Молекулярно-генетические особенности структуры генов патогенности возбудителей коклюша и дифтерии; совершенствование лабораторной диагностики этих инфекций
Скачать 0.83 Mb.
|
Особенности структуры tox гена, кодирующего синтез дифтерийного токсина С. diphtheriae При постановке задач по изучению дифтерийной инфекции были учтены результаты совместных исследований, проводимых ранее в Федеральной референс лаборатории диагностики дифтерийной инфекции ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора» (руководитель – д.м.н., профессор И.К. Мазурова) по изучению фено- и генотипических свойств С. diphtheriae, выявлению особенностей формирования структуры популяции и раскрытию механизмов эпидемического распространения возбудителя дифтерии. Полная нуклеотидная последовательность tox гена секвенирована у 45 штаммов С. diphtheriae (табл. 2). У 18 штаммов С. diphtheriae (в 40,0% случаев) последовательность нуклеотидов структурного tox гена соответствовала последовательности нуклеотидов этого гена производственного вакцинного штамма С. diphtheriae PW 8. В тоже время у 27 штаммов (в 60,0% случаев) в последовательности нуклеотидов обнаружены точечные мутации в 7 положениях. При этом, мутации в 6 положениях не приводили к замене аминокислот и только в позиции 1252 мутация сопровождалась изменением аминокислотного состава белка дифтерийного токсина. Мутационные изменения у штаммов C. diphtheriae встречались в различных сочетаниях (табл. 4). У большинства штаммов C. diphtheriae (в 66,7% случаях) замены нуклеотидов были только в одном из трех положений, у 11,1% штаммов – в двух и у 22,2% штаммов – в трех положениях. Частота встречаемости выявленных мутаций в tox гене штаммов С. diphtheriae была различная (табл. 3). Таблица 2. Замены нуклеотидов в tox гене у штаммов С. diphtheriae по сравнению со структурой tox гена штамма С. diphtheriae PW 8.
Примечание: ! – мутация, приводящая к замене аминокислоты Во фрагменте А tox гена только у одного штамма С. diphtheriae обнаружили замену нуклеотида, не приводящую к замене аминокислоты в белке дифтерийного токсина, что подтверждает консервативность А фрагмента tox гена. У большинства штаммов С. diphtheriae (в 75,0% случаях) мутационные изменения зарегистрированы в В фрагменте структурного tox гена, из них у 44,4% штаммов мутации выявлены в положении 1233. Обнаруженные мутации также не приводили к изменениям на аминокислотном уровне, за исключением замены нуклеотида в положении 1252, выявленной у двух штаммов биовара mitis, которая повлекла за собой изменение состава аминокислот – глицина на аргинин в положении 393 (G393R), что может оказывать влияние на конформацию и, следовательно, функциональные свойства белка дифтерийного токсина. Таблица 3. Сочетания мутационных изменений в tox гене ДТ.
Примечание: ! – мутация, приводящая к замене аминокислоты; * - наличие аналогичного нуклеотида Нами проведен мониторинг штаммов C. diphtheriae для обнаружения выявленной мутации в положении 1252. Секвенирован фрагмент tox гена размером 760 п.н. (положение нуклеотидов 991 – 1751) у 35 штаммов C. diphtheriae биовара mitis, выделенных в различных регионах России. В результате проведенного исследования оказалось, что у всех 35 штаммов C. diphtheriae биовара mitis мутация в положении 1252 не выявлена. Таким образом, обнаружено, что у большинства штаммов C. diphtheriae (в 60,0% случаях) имеются единичные мутации в структурном tox гене, которые не сказываются на первичной структуре белка дифтерийного токсина, и только у 2 штаммов C. diphtheriae (в 2,5% случаях) выявлена мутация (замена нуклеотида в положении 1252), которая приводит к контрастной замене аминокислот, что может оказывать влияние на функциональное состояние белка дифтерийного токсина. Появление даже единичных штаммов со значительными мутационными изменениями в tox гене дифтерийного токсина у циркулирующих штаммов свидетельствует о «подвижности» генетической структуры C. diphtheriae, что может привести к снижению эффективности анатоксина, полученного из токсина C. diphtheriae PW8. С