВОЗ по Дифтерии. Объем и структура диссертацииРабота состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы и четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Библиография включает 473 наименований работ, в том числе отечественных – 167 и зарубежных – 306 авторов. Общий объем диссертации составляет 292 страницы машинописного текста. Текст иллюстрирован 25 таблицами и 48 рисунками. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Штаммы бактерий. Изучено 187 штаммов B. pertussis, выделенных в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции (34 штамма – 1958 – 1969 гг., 57 штаммов – 1970 – 1989 гг. из коллекции ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» и 96 штаммов, выделенных от больных коклюшем в г. Москве в 1990 – 2007 гг. и полученные из бактериологических лабораторий филиалов ФГУЗ ЦГиЭ Роспотребнадзора в г. Москве); 147 штаммов C. diphtheriae, выделенных от больных дифтерией и бактерионосителей на территории России в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции (1985 – 2006 гг.) (из них 100 токсигенных штаммов, 47 нетоксигенных штаммов, 76 штаммов биовара gravis и 71 штамм биовара mitis). Коллекционные штаммы: три штамма B. pertussis, используемые для производства коклюшного компонента АКДС-вакцины (№ 475 (серотип 1.2.3), № 305 (серотип 1.2.0) и № 267 (серотип 1.0.3) и C. diphtheriae Park Williams 8 (PW 8) – для анатоксина (из коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича); референс штамм ВОЗ B. pertussis 18323 (из коллекции ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН). В качестве контролей использовали 20 штаммов B. parapertussis, 8 штаммов B. bronchiseptica, 2 штамма S. aureus, 10 штаммов C. ulcerans, 8 штаммов C. pseudodiphtheriticum из коллекции ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора». Штаммы микроорганизмов изучены с помощью микробиологических (334 штамма), иммунохимических (187 штаммов) и молекулярно-генетических (секвенирование (267 штаммов), ПЦР-технологии (268 штаммов) методов исследования. Микробиологическое исследование штаммов B. pertussis, B. parapertussis и B. bronchiseptica проводили согласно «Инструкции по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и паракоклюше» (1984) путем изучения их морфологических, культуральных, серологических и биохимических свойств. Изучение штаммов С. diphtheriae, С. ulcerans, C. glutamicum, C. pseudodiphtheriticum осуществляли по «Методическим указаниям по лабораторной диагностике дифтерийной инфекции» (Мазурова И.К. с соавт., 1998) с определением токсигенных свойств в реакции преципитации в геле (тест Элека); цистиназной, уреазной, сахаролитической и нитратредуктазной активностей. Для генотипирования штаммов B. pertussis пользовались стандартным протоколом, принятым на международном совещании ведущих специалистов в области молекулярно-биологических исследований представителей рода Bordetella в мае 1999 г. в Парижском институте Пастера (Mooi F., 2000). В основу проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) по выявлению генов: S1 субъединицы коклюшного токсина (ptxА), пертактина (prn), фимбриальных белков (fim2 и fim3), фактора колонизации трахеи (tcfA) взяты условия (Mooi F., 1998). Учитывая высокую стоимость реагентов и трудности их приобретения, проведены эксперименты по адаптации реагентов для ПЦР, предлагаемых российскими фирмами. Праймеры синтезировали в научно-производственной фирме «Литех» (г. Москва), реагенты для ПЦР приобретали в фирме “Fermentas” (Литва). Секвенирование фрагментов ptxА, prn, fim2, fim3, tcfA генов штаммов B. pertussis выполнено с помощью ABI Prism Big Dye terminator cycle sequencing ready reaction kit на ABI DNA секвенаторе (Perkin-Elmer Applied Biosystems). При секвенировании фрагментов ptxА гена использовали AF-AR праймеры; 1 области prn гена использовали праймеры AF и AR, 2 области – BF и BR, на область 152 – 707 – PF и PRN707R; фрагментов fim2 – Fim2F – Fim2R праймеры, фрагментов fim3 генов – Fim3F – Fim3R праймеры и фрагментов tcfA гена – TcfAF – TcfAR праймеры. Нуклеотидные последовательности генов штаммов B. pertussis были сопоставлены с базой данных EMBL/GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez). Секвенирование фрагментов tox гена C. diphtheriae