3.2.1. Гидролизуют О-гликозильные соединения.
3.2.2. Гидролизуют N-гликозильные связи.
3.2.2.5. NAD+-гликогидролаза (. NAD+-нуклеозидаза)
NAD+ + Н2О → никотинамид + ADP-рибоза
В подкласс 3.4 входят ферменты, действующие на пептидные связи (пептидазы). В подподклассы 3.11-3.19 входят экзопептидазы, отщепляющие с N- или С-конца полипептидной цепи аминокислоты, а также дипептидазы и некоторые другие протеолитические ферменты. В подподклассы 3.4.21-3.4.24 и 3.4.99 входят протеиназы – эндопептидазы, расщепляющие небольшое число внутренних пептидных связей в белковой молекуле. Систематической номенклатуры для ферментов данных подподклассов нет, так как они обладают широкой субстратной специфичностью.
3.4.11. Аминопептидазы.
3.4.11.1. Лейцинаминопептидаза.
NH2-Leu-Ala-Glu-Val-Cys-COOH + H2O → L-Leu + NH2-Ala-Glu-Val-Cys-COOH
3.4.13. Дипептидазы.
3.4.13.6. Цистеинилглицин-дипептидаза
NH2-Cys-Gly-COOH + H2O → L-Cys + L-Gly
3.4.17. Металлокарбоксипептидазы.
3.4.17.1. Карбоксипептидаза А.
NH2-Leu-Ala-Val-Ile-Trp-COOH + H2O → L-Trp + NH2-Leu-Ala-Val-Ile-COOH
3.4.21. Сериновые эндопептидазы
3.4.21.4. Трипсин.
Преимущественно расщепляет связи, образованные СООН-группой Арг и Лиз.
3.4.22. Тиоловые (цистеиновые) эндопептидазы.
3.4.22.2. Папаин.
Фермент, выделенный из млечного сока дынного дерева. Преимущественно расщепляет пептидные связи, образованные СООН-группой Арг, Лиз и Фен.
3.4.23. Кислые (аспарагиновые) эндопептидазы. Оптимум рН от 1 до 5.
3.4.23.1. Пепсин.
Преимущественно расщепляет пептидные связи, образованные СООН-группой Фен и Лей.
В подкласс 3.5 входят ферменты, действующие на С-N-связи, отличные от пептидных.
3.5.1. Расщепляют связи в линейных амидах.
3.5.1.2. Глутаминаза
L-Gln + H2O → L-Glu + NH3
3.5.1.5. Уреаза (уреа-амидогидролаза).
NH2-CO-NH2 + H2O → CO2 + 2 NH3
3.5.3. Расщепляют связи в линейных амидинах.
3.5.3.1 Аргиназа (аргинин-амидиназа).
L-Arg + Н2О → L-Orn + NH2-CO-NH2
3.5.4. Расщепляют связи в циклических амидинах.
3.5.4.4. Аденозиндезаминаза.
Аденозин + Н2О → инозин + NH3
В подкласс 3.6. входят ферменты, гидролизующие кислотно-ангидридные связи.
3.6.1. Расщепляют связи в фосфорсодержащих ангидридах.
3.6.1.1. Неорганическая пирофосфатаза.
Н4Р2О7 → 2 Н3РО4
3.6.1.8. АТФаза (АТР-пирофосфатаза).
3.6.1.37. Na,K-АТРаза
3.6.1.38. Са2+-транспортирующая АТРаза (Са насос).
В подкласс 3.7. входят ферменты, действующие на С-С-связи.
В подкласс 3.9. входят ферменты, расщепляющие Р-N-связи.
ЛИАЗЫ
Катализируют реакции негидролитического распада органических соединений по связям С-С, С-N, C-S, C-O, C-P И ДР. При этом образуются двойные связи и выделяются в качестве продуктов СО2, Н2O,NH3 и т.п. Некоторые из этих реакций обратимы и в соответствующих условиях ферменты этого класса могут катализировать синтетические реакции. Систематические названия ферментов данного класса образуются из названия субстрата, затем указывается отщепляемая группа и через дефис добавляется слово лиаза. В тривиальных названиях лиаз указывается особенность участия групп в реакциях – карбоксилаза (присоединение СООН-группы), дегидратаза (отщепление молекулы воды от субстрата). Если необходимо подчеркнуть образование продукта из двух субстратов более простого строения, то в названии лиаз употребляется термин синтаза. В некоторых случаях при негидролитическом расщеплении субстрата может образоваться циклическое соединение.
