Молекулярно-генетические особенности структуры генов патогенности возбудителей коклюша и дифтерии; совершенствование лабораторной диагностики этих инфекций

Разработка ускоренных методов, основанных на амплификационных технологиях, для наблюдения и выявления возбудителя коклюша Новые знания о структуре генетических детерминант, кодирующих основные факторы патогенности, их мутационных изменениях, особенностях циркулирующих штаммов B. pertussis позволили подобрать специфические «мишени» и разработать на их основе новые молекулярно-генетические методы наблюдения и диагностики за возбудителями коклюша и дифтерии. Современный мониторинг и лабораторная диагностика инфекционных заболеваний, базирующиеся на молекулярно-генетических методах исследования, выявляют специфические генетические «мишени» и с большей достоверностью, по сравнению с фенотипической диагностикой, идентифицируют возбудителей инфекций, а также значительно сокращают сроки исследования. Молекулярно-генетический метод, основанный на полиморфизме длин рестрикционных фрагментов, для ускоренного выявления штаммов B. pertussis, циркулирующих на современном этапе Нами разработан новый молекулярно-генетический метод мониторинга штаммов B. pertussis, основанный на изучении полиморфизма длин рестрикционных фрагментов амплифицированных продуктов (ПЦР-ПДРФ). Метод базируется на выявлении специфических генетических «мишеней», дифференцирующих штаммы с новыми особенностями структуры ptxА гена, кодирующего основной фактор патогенности возбудителя коклюша – коклюшный токсин. Метод позволяет после проведения рестрикции амплифицированного определенного фрагмента ДНК специфической рестриктазой и последующего электрофореза, получить характерный рестрикционный профиль, являющийся генетическим «маркером», тесно связанным с генотипом микроорганизма. Учитывая выявленные особенности структуры различных аллелей ptxА гена (рис. 9), выбран фрагмент ДНК этого гена и подобраны две рестриктазы (EheI и BfuI), с помощью которых получен специфический рестрикционный профиль ДНК (рис. 10). Наличие мутации в положении 684 ptxA1 аллеля (рис. 9), создающей сайт рестрикции для фермента-рестриктазы EheI, определило выбор специфической «мишени» для дифференциации штаммов B. pertussis, имеющих новый «невакцинный» ptxА1 аллель гена от штаммов, несущих старые «вакцинные» аллели (рис. 10А). Наличие мутации в положении 586, создающей сайт рестрикции для рестриктазы BfuI, определило выбор другой специфической «мишени», с помощью которой можно дифференцировать штаммы B. pertussis с уникальным ptxА5 аллелем гена от штаммов с другими аллелями (рис. 10Б). * 196 204 586 684 696 ptxA2 GTG CTC GAC CAT CTG -//- GAG TAT T CC AAC GCT -//- CGC ATG GCG CCG GTG ATA GGC ptxA4 GTG CTC GAА CAT CTG -//- GAG TAT T CC AAC GCT -//- CGC ATG GCG CCG GTG GTG GGC ptxA5 GTG CTC GAА CAT CTG -//- GAG TAT С CC AAC GC T -//- CGC ATG GCG CCG GTG ATG GGC ptxA1 GTG CTC GAC CAT CTG -//- GAG TAT T CC AAC GCT -//- CGC ATA GCG CCG GTG ATA GGC рестриктаза BfuI рестриктаза EheI Рисунок 9. Сайты рестрикции для ферментов-рестриктаз EheI и BfuI. Примечание: показаны четыре аллели ptxА гена; положения нуклеотидов относительно стартового кодона AJ245366. Дорожки 1 2 3 4 5 6 7 Б Дорожки 1 2 3 4 5 650 п.н. 550 п.н. 300 п.н. А 650 п.н. 550 п.н. 400 п.н. 320 п.н. 300 п.н. 200 п.н. 130 п.н. 500 п.н. 320 п.н. 130 п.н. Рисунок 10. Профили рестрикции штаммов B. pertussis, полученные после обработки ампликонов рестриктазой EheI ( А) и BfuI (Б). Примечание А: Дорожки: 1 – маркер молекулярных весов DNA Ladder Mix; 2, 3 – рестрикционный профиль тип 1 (EheI); 4, 5, 6, 7 – рестрикционный профиль тип 2 (EheI) Б: Дорожки: 1 – маркер молекулярных весов DNA Ladder Mix; 4 – рестрикционный профиль тип I (BfuI); 2, 3, 5 – рестрикционный профиль тип II (BfuI) Для подтверждения возможностей использования нового метода для мониторинга штаммов возбудителя коклюша, изучен 121 штамм B. pertussis и показана полная корреляция между результатами