проводили по (Nakao H., Mazurova I.K. et all, 1997) c использованием праймеров Diph 1F, Diph 3F, Diph 5F, Diph 6F. Секвенирование выполнено, как отмечено выше. В качестве сравнения использовали данные по структуре гена tox референс штаммов и токсигенных коринефагов из базы GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez ). Вирулентные свойства штаммов B. pertussis (в опытах in vivo на мышах при интрацеребральном заражении и учете количества павших животных с расчетом LD50) и лейкоцитозстимулирующую активность (ЛСА) культур (подсчет количества лейкоцитов в 1 мм3 периферической крови опытных и контрольных животных) определяли согласно («Инструкции по отбору, проверке и хранению производственных штаммов коклюшных бактерий», 1987). Статистическая обработка результатов. Использованы методы математической статистики, принятые в биологии и медицине (Гланц С., 1999). Программное обеспечение. Поиск и выравнивание нуклеотидных последовательностей в международных базах данных проводили с использованием BLAST WWW-сервера в NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST; http://www.sanger.ac.uk; http://www.pasteur.fr/mycb. Использовали программы BlastN и Blast2. Подбор олигонуклеотидных праймеров и температур их плавления осуществляли с помощью программы “Primer3.0” (http://www-genome.wi.mit.edu). Изучение вирулентных и иммунобиологических свойств штаммов B. pertussis выполнено совместно с коллективом сотрудников лаборатории иммуномодуляторов ГУ Института вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН – руководителем лаборатории к.м.н. Н.С. Захаровой, к.б.н. Н.У. Мерцаловой и А.С. Шинкаревым. Изучение особенностей структуры tox гена штаммов С. diphtheriae выполнено совместно с сотрудниками лаборатории диагностики дифтерийной инфекции ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» – руководителем лаборатории д.м.н., профессором И.К. Мазуровой, ведущим научным сотрудником, д.б.н. С.Ю. Комбаровой и к.м.н., доцентом В.Г. Мельниковым. Клинические испытания прямого ускоренного молекулярно-генетического метода LAMP-варианта проводили совместно с сотрудниками клинического отдела ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» на базе ИКБ № 1 (г. Москва) – к.м.н. М.С. Петровой и к.м.н. О.П. Поповой, с врачами-бактериологами филиала ФГУЗ ЦГиЭ в Северо-Западном административном округе (СЗАО) (г. Москва) В.Г. Скачковой и В.С. Савинковой и с младшим научным сотрудником ФРЛДДИ ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» Н.Т. Гадуа. Исследования по применению мультиплексной амплификационной технологии для выявления возбудителя дифтерии в клиническом материале больных проведены совместно с руководителем лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных препаратов Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (г. Оболенск) к.б.н. Н.В. Воложанцевым и сотрудником этой лаборатории В.А. Банновым. Из вышеуказанной лаборатории получены праймеры и протоколы для проведения мультиплексной амплификации. Апробирование метода выявления возбудителя дифтерии проведено на базе ИКБ № 1 (г. Москва) совместно с ведущим научным сотрудником ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» к.м.н. М.П. Корженковой. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Структура основных генов патогенности B. pertussis и особенности циркуляции возбудителя коклюша в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции Микробиологический и молекулярно-генетический мониторинг штаммов B. pertussis позволил оценить особенности распространения и свойства штаммов возбудителя коклюша, циркулировавших в прошлые годы, и сопоставить с данными о биологических и молекулярно-генетических свойствах штаммов, циркулирующих на современном этапе развития эпидемического процесса коклюшной инфекции. Изучена вариабельность биологических свойств 187 штаммов B. pertussis разных этапов эпидпроцесса, характеризующихся различным уровнем заболеваемости, охвата прививками, динамикой тяжести клинического течения коклюша и удельного веса штаммов различных серотипов (рис. 1):  Рисунок 1. Заболеваемость коклюшем и охват профилактическими прививками в г. Москве (1958 – 2007 гг.). Примечание: - - - данных об охвате прививками в эти годы собрать не удалось I