другой стороны, накопление штаммов с множественными мутационными изменениями, не приводящими к аминокислотным изменениям, также может влиять на формирование генетической вариабельности вида и, вероятно, создает резерв изменчивости возбудителя дифтерии в меняющихся условиях существования. Особенности структуры генетической детерминанты амилазной активности штаммов C. diphtheriae Другим фактором патогенности C. diphtheriae, не связанным с токсическим компонентом, является способность возбудителя синтезировать фермент амилазу, который утилизирует углеводы, и тем самым создает дополнительный источник энергии для ускорения процессов генерации, роста на питательных средах и колонизации на слизистых оболочках человека. Анализ структуры генома возбудителя дифтерии позволил нам выявить в островке патогенности, включающем локусы DIP0334 – DIP0357, нуклеотидную последовательность – amy ген, кодирующий синтез амилазы, отвечающей за расщепление углеводов. Было сконструировано 10 пар праймеров, фланкирующих 10 взаимоперекрывающихся участков amy гена (рис. 4). После амплификации (рис. 5) выбранных областей специфические светящиеся фрагменты выявили только в образцах, содержащих ДНК штаммов C. diphtheriae биовара gravis и не обнаружили в образцах, содержащих ДНК штаммов C. diphtheriae биовара mitis. Был проведен мониторинг 87 штаммов C. diphtheriae биоваров gravis и mitis, выделенных от больных и бактерионосителей в различные периоды эпидемического процесса дифтерийной инфекции, на наличие фрагментов amy гена. Показано, что все образцы ДНК из 31 штаммов C. diphtheriae биовара gravis содержали специфический фрагмент ДНК, в то время как в 56 образцах, содержащих ДНК штаммов C. diphtheriae биовара mitis, данный фрагмент гена не регистрировали. 9(839п.н.) 7(839п.н.) 5(839п.н.) 3(839п.н.) 1(840п.н.) 10(749п.н.) 8(839п.н.) 6(839п.н.) 4(779п.н.) 2(839п.н.) Рисунок 4. Схема расположения праймеров, фланкирующих фрагменты amy гена. Дорожки 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18  Рисунок 5. Фотография фрагмента 1,5% агарозного геля, содержащего электрофоретически разогнанные продукты ПЦР с использованием специфических праймеров Amy3F – Amy3R к последовательности фрагмента amy гена. Примечание: дорожки 1, 18 – маркер молекулярных весов; 2, 4, 7, 9, 10, 11 – ДНК штаммов C. diphtheriae биовара gravis; 3, 5, 6, 8, 12, 13, 14 – ДНК штаммов C. diphtheriae биовара mitis; 15, 16, 17 – отрицательные контроли. Следующим этапом исследования явилось установление размера делеции. Анализ последовательности нуклеотидов в геноме штамма C. diphtheriae показал, что перед аmy геном расположен ген DIP0354. После проведения амплификации со специфическими праймерами и электрофореза регистрировали ПЦР – продукты во всех образцах, содержащих ДНК штаммов C. diphtheriae биовара gravis, и отсутствие таких фрагментов при исследовании образцов, содержащих ДНК штаммов C .diphtheriae биовара mitis. Для установления начала делеции провели анализ последовательности нуклеотидов генома C. diphtheriae и сконструировали две пары праймеров (рис.6): первая пара праймеров фланкировала область DIP0353 – DIP0354 размером 285 п.н., охватывающую фрагмент гена DIP0353 и фрагмент гена DIP0354; другая пара – фланкировала область DIP03532F – DIP03532R размером 225 п.н., охватывающую фрагмент гена DIP0353. После амплификации и электрофореза с парой праймеров DIP03531F – DIP03541R выявлены ПЦР – продукты в образцах, содержащих ДНК штаммов C. diphtheriae биовара gravis и отсутствие данных ПЦР – продуктов в образцах, содержащих ДНК штаммов C. diphtheriae биовара mitis (рис. 7А). После амплификации со второй парой праймеров (DIP0353 2F – DIP0353 2R) получили ПЦР – продукты в образцах, содержащих ДНК, как штаммов C. diphtheriae биовара gravis, так и штаммов C. diphtheriae биовара mitis (рис. 7Б). DIP0353 1F DIP0358уR 2R DIP0358 R DIP0354 1R DIP0353 2F DIP0353 2R DIP0358 DIP0357 (amy ген) DIP0354 DIP0353 307п.н. 210п.н. 285п.н. 225п.