рестрикционного анализа и секвенирования. Разработанный нами новый метод типирования штаммов B. pertussis может явиться инструментом в системе мониторинга коклюшной инфекции, позволяющим проводить наблюдение за циркулирующей популяцией штаммов B. pertussis, выявлять штаммы с измененной структурой ptxА гена и следить за их распространением. На новый молекулярно-генетический способ типирования штаммов B. pertussis, имеющих различную структуру гена коклюшного токсина, получен патент на изобретение № 2299908, зарегистрированный в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 мая 2007 г. Прямой ускоренный молекулярно-генетический метод лабораторной диагностики коклюшной инфекции Лабораторная диагностика коклюша в России до сих пор основана на микробиологических методах исследования, которые являются недостаточно чувствительными и эффективными. Серологические методы диагностики используются для ретроспективного анализа, так как эффективны только на 4-ой неделе заболевания. Все используемые в настоящее время амплификационные технологии не обладают высокой специфичностью, чувствительностью и дают ложноположительные результаты из-за большой гомологии геномов представителей рода Bordetella. Нами впервые разработан прямой, ускоренный и эффективный метод лабораторной диагностики коклюша – LAMP-вариант, основанный на современной изотермальной амплификационной технологии. Первым этапом разработки нового метода было воспроизведение LAMP-технологии. Использование этой технологии представляло серьезные затруднения вследствие отсутствия реагентов, используемых в LAMP, трудности их приобретения, а также их высокой стоимости. Поэтому были проведены предварительные эксперименты по оптимизации параметров амплификации – подобраны реагенты, отработаны концентрации и условия постановки реакции. Разработанный протокол исследования изучен на большой панели микроорганизмов (рис. 11). Обнаружено, что для всех образцов, содержащих ДНК штаммов B. pertussis, характерными были светящиеся специфические Ladder-подобные профили. Во всех остальных образцах, содержащих ДНК штаммов других микроорганизмов, регистрировали отрицательный результат. Данный метод с разработанным нами составом реакционной смеси был воспроизводим, что подтверждено серией повторяющихся экспериментов. Во всех сериях опытов отмечали постоянство профилей LAMP-ампликонов штаммов B. pertussis. Вместе с тем, такой вариант применим только при изучении «чистой» культуры возбудителя коклюша. Поэтому, перед нами стояла цель разработки прямого метода ускоренной лабораторной диагностики коклюша для выявления возбудителя непосредственно из клинического материала (с тампонов от больных коклюшем). Дорожки: М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Рисунок 11. Профили LAMP-ампликонов штаммов B. pertussis, B. parapertussis, B. bronchiseptica, С. glutamicum, C. ulcerans, C. pseudodiphtheriticum, C. diphtheriae и S. aureus Примечание: дорожки 1, 2, 5, 10, 12 – ДНК штаммов B. pertussis (50 штаммов); 3, 4 – ДНК штаммов B. parapertussis (20 штаммов); 6, 7 – ДНК штаммов B. bronchiseptica (8 штаммов); 8 –ДНК штамма С. glutamicum (2 штамма); 11 – ДНК штамма C. ulcerans (10 штаммов); 14 – ДНК штамма C. pseudodiphtheriticum (8 штаммов); 15, 16 – ДНК штаммов C. diphtheriae (20 штаммов); 9, 13 – ДНК штаммов S. aureus (2 штамма) Чувствительность амплификационных технологий высока только при работе с «чистыми» культурами микроорганизмов и автоматически не распространяется на чувствительность метода при работе с клиническим материалом, где на эффективность метода влияет методика подготовки клинического образца, способ выделения ДНК, освобождение от ингибиторов фермента амплификации, а также низкая концентрация первичной матрицы в малом объеме клинического образца. Разработка прямого молекулярно-генетического метода включала несколько этапов экспериментальных исследований: предварительную обработку клинического образца (смыв клинического материала с тампона от больного и его первичная обработка), подготовку клинического образца (разрушение клеточной стенки возбудителя коклюша в клиническом образце различными детергентами), выделение ДНК из клинического материала (изучены методы выделения ДНК с использованием сорбентов, детергентов, магнитных частиц, а также метода кипячения). В результате большого числа предварительных экспериментов показано, что прямой ускоренный метод лабораторной диагностики коклюша LAMP-вариант обладает высокой специфичностью в 100% случаев, высокой чувствительностью – выявляет 103 м.