4.1. Углерод-углерод-лиазы (С-С-лиазы).
4.1.1. Карбоксилазы (декарбоксилазы).
4.1.1.22. Гистидиндекарбоксилаза.
L-His → гистамин + СО2
4.1.1.23. Оротидин-5´-фосфатдекарбоксилаза.
Оротидин-5´-фосфат → UMP + CO2
4.1.2. Альдегид-лиазы.
4.1.2.13.Фруктозо-1,6-дифосфат-триозофосфатлиаза
(фруктозодифосфатальдолаза)
D-фруктозо-1,6-дифосфат ↔
D-глицеральдегид-3-фосфат + диоксиацетонфосфат
4.1.3. Лиазы кетокислот.
4.1.3.7. Цитратсинтаза
Оксалоацетат +ацетилСоА +Н2О → цитрат + SHCоА
4.1.3.8. Цитрат-лиаза.
Цитрат + АТР + SHCоА →
Оксалоацетат + ацетилСоА + АDP + Н3РО4
4.2. Углерод-кислород лиазы (гидролиазы). Ускоряют реакции гидратирования и дегидратирования.
4.2.1. Гидро-лиазы.
4.2.1.2. Фумарат-гидратаза.
Фумарат + Н2О ↔ L-малат
4.2.1.11. Фосфопируват-гидратаза (енолаза).
2-фосфоглицерат → фосфоенолпируват + Н2О
4.3. Углерод-азот лиазы.
4.3.1. Аммиак-лиазы.
4.3.1.3. Гистидин-аммиак-лиаза (гистидаза).
L-His →уроканат + NH3
4.4. Углерод-сера-лиазы.
4.6. Фосфор-кислород-лиазы.
4.6.1. Фосфор-кислород-лиазы.
4.6.1.1. АТР-пирофосфат-лиаза (циклизующая). Аденилатциклаза.
АТР → 3´,5´ –сАМР + Н4Р2О7
4.99. Другие лиазы.
ИЗОМЕРАЗЫ
Катализируют геометрические или структурные изменения в пределах одной молекулы. В результате может осуществляться внутримолекулярный перенос водорода, фосфатных и ацильных групп, изменение пространственного расположения атомных группировок, перемещение двойных связей и т.д. Систематические названия ферментов этого класса образуются по схеме: субстрат - тип реакции изомеризации - изомераза. При внутримолекулярном переносе групп ферменты имеют тривиальное название мутазы. В реакции инверсии групп у хиральных цнгтров – рацемазы и эпимеразы. В класс изомераз входит 6 подклассов и 154 фермента.
5.1. Рацемазы и эпимеразы.
5.1.1. Действуют на аминокислоты и их производные.
5.1.1.1. Аланин рацемаза.
D-Ala ↔ L-Ala
5.1.2. Действуют на гидроксикислоты и их производные.
5.1.2.1. Лактат-рацемаза.
L-лактат ↔ D-лактат
5.1.3. Действуют на углеводы и их производные.
5.1.3..2. UDP-глюкоза-4-эпимераза.
UDP-глюкоза ↔ UDP-галактоза
5.2. Цис-транс-изомеразы.
5.2.1.4. Ретинол-изомераза.
Цис-ретиналь ↔ Транс-ретиналь
5.3. Внутримолекулярные оксидоредуктазы.
5.3.1. Катализируют взаимопревращения альдоз и кетоз.
5.3.1.1. D-глицеральдегид-3-фосфат-кетол изомераза (триозофосфатизомераза).
D-глицеральдегид-3-фосфат ↔ Диоксиацетонфосфат
5.3.1.9. Глюкозо-6-фосфат изомераза (фосфогексоизомераза).
D-глюкозо-6-фосфат ↔ D-фруктозо-6-фосфат
5.3.3. Перемещают С=С-связи.
5.3.3.2. Изопентенилдифосфат изомераза.
Изопентенилдифосфат ↔ Диметилалллилдифосфат
5.4. Внутримолекулярные трансферазы (мутазы).
5.4.2. Фосфотрансферазы (фосфомутазы).
5.4.2.1. 3-фосфоглицерат-фосфомутаза (фосфоглицератмутаза).
3-фосфоглицерат ↔ 2-фосфоглицерат
5.4.99. Перемещают другие группы.
5.4.99.2. МетилмалонилСоА-мутаза.
В12
МетилмалонилСоА ↔ СукцинилСоА
5.5. Внутримолекулярные лиазы.