н. Рисунок 6. Схема расположения праймеров, фланкирующих фрагменты генов DIP0354, DIP0357 (amy ген) и DIP0358 C. diphtheriae. Дорожки:1 2 3 4 5 6 Дорожки: 1 2 3 4 5 6 7 Б А  Рисунок 7. Фотография фрагмента 1,5% агарозного геля, содержащего электрофоретически разогнанные продукты ПЦР с использованием праймеров DIP03531F – DIP03541R к последовательности фрагмента локуса DIP0353 – DIP0354 (А) и продукты ПЦР с использованием праймеров DIP03532F – DIP03532R к последовательности фрагмента гена DIP0353 (Б) C. diphtheriae. Примечание: дорожки 1 – маркер молекулярных весов; 2, 4 – ДНК штаммов C. diphtheriae биовара gravis; 3, 5, 6 – ДНК штаммов C. diphtheriae биовара mitis Для определения конца делеции также сконструировали две пары праймеров (рис. 6): первая пара фланкировала область DIP0357 – DIP0358 размером 307 п.н., охватывающую фрагмент гена DIP0357 (аmy ген) и фрагмент гена DIP0358, кодирующего синтез ацил-CoA-синтазы. После амплификации с этой парой праймеров (рис. 8А) выявлены ПЦР – продукты в образцах, содержащих ДНК штаммов C. diphtheriae биовара gravis и отсутствие ПЦР – продуктов в образцах, содержащих ДНК штаммов C. diphtheriae биовара mitis. Другая пара праймеров фланкировала фрагмент гена DIP0358 размером в 210 п.н. После амплификации с этой парой праймеров (рис. 8Б) получили ПЦР – продукты в образцах, содержащих ДНК, как штаммов C. diphtheriae биовара gravis, так и штаммов C. diphtheriae биовара mitis. Б А Дорожки 1 2 3 4 5 6 Дорожки 1 2 3 4 5 6  Рисунок 8. Фотография фрагмента 1,5% агарозного геля, содержащего электрофоретически разогнанные продукты ПЦР с использованием праймеров DIP0357F –DIP0358R к последовательности фрагмента локуса DIP0357 – DIP0358 (А) и продукты ПЦР с использованием праймеров DIP03582F – DIP0358yR к последовательности фрагмента гена DIP0358 (Б) C. diphtheriae. Примечание: дорожки 1 – маркер молекулярных весов; 2, 4 – ДНК штаммов C. diphtheriae биовара gravis; 3, 5, 6 – ДНК штаммов C. diphtheriae биовара mitis Таким образом, полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что в геноме штаммов C. diphtheriae биовара mitis отсутствуют локусы DIP0354 – DIP0357 (amy ген) и, следовательно, эти штаммы не обладают амилазной активностью. Способностью штаммов C. diphtheriae биовара gravis продуцировать амилазу и использовать дополнительные источники энергии (углеводы) можно объяснить различия и во времени генерации (in vitro) штаммов биоваров gravis и mitis. У штаммов биовара gravis оно составляет 60 минут, в то время как у штаммов биовара mitis – 180 минут. Быстрорастущие штаммы, формирующие колонии большего размера на питательной среде и на слизистых человека, имеют возможность более быстрого захвата железа из инфицированных тканей, что приводит к более ранней и высокой продукции дифтерийного токсина. При изучении уровня токсинообразования (УТ) штаммов C. diphtheriae двух биоваров нами показано, что у штаммов биовара gravis УТ в два раза превышал УТ штаммов биовара mitis (Борисова О.Ю., 1999; Комбарова С.Ю. и др., 2004; Мазурова И.К., 1993; Мазурова И.К. и др., 1999). Поэтому, взаимосвязь между тяжестью клинического течения дифтерии и выделением возбудителя биовара gravis можно объяснить высоким уровнем продукции дифтерийного токсина и быстрой колонизацией слизистой ротоглотки штаммами этого биовара. Так, совместные многолетние клинико-микробиологические исследования, проводимые сотрудниками лаборатории ФРЛДДИ совместно с Т.В. Платоновой показали, что в 90-е годы, в период эпидемического подъема заболеваемости дифтерией, формировалась генетически однородная высокотоксигенная популяция C. diphtheriae. При этом от больных выделяли штаммы биовара gravis и наблюдали утяжеление клинической картины дифтерии у непривитых детей, по сравнению с 80-ми годами ХХ века, когда у больных выделяли штаммы C. diphtheriae биовара mitis. Такое наблюдение подкрепляется и данными литературы, показавшими более тяжелую клиническую картину дифтерии при выделении штаммов C. diphtheriae биовара gravis (Нисевич Н.И., 1947; Хрущева В.А., 1964; Корженкова М.