кл. возбудителя и позволяет идентифицировать возбудителя заболевания в течение 9 –10 часов от начала исследования непосредственно в клиническом материале от больного без этапа выделения «чистой» культуры. Клинические испытания прямого ускоренного молекулярно-генетического метода LAMP-варианта Применение LAMP-варианта для ускоренного выявления B. pertussis в клиническом материале больных коклюшем. Обследовано 86 больных, из них 53 больных с клиническим диагнозом «коклюш» разной степени тяжести (у 9,4% больных коклюш протекал в легкой форме, у 66,0% – в среднетяжелой форме и у 24,6% – в тяжелой форме), обследованных на различные сроки от начала заболевания (7,5% больных обследованы на 1ой неделе заболевания; 30,2% – на 2ой; 41,5% – на 3ьей; 15,1% – на 4ой и 5,7% – на 5ой неделях заболевания) и 33 больных с другими заболеваниями верхних дыхательных путей. Основную группу больных коклюшем (67,9%) составили дети в возрасте до 1 года, обследованных на 2ой – 3ьей неделях заболевания. Клинический материал от 86 больных коклюшем и из контрольной группы изучали одновременно в разработанном молекулярно-генетическом методе – LAMP-варианте и в классическом бактериологическом методе. Проведенные клинические испытания прямого метода LAMP-варианта, показали его высокую специфичность и высокую диагностическую эффективность, по сравнению с бактериологическим методом (рис. 12). Из 53 больных с диагнозом «коклюш», у 35 больных (в 66,0% случаях) клинический диагноз подтвержден только в LAMP-варианте; у 10 больных (в 18,9% случаях) диагноз подтвержден в LAMP-варианте и в бактериологическом методе; у 2 больных (в 3,8% случаях) диагноз подтвержден только в бактериологическом методе и у 6 больных (в 11,3% случаях) клинический диагноз не был подтвержден ни в одном из используемых методов. При сопоставлении эффективности LAMP-варианта и бактериологического метода показано, что из 53 больных коклюшем, у 45 больных клинический диагноз «коклюш» был подтвержден в LAMP-варианте, т.е. процент совпадений клинического диагноза и результатов разработанного метода составил 84,9% ± 4,9% (р < 0,001). В то время как бактериологическое подтверждение клинического диагноза «коклюш» было лишь в 12 случаях, что составило 22,7% ± 5,7% (р < 0,001). Рисунок 12. Диагностическая эффективность LAMP-варианта при сравнении с бактериологическим методом при обследовании 53 больных с клиническим диагнозом «коклюш». Рисунок 13. Сравнение эффективности LAMP-варианта и бактериологического метода в зависимости от формы заболевания коклюшем. Высокая диагностическая эффективность LAMP-варианта показана при обследовании больных с различными клиническими формами заболевания (рис. 13) – не только при среднетяжелых (в 91,4% случаев) и тяжелых формах (в 61,5% случаев), но и при легких формах заболевания (в 100% случаев). В тоже время бактериологическим методом возбудитель коклюша выявлен в небольшом проценте случаев только при среднетяжелых (в 22,8% случаях) и тяжелых формах заболевания (в 30,7% случаях). Высокая эффективность LAMP-варианта показана также при обследовании больных коклюшем в различные сроки от начала заболевания (рис. 14) – от 72,7% на 3ьей неделе, 87,5% на 4ой неделе заболевания до 100% на 1ой, 2ой и 5ой неделях заболевания. Бактериологическим методом удалось выявить возбудителя коклюша лишь в небольшом проценте случаев и то, только на 3ьей и на 4ой неделях заболевания. С целью определения специфичности разработанного метода взята контрольная группа больных – 33 человека с диагнозами «ОРВИ», «лакунарная ангина», «респираторный микоплазмоз» и др. Исследование клинических образцов, полученных от этих больных, в разработанном LAMP-варианте показало, что у всех 33 больных, т.