5.99. Другие изомеразы.
5.99.1. Другие изомеразы.
5.99.1.2. ДНК-топоизомераза. Тип I ДНК-топоизомеразы.
5.99.1.3. ДНК-топоизомеразы (гидролизующие АТР); тип II ДНК-топоизомераз, ДНК-гираза.
ЛИГАЗЫ (СИНТЕТАЗЫ)
Ферменты этого класса катализируют реакции конденсации или присоединения, сопряженные с гидролизом макроэргических связей в молекуле АТР или GTP. Систематические названия ферментов образуются следующим образом: 1) из названия продукта реакции с добавлением термина синтетаза (XY синтетаза); 2) из названий соединяемых субстратов с добавлением термина лигаза. В скобках обязательно указывается продукт, образующийся в результате гидролиза макроэргического соединения /X:Y лигаза (образуящая AMP)/. Класс подразделяется на подклассы в зависимости от того, между какими атомами образуются связи.
6.1. Образуют С-О-связи.
6.1.1. Лигазы, образующие аминоацил-тРНК и родственные соединения.
6.1.1.1. Тирозил-тРНК синтетаза . Тирозин: тРНК лигаза (образующая АМР).
L-Tyr + ATP + tRNAtyr → L-Tyr- tRNAtyr + АМР + Н4Р2О7
6.2. Образуют С-S-связи.
6.2.1. Кислото-тиоловые лигазы.
6.2.1.1. АцетилСоА синтетаза. Ацетат: HSCoA лигаза (образующая ADP).
Ацетат + HSCoA + АТР → АцетилСоА + ADP + Н3РО4
6.3. Образую C-N-связи.
6.3.1. Кислород-аммиак (или амин) лигазы (амидсинтетазы).
6.3.1.2. Глутамат-аммиак лигаза (образующая ADP). Глутаминсинтетаза.
L-Glu + NH3 + ATP → L-Gln + ADP + H3PO4
6.3.4. Другие углерод-азот лигазы.
6.3.4.2. UTP-аммиак лигаза (образ ADP). TP cинтетаза.
UTP + NH3 + ATP → CTP + ADP + H3PO4
6.4. Образующие С-С-связи.
6.4.1. Образующие связи углерод-углерод.
6.4.1.2. АцетилСоА: СО2 лигаза (образующая ADP). АцетилСоА карбоксилаза.
АцетилСоА+ СО2+ АТР → малонилСоА + ADP+ H3PO4
6.5. Образующие фосфоэфирные связи.
6.5.1. Образующие фосфоэфирные связи.
6.5.1.1. ДНК-лигаза (образующая ADP). Полидезоксирибонуклеотид синтетаза (АТР).
Контрольные вопросы
1. Как используют молекулярный кислород в процессе реакции монооксигеназы?
2. Как используют молекулярный кислород в процессе реакции диксигеназы?
3. Какую функцию выполняет тетрагидробиоптерин в гидроксилазных реакциях?
4. Что является промежуточным переносчиком аминогрупп в реакциях, катализируемых аминотрансферазами?
5. К какому классу ферментов относится неорганическая пирофосфатаза?
6. Как формируется шифр фермента, если химизм реакции окончательно не установлен?
7. Почему каталаза не имеет рационального названия?
Тема 1.2. Методы выделения и очистки ферментов
Строение ферментов, их свойства и функции можно исследовать только при наличии их высокоочищенных препаратов, в которых отсутствуют кофакторы, способные модулировать их конформацию, а, следовательно, структурные и функциональные особенности. Получение белка в гомогенном состоянии – сложная задача, поскольку биологический материал, являющийся источником фермента, содержит множество разных белков и их комплексов. Кроме того, трудности получения чистых ферментов связаны с лабильностью белков и опасностью их денатурации, что снижает число возможных методов выделения, хотя близкие свойства белков в их смеси требуют при выделении индивидуальных белков использования разнообразных методов и различных их сочетаний.
Существует три основные проблемы при выделении ферментов:
1. Исходный материал состоит из множества различных соединений, разделение которых сложно вследствие того, что они построены однотипно и мало различаются между собой по физико-химическим характеристикам (растворимости или способности к сорбции на определенном типе сорбента).
2. Работа с биологическим материалом зачастую сопровождается необходимостью работать с очень небольшими количествами исходного вещества, поэтому методы детекции должны быть высокочувствительными.