период – допрививочный и первые десять лет проведения массовой иммунизации детского населения АКДС-вакциной (1958 – 1969 гг.), II – период стабилизации заболеваемости в 70-е годы и роста заболеваемости в 80-е годы при резком уменьшении охвата профилактическими прививками (1970 – 1989 гг.) и III – период относительной стабилизации заболеваемости на фоне роста охвата прививками, который к настоящему времени достиг 95,0% (1990 – 2007 гг.). В патогенезе заболевания коклюшем главная роль принадлежит коклюшному токсину – его энзиматически активной S1 субъединице, кодируемой ptxА геном. Вместе с тем, немаловажную роль в развитии инфекции играют другие факторы патогенности, такие как пертактин, кодируемый prn геном, фимбриальные белки, кодируемые fim2 и fim3 генами, и фактор колонизации трахеи, кодируемый tcfA геном, которые обеспечивают адгезию на поверхности чувствительных клеток эпителия и участвуют в запуске инфекционного процесса. Эти факторы патогенности B. pertussis, определяющие патогенез заболевания коклюшем, имеют важное значение при конструировании перспективных вакцинных препаратов – бесклеточных коклюшных вакцин. Изучена динамика распространения 187 штаммов B. pertussis, выделенных в разные периоды эпидпроцесса коклюшной инфекции, и показано, что штаммы с новыми «невакцинными» (ptxA1, prn2/prn3, fim2-2 и fim3В) аллелями четырех генов, кодирующих основные факторы патогенности возбудителя коклюша – коклюшный токсин, пертактин и фимбриальные белки, постепенно вытесняют штаммы со старыми «вакцинными» (ptxA2/ptxA4, prn1, fim2-1 и fim3А) аллелями этих генов (рис. 2). Для штаммов B. pertussis, циркулировавших в допрививочный период и первые 10 лет проведения массовой иммунизации детского населения АКДС-вакциной (I период наблюдения), характерными были «вакцинные» аллели четырех основных генов патогенности: ptxА2/ptxА4 аллели гена коклюшного токсина (в 47,0% и 53,0% случаев, соответственно), prn1 аллель гена пертактина (в 100% случаев), fim2-1 и fim3А аллели фимбриальных генов (в 89,5% и 100% случаев, соответственно). С начала 70-х годов в популяции штаммов коклюшного микроба появились штаммы (16,7% штаммов) с новым «невакцинным» ptxА1 аллелем гена коклюшного токсина. Начиная с 80-х годов штаммы B. pertussis, имеющие «невакцинный» ptxА1 аллель гена, стали доминирующими в популяции штаммов B. pertussis и в последующие годы полностью вытеснили штаммы с «вакцинными» ptxА4 и ptxА2 аллелями этого гена.  Распространение штаммов, несущих новые «невакцинные» аллели гена пертактина и фимбриальных генов происходило более медленно. Во II периоде наблюдения (1970 – 80-е годы), продолжали циркулировать штаммы «вакцинных» аллелей: prn1 аллеля (в 89,5% случаев), fim2-1 и fim3А аллелей фимбриальных генов (в 53,3% и 53,3% случаях, соответственно), кроме того, регистрировали штаммы с «невакцинными» аллелями этих генов патогенности: prn3/prn2 аллелями (в 25,1% и 11,0% случаев, соответственно), fim2-2 и fim3В аллелями (в 46,7% и 46,7% случаев, соответственно). Начиная с 90-х годов и до настоящего времени, в циркулирующей популяции штаммов B. pertussis, доминируют штаммы «невакцинных» аллелей этих четырех генов – ptxА1, prn2, fim2-2, fim3В и ptxА1, prn3, fim2-2 и fim3В. Таким образом, вся циркулирующая популяция современных штаммов B. pertussis (в 100% случаев) имеет «невакцинный» ptxA1 аллель гена коклюшного токсина; доминируют штаммы, содержащие «невакцинные» prn2 и prn3 аллели гена пертактина (в 76,0% и 21,9% случаев, соответственно); отмечается тенденция к увеличению доли штаммов с «невакцинными» fim2-2 и fim3В аллелями фимбриальных генов (в 53,3% и 83,4% случаев, соответственно). «Невакцинный» ptxА1 аллель характерен для структуры гена коклюшного токсина (КТ) современных штаммов B. pertussis, он отличается от других аллелей «немолчащей» мутацией в положении 684, приводящей к замене аминокислоты метионина на изолейцин (M228I) в молекуле белка КТ. Все три вакцинных штамма B. pertussis имели «вакцинные» (№ 475 – ptxА4, № 267 и № 305 – ptxА2) аллели гена КТ. Наиболее существенные изменения произошли в структуре гена пертактина. Вакцинные штаммы характеризовались наличием «вакцинного» prn1 аллеля гена пертактина. «Невакцинные» аллели prn2 и prn3 отличались от «вакцинного» аллеля «немолчащими» мутациями в положениях 832 – 834, приводящими к замене аминокислоты аланина на фенилаланин (А278F), и мутацией в положении 836 с заменой аминокислоты валин на глицин (V279G), а также наличием у prn2 аллеля дополнительного фрагмента в 15 п.