е. в 100% случаев, были отрицательные результаты, также как и при бактериологическом обследовании. Рисунок 14. Сравнение эффективности разработанного метода ускоренной диагностики коклюша и бактериологического метода в зависимости от сроков обследования больных коклюшем. Таким образом, использование LAMP-варианта расширило возможности эффективного обследования больных, как с различной тяжестью клинического течения болезни, так и в различные сроки от начала заболевания (с ранних сроков и вплоть до 31 дня болезни, т.е. даже в период обратного развития заболевания), а также при обследовании детей до 1 года, детей с коклюшем, осложненным другими заболеваниями и в очагах инфекции, в первую очередь, в детских специализированных учреждениях. Разработанный метод применим для быстрого подтверждения или опровержения клинического диагноза «коклюш», в то время как бактериологический метод обладает низкой диагностической эффективностью (10,0%) и длительностью выдачи ответа (5 – 7 дней). Приведем несколько примеров эффективного использования нового прямого ускоренного молекулярно-генетического метода – LAMP-варианта при обследовании больных с подозрением на коклюш. Ребенок А. (11 мес.) госпитализирован в ИКБ № 1 с предварительным диагнозом «коклюш» из Дома ребенка № 2 СЗАО г. Москвы. При обследовании группы контактных лиц (10 детей и 10 взрослых) бактериологическим методом и разработанным ускоренным методом – LAMP-вариантом в течение суток был выявлен ребенок Г. (11 мес.) с положительным результатом в LAMP-варианте, что позволило быстро удалить его из очага коклюша и госпитализировать также в инфекционное отделение с диагнозом «коклюш». Однако, бактериологическое подтверждение этого случая было получено только через 6 дней. Следовательно, применение LAMP-варианта позволило провести быстрое обследование очага коклюшной инфекции, выявить заболевшего ребенка и своевременно изолировать его от остальных детей грудничкового возраста, тем самым предотвратив распространение инфекции. Ребенок М. (4 мес.) с серьезной патологией сердечно-сосудистой системы переведен из специализированного стационара в ИКБ №1 с подозрением на коклюш при отрицательных результатах бактериологического обследования. Применение разработанного LAMP-варианта позволило быстро подтвердить диагноз «коклюш». Ребенок Г. (4 мес.) из асоциальной семьи госпитализирован в ИКБ № 1 с диагнозом «респираторный микоплазмоз, острый бронхиолит, ателектаз сегмента левого легкого». Симптомы заболевания коклюшем у него были замаскированы выраженным микоплазмозом. Разработанный LAMP-вариант позволил подтвердить диагноз «коклюш», в то время как бактериологическое обследование дало отрицательные результаты. Впоследствии, серологическое обследование показало убедительное нарастание динамики титров антител в РА с 1:20 до 1:320, т.е. в четыре раза, на четвертой неделе от начала заболевания, что ретроспективно также подтвердило диагноз «коклюш» у ребенка. Апробация LAMP-варианта для ускоренного выявления B. pertussis в клиническом материале больных, обследованных с подозрением на коклюш и коклюшеподобные заболевания, проведена на 447 клинических образцах от лиц, обследованных с подозрением на коклюш и коклюшеподобные заболевания. Среди них, 81 (18,1%) образец был положительным в LAMP-варианте, в то время как в бактериологическом методе положительными были только 19 образцов. Из 81 положительного LAMP-образца, бактериологически подтвержденными оказались только 23,4% образцов. Таким образом, выявлена высокая эффективность применения LAMP-варианта для диагностики больных с подозрением на коклюш и коклюшеподобные заболевания, которая в 4,3 раза превышала результативность