3. Многие белки обладают очень низкой устойчивостью, хотя необходимо выделение фермента в нативном состоянии с сохранением его биологической активности. Многие ферменты при умеренных температурах и незначительных изменениях рН среды подвержены денатурации, которая обычно сопровождается их инактивацией. Кроме того, в клетках имеются ферменты, способные разрушить те или иные вещества, в первую очередь белки.
Выбор исходного материала для выделения чистых препаратов фермента определяется целью исследования. Для изучения свойств определенных ферментов, безотносительно источника, выбирают наиболее доступный биологический материал, содержащий большие количества фермента. При исследовании специфических ферментов из конкретных источников используют определенный биологический материал независимо от количества в нем исследуемого фермента, что усложняет процесс его выделения и очистки.
Разрушение клеток и экстракция белков
Первым этапом выделения и очистки ферментов является разрушение клеток и экстракция белковых молекул. Для разрушения клеток используют различные методы – осмотический шок, растирание кусочков ткани с кварцевым песком или стеклянными шариками, размельчение гомогенизаторами различных типов (рис. 1.2.1). Метод разрушения клеток и время обработки выбирают в зависимости от типа ткани. Эритроциты обычно подвергают осмотическому шоку. Мягкие ткани (печень, мозг) разрушают с помощью гомогенизатора Поттера. Выбор раствора для экстракции зависит от особенностей белка. Для растворимого белка используют буферные растворы. Для выделения белков, связанных с мембраной, используют детергенты. После экстракции белка гомогенат центрифугируют при 10000-20000 об/мин для удаления нерастворимого осадка. Полученная надосадочная жидкость (супернатант) называется экстрактом.
 
а б
Рис.1.2.1. Ультразвуковой гомогенизатор (а), магнитный гомогенизатор (б)
После получения экстракта, содержащего исследуемый фермент, его подвергают очистке. Все методы разделения смесей основаны на том, что разделяемые компоненты в результате каких-либо манипуляций оказываются в разных участках системы и могут быть механически отделены друг от друга. Выделение индивидуальных белков является ступенчатым процессом, т.к. на первых этапах очистки фракции содержат множество примесей. На каждой ступени разделения должна получаться фракция более богатая необходимым веществом, чем предыдущая. Такой процесс часто называют фракционированием. На каждой стадии разделения белок находится либо в виде раствора, либо в виде осадка.
Диализ
Непосредственно перед очисткой ферментов белковые растворы концентрируют. Это можно осуществить методами: а) осаждения с последующим растворением в меньшем объеме; б) адсорбции на ионообменнике с последующей элюцией; в) ультрафильтрации. После или до концентрирования белковых препаратов проводят их диализ, в результате чего из образца с помощью полупроницаемой мембраны удаляются низкомолекулярные соединения, которые замещаются буфером. При диализе молекулы растворенного низкомолекулярного вещества проходят через полупроницаемую мембрану, а неспособные диализировать коллоидные частицы остаются в ней (рис. 1.2.2). Простейший диализатор представляет собой мешочек из коллодия (полупроницаемого материала), в котором находится диализируемая жидкость. Мешочек погружают в растворитель. Постепенно концентрация диализирующего вещества в диализируемой жидкости и растворителе становятся равными. Меняя растворитель, можно добиться практически полной очистки от нежелательных примесей. Скорость диализа крайне низка. Для ускорения диализа увеличивают площадь мембраны, повышают температуру и осуществляют непрерывную смену растворителя. Экстракт, прошедший диализ, называю диализатом.
Рис. 1.2.2. Простейшая система для диализа
Тепловая денатурация
На начальном этапе очистки для разделения белков иногда используют тепловую обработку. Она эффективна, если белок относительно устойчив в условиях нагревания, в то время как сопутствующие белки денатурируют. При этом варьируют рН раствора, продолжительность обработки и температуру.
После проведения первых этапов очистки белки в экстракте отличаются друг от друга растворимостью, молекулярной массой, величиной суммарного заряда молекулы, относительной стабильностью и т.д. Эти различия используют для дальнейшего разделения белков.