н., которые кодируют новые аминокислоты в белковой молекуле пертактина, что существенно отличает её от молекулы белка пертактина вакцинных штаммов. Значительно меньшие изменения обнаружены в fim2 и fim3 генах, кодирующих фимбриальные белки. Структура fim2 и fim3 генов циркулирующих штаммов B. pertussis соответствовала одному из двух аллелей fim2 гена и одному из трех аллелей fim3 гена. Вакцинные штаммы характеризовались наличием «вакцинных» (fim2-2 и fim3А) аллелей фимбриальных генов. У «невакцинного» fim2-2 аллеля обнаружена «молчащая» мутация в положении 521, не приводящая к изменению на аминокислотном уровне. Вместе с тем, в «невакцинном» fim3В аллеле выявлена «немолчащая» мутация в положении 260, сопровождающаяся заменой аланина на глутаминовую кислоту (А87Е), что является контрастной заменой и оказывает влияние на функциональное состояние белка. Следовательно, генетическая структура современных штаммов B. рertussis с новыми «невакцинными» аллелями генов, кодирующих основные факторы патогенности возбудителя коклюша, отличается от генетической структуры вакцинных штаммов, входящих в АКДС-вакцину, что является весомым основанием для выбора и использования новых штаммов при конструировании АКДС-вакцины (табл. 1). Все изученные штаммы B. pertussis, независимо от периода эпидемического процесса коклюшной инфекции, также как и три производственных вакцинных штамма, были однородны и имели одинаковую структуру tcfA гена – «вакцинный» tcfA2 аллель. Другими словами, изменений в tcfA гене, кодирующем фактор колонизации трахеи, оказывающим существенное влияние на процесс адгезии и колонизации возбудителя коклюша в респираторном эпителии дыхательных путей, не обнаружено. Таблица 1. Сопоставление структуры генов коклюшного токсина (ptxA), пертактина (prn) и фимбриальных (fim2 и fim3) у современных штаммов B. pertussis (2002 – 2007 гг.) и штаммов B. pertussis, входящих в АКДС-вакцину.
Вирулентные свойства штаммов B. pertussis, выделенных на современном этапе эпидпроцесса коклюшной инфекции, изучены в пробе in vivo на мышах. Патогенные свойства штаммов B. pertussis оценивали по вирулентности и лейкоцитозстимулирующей активности. Анализ данных литературы по изучению вирулентных и токсических свойств штаммов B. рertussis прошлых лет и собственных исследований современных штаммов позволил получить полное представление о свойствах возбудителя коклюша в процессе его циркуляции в различные периоды эпидпроцесса (рис. 3). Показано, что в 60-е годы прошлого столетия в популяции возбудителя коклюша преобладали высокопатогенные штаммы. Начиная с 70-х годов, в течение 10 лет, стали регистрировать единичные штаммы с новыми «невакцинными» аллелями генов основных факторов патогенности возбудителя коклюша. При этом высокопатогенных штаммов не выявляли. В 80-е годы, т.е. в период снижения охвата профилактическими прививками и закрепления в популяции штаммов B. рertussis с «невакцинными» аллелями, среди циркулирующих штаммов появились высокопатогенные штаммы B. рertussis, удельный вес которых составил 6,0% – 8,0%, а к началу 90-х годов, когда штаммы с «невакцинными» аллелями заняли доминирующее положение, удельный вес высокопатогенных штаммов вырос до 11,1%. В настоящее время, когда охват профилактическими прививками достиг 95,0%, циркулируют штаммы B. рertussis с новыми «невакцинными» аллелями генов, кодирующих основные факторы патогенности, и в 72,7% случаев – с высокой степенью патогенности. Исследования, проводимые Л.С.Кузнецовой (1990), Р.Г.Шакировой (1987), О.Г.Ефимовой (1993), А.М.Кондратьевой (1977), Л.А.Сигаевой (1990) не изучена не изучена 1967-68 1970-71 1973-74 1977-78 1980-81 1983-84 1987-88 1989-92 2001-05  Рисунок 3. Патогенные свойства штаммов B. рertussis, выделенных в 1967 – 2005 гг. Штаммы B. pertussis с мутационными изменениями в гене коклюшного токсина, гене пертактина и фимбриальном гене, обнаружены еще в начале 70-х годов (рис. 2), т.