П., 2002, 2006). Способность штаммов C. diphtheriae биовара gravis продуцировать амилазу создает преимущества перед штаммами биовара mitis в скорости роста и, что, наряду с другими особенностями структуры биовара gravis, определяет более широкое и длительное распространение этого биовара. Показано, что период распространения штаммов C. diphtheriae биовара mitis (в 80-ые годы прошлого столетия) составил 7 – 8 лет, в то время как штаммы биовара gravis доминировали и циркулировали многие десятилетия – в 40 – 70-е годы и в течение последних 18 лет (Борисова О.Ю., 1999; Комбарова С.Ю., 2004, 2007; Мазурова И.К., 1993, 1997, 1999). Таким образом, исследование показало, что только штаммы C. diphtheriae биовара gravis несут генетическую детерминанту – amy ген, определяющую дополнительный фактор патогенности – фермент амилазу, дающий микроорганизму лучшие возможности колонизировать слизистые оболочки ротоглотки и, вследствие этого, более широко и длительно циркулировать среди населения, в то время как штаммы C. diphtheriae биовара mitis, в том числе и производственный вакцинный штамм C. diphtheriae PW8, имеют делецию фрагмента генома, включающего гены DIP0354 – DIP0357. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Похожие:
 | Совершенствование диагностики возбудителей периимплантитов с использованием... Оформление. Портрет писателя; плакат "Приходите в Остер-класс, как-нибудь поучат вас"; книжная выставка "Веселые уроки Григория Остера";... | | Тема: патогенные кокки Овладеть основными методами лабораторной диагностики, терапии и профилактики кокковых инфекций |
 | Молекулярно-генетические и клинико-генотипические особенности муковисцидоза... Работа выполнена в лаборатории генетической эпидемиологии Государственного учреждения Медико-генетического научного центра рамн,... | | Отдел лабораторной диагностики иркутск, 2004 Медицинские услуги. Часть VII. Отдел лабораторной диагностики (пособие для врачей) / Составитель д б н., профессор Р. Г. Скворцова... |
| Образовательное учреждение высшего профессионального образования Днк-технологий для выявления генов высокой продуктивности и устойчивости к заболеваниям; диагностики болезней животных посредством... | | Программа XVIII всероссийской научно-практической конференции «Аналитическая... В. В. Долгов профессор, кафедра клинической лабораторной диагностики Российской медицинской академии последипомного образования |
| Рефераты на конференцию не принимаются Физиология, генетика, биохимия, микробиология: молекулярно-генетические, биохимические и физиологические процессы у растений, животных... | | Программа рекомендуется для направления подготовки (специальности)... Цель: ознакомление студентов с современными методами лабораторной диагностики и путями повышения качества исследований на базе внедрения... |
| Вопросы к экзамену физика и научный метод познания Молекулярно – кинетическая теория. Основные положения молекулярно – кинетической теории. Основная задача молекулярно-кинетической... | | Конспект Тема урока: «Москва центр борьбы с ордынским владычеством.... Тип урока: формирование и совершенствование знаний и умений с элементами лабораторной работы |
| Некоторые аспекты диагностики tоrch-инфекций в акушерстве Коханского ул., д. 7, г. Чита, 672038, тел. 31-43-23, факс. (302-2) 31-43-24 | | Краевая паразитология с элементами лабораторной диагностики паразитарных заболеваний |
| 18. "Основы эпидемиологии и карантинных инфекций" Инфекционные заболевания, источники, причины, пути распространения. Возбудители инфекционных заболеваний. Пути заражения: контактный,... | | Грамотрицательные неферментирующие бактерии алгоритмы лабораторной... Тема: Грамотрицательные неферментирующие бактерии – алгоритмы лабораторной диагностики. Значение в патологии человека и санитарной... |
| Микробиология, вирусология микробиология полости рта Структуры внутрибольничных инфекций, вызываемых условно-патогенными микробами и оппортунистами | | Клинические рекомендации для врачей общей практики острая почечная недостаточность Принципы и алгоритм клинико-лабораторной и инструментальной диагностики заболевания |