Осаждение белков
Классическим методом разделения белков является метод их разделения на основе различной растворимости. Для осаждения необходимо понизить каким-либо способом растворимость белка. В целом растворимость белков зависит от их способности к гидратации. У глобулярных водорастворимых белков высокий уровень гидратации обеспечивается расположением гидрофильных групп на поверхности. Добавление органических растворителей понижает степень гидратации и приводит к осаждению белка. Принцип такого метода заключается в том, что по мере возрастания концентрации органического растворителя снижается способность воды к сольватации заряженных гидрофильных молекул фермента. Происходит снижение растворимости белков до уровня, при котором начинается их агрегация и осаждение. Важным параметром, влияющим на осаждение, является размер молекулы белка. Чем больше молекула белка, тем ниже концентрация органического растворителя, вызывающая осаждение белка.
Осаждают белки также с помощью солей, например, сульфата аммония. Этот способ называют высаливанием. Высаливание при добавлении необходимого количества соли – эффективный способ концентрирования. Принцип этого метода основан на том, что при повышении концентрации соли в растворе происходит сжатие ионных частиц, образуемых противоионами белка, что способствует сближению их до критического расстояния, на котором межмолекулярные силы ван-дер-ваальсова притяжения перевешивают кулоновские силы отталкивания противоионов. Это приводит к слипанию белковых частиц и их выпадению в осадок.
Для выделения белков применяют также метод изоэлектрического осаждения. Заряд белков обусловлен в первую очередь остатками аспаратата и глутамата (отрицательный заряд) и остатками лизина и аргинина (положительный заряд). По мере повышения рН различными способами заряд белков изменяется от положительных до отрицательных значений и в изоэлектрической точке оказывается равен нулю, вследствие чего белок лишается своей ионной атмосферы и его частицы слипаются, выпадая в осадок.
Выпавший осадок белка отделяют фильтрацией или центрифугированием. Частицы осажденного вещества под действием центробежной силы оседают на дне центрифужных стаканов и сжимаются в плотный осадок. Скоростные центрифуги (ультрацентрифуги) создают центробежное ускорение порядка 100000g, что позволяет осаждать крупные надмолекулярные агрегаты – рибосомы и вирусы.
Гель-фильтрация
С помощью метода гельфильтрации можно быстро разделить белки в соответствии с их размерами. Носителем для хроматографии является гель, который состоит из поперечно-сшитой трехмерной молекулярной сетки, сформированной в виде гранул. Чем больше поперечных сшивок, тем меньше размеры отверстий. Гель играет роль молекулярного сита. При пропускании раствора через колонку, наполненную гранулами сефадекса, крупные частицы, размер которых превышает размер пор сефадекса, будут двигаться быстро. Мелкие молекулы будут двигаться медленно, поскольку в процессе движения будут проникать внутрь гранул (рис. 1.2.3).
а б в
Рис. 1.2.3. Схема разделения белков методом гель-фильтрации. а – начало разделения, б – разделение, в – конец разделения. Большие кружки – частицы геля, большие точки – молекулы белков с большой молекулярной массой, маленькие точки – молекулы белков с меньшей молекулярной массой.
Разделение белков путем адсорбции
Белки обладают способностью избирательно адсорбироваться на твердых фазах. Поэтому для разделения белков широко используются адсорбционные методы, особенно колоночная хроматография (рис. 1.2.4).
Применение этих методов позволяет получить наибольшую степень очистки белков. Важнейшими адсорбентами белков являются ионообменники. Белки связываются ионообменником с помощью электростатических сил между заряженными поверхностями белков и кластерами заряженных групп на ионообменнике. При разделении белков и их анализе используется жидкостная хроматография.
В жидкостной хроматографии зона разделяемых веществ с помощью тока элюирующей (вымывающей) жидкости перемещается относительно неподвижной фазы, которая обладает разным сродством к разделяемым компонентам.
Рис. 1.2.4. Схема колоночной адсорбционной хроматографии. Разделение двух разных веществ (А и В), перемещающихся по колонке с разной скоростью. 1 – нанесение образца на колонку; 2 – середина опыта; 3 – окончание опыта.
При перемещении зоны с помощью тока элюента каждый из разделяемых компонентов проводит некоторую часть времени на неподвижной фазе. Чем больше это время, тем медленнее перемещается зона с разделяемой смесью. Основной принцип хроматографического разделения приведен на рис. 1.2.5.
Рис. 1.2.5. Основной принцип хроматографического разделения: НФ – слой неподвижной фазы, покрывающей внутреннюю поверхность капиллярной трубки Т, через которую течет подвижная фаза (ПФ). Компонент А1 разделяемой смеси обладает большим сродством к подвижной фазе, а компонент А2 – к неподвижной фазе. А'1 и А'2 – положения зон тех же компонентов через промежуток времени, за которое происходило хроматографическое разделение в направлении, указанном стрелкой.