бактериологического обследования, а также в 5 – 7 раз сокращала срок выдачи окончательного ответа. На новый метод LAMP-вариант получено положительное решение о выдаче патента от 16.09.2008 г. по заявке № 2007147797/13 (052390). Выбор фрагмента нуклеотидной последовательности в amy гене в качестве «мишени» для определения принадлежности C. diphtheriae к биовару с помощью ПЦР Система бактериологической диагностики дифтерии, разработанная в России несколькими поколениями исследователей и практических микробиологов и используемая в настоящее время, направлена на то, чтобы в максимально короткий срок (4 – 5 дней) с помощью минимального набора тестов выявить в исследуемом материале (в мазках из ротоглотки и носа, или других мест локализации) возбудителя дифтерии – токсигенные С. diphtheriae. Определение принадлежности штаммов С. diphtheriae к биовару проводится классическим бактериологическим методом – биохимической реакцией разложения крахмала на среде Грисса. Однако результаты проведения биохимической идентификации С. diphtheriae зависят от большого числа факторов, таких как качество питательных сред и реагентов, условий их приготовления, определения рН среды, а также квалификации персонала и др. Поэтому, выявление генетической детерминанты амилазной активности (фрагмента amy гена) в геноме возбудителя дифтерии с помощью ПЦР является более точным и достоверным методом определения принадлежности к биовару, по сравнению с биохимической идентификацией. На основании выявленных особенностей структуры генетической детерминанты, определяющей амилазную активность, нами разработан новый основанный на ПЦР способ, позволяющий дифференцировать штаммы C. diphtheriae по принадлежности к биоварам. На консервативную область аmy гена сконструированы праймеры, фланкирующие фрагмент гена, после амплификации с которыми положительными считались образцы, содержащие специфический светящийся фрагмент и данные штаммы регистрировались как C. diphtheriae биовар gravis (рис. 15). Дорожки 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Рисунок 15. Фотография фрагмента 1,5% агарозного геля, содержащего электрофоретически разогнанные продукты ПЦР с использованием праймеров AmyF1 – AmyR1 к последовательности фрагмента amy гена C. diphtheriae. Примечание: дорожки 1 – маркер молекулярных весов; 2, 4, 7, 9, 10, 11 – ДНК штаммов C. diphtheriae биовара gravis; 3, 5, 6, 8, 12, 13 – ДНК штаммов C. diphtheriae биовара mitis Специфичность, чувствительность и воспроизводимость метода подтверждена при изучении 99 штаммов C. diphtheriae (48 штаммов биовара gravis и 51 штамм биовара mitis), выделенных от больных и бактерионосителей в 80 – 90-е годы прошлого столетия, а также на современном этапе эпидпроцесса дифтерийной инфекции. Сравнительные исследования фенотипических свойств штаммов C. diphtheriae в классическом бактериологическом методе и ПЦР показали 100% корреляцию результатов. Вместе с тем, разработанный способ позволял дифференцировать штаммы C. diphtheriae биовара gravis от штаммов биовара mitis в более короткие сроки (на 1 сутки меньше). Данный метод явился одним из этапов разработки метода ускоренной лабораторной диагностики дифтерии. На разработку способа дифференцирования штаммов C. diphtheriae биовара gravis от штаммов mitis получено положительное решение о выдаче патента от 13.11.2008 г. по заявке № 2007140879/13 (044745). Для оценки возможностей использования разработанных «мишеней» в amy гене в качестве диагностического критерия определения принадлежности к биовару в ускоренной лабораторной диагностике дифтерии предпринята попытка применения мультиплексной амплификационной технологии для выявления возбудителя дифтерии в клиническом материале больных, позволяющей одновременно в одной пробирке определять фрагменты amy гена, ответственного за амилазную активность, и tox гена, кодирующего токсинообразование. Дорожки 1 2 3 4 5 6 7 8 Рис. 16. Фотография фрагмента 1,5% агарозного геля, содержащего электрофоретически