е. через 10 лет проведения массовой иммунизации детского населения АКДС-вакциной в период стабилизации заболеваемости и высокого охвата прививками. Однако широкое распространение этих новых аллелей происходило в 80 – 90-е годы, когда процент охвата прививками не превышал 32,0% – 33,4%. В это время распространились штаммы B. pertussis с новыми «невакцинными» аллелями генов коклюшного токсина, пертактина и фимбриальных белков. Появившиеся мутационные изменения в геноме возбудителя коклюша оказались «успешными» для циркулирующей популяции и в последующих поколениях получили преимущественное распространение. Можно полагать, что период отсутствия или снижения охвата прививками явился «стрессовым» фактором, позволившим «закрепиться» новым мутационным изменениям в циркулирующей популяции и «запустить» распространение высокопатогенных штаммов B. pertussis с новыми «невакцинными» аллелями генов, т.е. имеющих новую генетическую структуру основных факторов патогенности. Нами подобраны три штамма B. рertussis – кандидата для вакцинных препаратов: № 186–01 (серотипа 1.0.3) с ptxA1, prn2, fim2-2 и fim3В аллелями, № 178–03 (серотипа 1.2.0) с ptxA1, prn3, fim2-2 и fim3В аллелями и № 19–05 (серотипа 1.0.3) с ptxA1, prn2, fim2-2, fim3А аллелями генов. Предварительные исследования иммунобиологических свойств этих штаммов показали возможности использования их в качестве кандидатов для конструирования вакцинных препаратов. |
Похожие:
 | Совершенствование диагностики возбудителей периимплантитов с использованием... Оформление. Портрет писателя; плакат "Приходите в Остер-класс, как-нибудь поучат вас"; книжная выставка "Веселые уроки Григория Остера";... | | Тема: патогенные кокки Овладеть основными методами лабораторной диагностики, терапии и профилактики кокковых инфекций |
 | Молекулярно-генетические и клинико-генотипические особенности муковисцидоза... Работа выполнена в лаборатории генетической эпидемиологии Государственного учреждения Медико-генетического научного центра рамн,... | | Отдел лабораторной диагностики иркутск, 2004 Медицинские услуги. Часть VII. Отдел лабораторной диагностики (пособие для врачей) / Составитель д б н., профессор Р. Г. Скворцова... |
| Образовательное учреждение высшего профессионального образования Днк-технологий для выявления генов высокой продуктивности и устойчивости к заболеваниям; диагностики болезней животных посредством... | | Программа XVIII всероссийской научно-практической конференции «Аналитическая... В. В. Долгов профессор, кафедра клинической лабораторной диагностики Российской медицинской академии последипомного образования |
| Рефераты на конференцию не принимаются Физиология, генетика, биохимия, микробиология: молекулярно-генетические, биохимические и физиологические процессы у растений, животных... | | Программа рекомендуется для направления подготовки (специальности)... Цель: ознакомление студентов с современными методами лабораторной диагностики и путями повышения качества исследований на базе внедрения... |
| Вопросы к экзамену физика и научный метод познания Молекулярно – кинетическая теория. Основные положения молекулярно – кинетической теории. Основная задача молекулярно-кинетической... | | Конспект Тема урока: «Москва центр борьбы с ордынским владычеством.... Тип урока: формирование и совершенствование знаний и умений с элементами лабораторной работы |
| Некоторые аспекты диагностики tоrch-инфекций в акушерстве Коханского ул., д. 7, г. Чита, 672038, тел. 31-43-23, факс. (302-2) 31-43-24 | | Краевая паразитология с элементами лабораторной диагностики паразитарных заболеваний |
| 18. "Основы эпидемиологии и карантинных инфекций" Инфекционные заболевания, источники, причины, пути распространения. Возбудители инфекционных заболеваний. Пути заражения: контактный,... | | Грамотрицательные неферментирующие бактерии алгоритмы лабораторной... Тема: Грамотрицательные неферментирующие бактерии – алгоритмы лабораторной диагностики. Значение в патологии человека и санитарной... |
| Микробиология, вирусология микробиология полости рта Структуры внутрибольничных инфекций, вызываемых условно-патогенными микробами и оппортунистами | | Клинические рекомендации для врачей общей практики острая почечная недостаточность Принципы и алгоритм клинико-лабораторной и инструментальной диагностики заболевания |