разогнанные продукты ПЦР с использованием праймеров DTF – DTR и AmyF1 – AmyR1 к последовательностям фрагментов tox и amy генов C. diphtheriae. Примечание: дорожки 1, 8 – маркер молекулярных весов; 2, 5 – ДНК токсигенных штаммов C. diphtheriae биовара gravis; 3 – ДНК нетоксигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis; 4 –ДНК нетоксигенного штамма C. diphtheriae биовара mitis; 6 – ДНК токсигенного штамма C. diphtheriae биовара mitis; 7 – отрицательный контроль Метод апробирован на 147 штаммах C. diphtheriae, как токсигенных (100 штаммов), так и нетоксигенных (47 штаммов), двух биоваров – gravis (76 штаммов) и mitis (71 штаммов). У токсигенных штаммов C. diphtheriae биовара gravis регистрировали специфический профиль, состоящий из двух фрагментов ДНК с молекулярной массой 634 п.н. и 289 п.н., у токсигенных штаммов C. diphtheriae биовара mitis – фрагмент с молекулярной массой 634 п.н. При отсутствии этих фрагментов в исследуемом образце ДНК, продукты амплификации не регистрировали (рис. 16). Апробирование метода подтвердило специфичность «мишеней» в amy гене для определения биовара gravis и показало возможности использования мультиплексной ПЦР-технологии для диагностических целей. Нами предпринята попытка выделения возбудителя дифтерии по наличию фрагментов tox и amy генов непосредственно в клиническом материале от больных дифтерией. Обследовано 9 больных в возрасте от 28 лет до 60 лет, госпитализированных в ИКБ № 1 (г. Москва). Патологический материал собирали двумя тампонами из ротоглотки и носа для дальнейшего изучения в бактериологическом методе и мультиплексной ПЦР. Дорожки 1 2 3 4 5 6 7 8 Рис. 17. Профили ПЦР-ампликонов образцов клинического материала, полученного от больного (С., 44 года) с подозрением на дифтерию. Примечание: дорожки 1, 8 – маркер молекулярных весов; 2 – ДНК из клинического образца от больного дифтерией (С, 44 года (нос); 3 – ДНК из клинического образца от больного дифтерией (С., 44 года (зев); 5 – положительный контроль – ДНК токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis; 6 – положительный контроль – ДНК токсигенного штамма C. diphtheriae биовара mitis; 4, 7 – отрицательные контроли На рис. 17 представлены результаты обследования больного (С., 44 лет) с подозрением на дифтерию в мультиплексной ПЦР. Положительной считалась проба, имеющая характерный вид профиля, состоящего из двух специфических светящихся фрагментов определенной молекулярной массы. В образцах, содержащих ДНК из клинического образца из носа и ротоглотки больного, регистрировали положительные результаты, что свидетельствовало о наличие в материале от больного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis и подтверждало клинический диагноз «дифтерия ротоглотки и носа». С помощью мультиплексной ПЦР клинический диагноз «дифтерия» удалось подтвердить у трех больных: у больного (С., 44 лет) с диагнозом «комбинированная дифтерия ротоглотки и носа»; у больной (И., 54 лет) с клиническим диагнозом «комбинированная локализованная дифтерия ротоглотки и носа»; у больной (Е., 60 лет) с клиническим диагнозом «токсическая дифтерия ротоглотки II – III степени в комбинации с дифтерией гортани». Для первых двух больных получено бактериологическое подтверждение на 4 сутки, бактериологическое обследование последней больной дало отрицательные результаты. У остальных шести больных, госпитализированных в стационар с подозрением на дифтерию, при поступлении поставлены диагнозы «лакунарная ангина» и при бактериологическом обследовании и в мультиплексной ПЦР получены отрицательные результаты. Проведенное исследование показало возможности использования «мишеней» в amy гене, выявление которых с помощью ПЦР позволяет определять принадлежность к биоварианту, с целью коплексирования в мультиплексной ПЦР для разработки ускоренного метода обследования больных с подозрением на дифтерию. В настоящее время исследования по разработке ускоренного метода лабораторной диагностики дифтерии продолжаются.

Похожие:

	Совершенствование диагностики возбудителей периимплантитов с использованием... Оформление. Портрет писателя; плакат "Приходите в Остер-класс, как-нибудь поучат вас"; книжная выставка "Веселые уроки Григория Остера";...		Тема: патогенные кокки Овладеть основными методами лабораторной диагностики, терапии и профилактики кокковых инфекций
	Молекулярно-генетические и клинико-генотипические особенности муковисцидоза... Работа выполнена в лаборатории генетической эпидемиологии Государственного учреждения Медико-генетического научного центра рамн,...		Отдел лабораторной диагностики иркутск, 2004 Медицинские услуги. Часть VII. Отдел лабораторной диагностики (пособие для врачей) / Составитель д б н., профессор Р. Г. Скворцова...
	Образовательное учреждение высшего профессионального образования Днк-технологий для выявления генов высокой продуктивности и устойчивости к заболеваниям; диагностики болезней животных посредством...		Программа XVIII всероссийской научно-практической конференции «Аналитическая... В. В. Долгов профессор, кафедра клинической лабораторной диагностики Российской медицинской академии последипомного образования
	Рефераты на конференцию не принимаются Физиология, генетика, биохимия, микробиология: молекулярно-генетические, биохимические и физиологические процессы у растений, животных...		Программа рекомендуется для направления подготовки (специальности)... Цель: ознакомление студентов с современными методами лабораторной диагностики и путями повышения качества исследований на базе внедрения...
	Вопросы к экзамену физика и научный метод познания Молекулярно – кинетическая теория. Основные положения молекулярно – кинетической теории. Основная задача молекулярно-кинетической...		Конспект Тема урока: «Москва центр борьбы с ордынским владычеством.... Тип урока: формирование и совершенствование знаний и умений с элементами лабораторной работы
	Некоторые аспекты диагностики tоrch-инфекций в акушерстве Коханского ул., д. 7, г. Чита, 672038, тел. 31-43-23, факс. (302-2) 31-43-24		Краевая паразитология с элементами лабораторной диагностики паразитарных заболеваний
	18. "Основы эпидемиологии и карантинных инфекций" Инфекционные заболевания, источники, причины, пути распространения. Возбудители инфекционных заболеваний. Пути заражения: контактный,...		Грамотрицательные неферментирующие бактерии алгоритмы лабораторной... Тема: Грамотрицательные неферментирующие бактерии – алгоритмы лабораторной диагностики. Значение в патологии человека и санитарной...
	Микробиология, вирусология микробиология полости рта Структуры внутрибольничных инфекций, вызываемых условно-патогенными микробами и оппортунистами		Клинические рекомендации для врачей общей практики острая почечная недостаточность Принципы и алгоритм клинико-лабораторной и инструментальной диагностики заболевания