Выбор ионообменника
Выбор ионообменника определяется изоэлектрической точкой выделяемого белка. При значениях рН буфера ниже изоэлектрической точки белок имеет положительный заряд и адсорбируется на катионообменнике и,
наоборот. Обычно условия адсорбции выбирают эмпирически, так как чаще всего изоэлектрическая точка белка неизвестна, хотя ее можно определить путем изоэлектрического фокусирования. На рис. 1.2.6 представлено схематическое изображение частицы ионообменной смолы.
Рис. 1.2.6. Изображение структуры частицы ионообменной смолы. Черные кружки – заряженные функциональные группы, ковалентно связанные с нитями решетки; белые кружки – свободно перемещающиеся противоположно заряженные противоионы, электростатически связанные с частицей смолы, способные претерпевать обмен с другими ионами.
Элюция адсорбированного белка
Элюцию белков с колонки можно осуществить изменением рН буфера до величины, при которой связывание белков с адсорбентом ослабевает, кроме того, повышением ионной силы буфера, что вызывает ослабление электростатического взаимодействия между белком и адсорбентом.
Аффинная хроматография
При аффинной хроматографии используют иммобилизованный на адсорбенте лиганд, осуществляющий специфический отбор белков, связывающихся с этим лигандом. После адсорбции фермент либо элюируют неспецифически (повышением концентрации соли) либо специфически (замещением белка лигандом) из раствора.
Гидрофобная хроматография
Метод гидрофобной хроматографии основан на связывании гидрофобного участка на поверхности белковой глобулы с алифатической цепью адсорбента. Гидрофобные взаимодействия усиливаются с повышением концентрации соли. При высаливании основной причиной агрегации является усиление гидрофобных взаимодействий между белками – при высоких концентрациях соли большинство белков будут адсорбироваться на гидрофобных группах, связанных с матрицей. Элюцию белков проводят с понижающимся градиентом концентрации соли. Белки, которые прочно адсорбируются, обычно удаляют с колонки добавлением в элюирующий раствор этиленгликоля.
Металлохелатная аффинная хроматография
Металлохелатная аффинная хроматография является наиболее распространенным методом очистки рекомбинантных белков. Один из приемов металлохелатной аффинной хроматографии основан на том, что некоторые аминокислоты, в частности, гистидин, способны формировать комплексы с ионами металлов. После иммобилизации на хроматографической фазе хелатирующих групп, целевой рекомбинантный белок, содержащий блок из нескольких остатков гистидина связывается с хроматографической фазой, после чего сопутствующие белки отделяются, и проводится элюция целевого белка. Кроме блока из остатков гистидина, целевой рекомбинантный белок может содержать последовательности глутатион-S-трансферазы, S-белка и других, при этом принципы хроматографического выделения целевого рекомбинантного белка остаются теми же. Недостатком метода является то, что создание соответствующего сорбента для этого вида хроматографии требует значительных усилий и сопряжено с серьезными методическими трудностями. В процессе эксплуатации сорбента происходит "вымывание" ионов металла из активных центров носителя, что сопровождается ухудшением его сорбционных характеристик.
Высокоэффективная жидкостная хроматография
Отличительной особенностью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) является наличие в аппаратуре специальных насосов, позволяющих с высокой скоростью продавливать жидкую фазу через колонку, имеющую диаметр частиц от 3 до 15 мкм, а также наличие высокочувствительных детекторов для обнаружения разделенных веществ. Хроматографы для ВЭЖХ включают несколько блоков: дегазатор (для удаления растворенного кислорода из растворителей), насос, термостат, детектор (УФ, рефрактометр и др.) (рис. 1.2.7). На хроматограф могут быть установлены различные колонки: ионообменные, гельфильтрационные, гидрофобные и др.
При разделении высоколабильных белков высокое давление нежелательно, поэтому применяют хроматографию при среднем давлении.
Рис. 1.2.7. Схема высокоэффективного жидкостного хроматографа. 1 – резервуар для элюента, 2 – насос, 3 – инжектор для ввода пробы, 4 – колонки для ВЭЖХ, 5 – термостат, 6 – детектор с проточной кюветой, 7 – регистрирующая система, 8 – персональный компьютер.
Электрофорез
Электрофорез считается очень эффективным способом разделения белков. Принцип разделения белков методом электрофореза заключается в том, что молекула белка в растворе при любом рН, отличающемся от ее изоэлектрической точки, имеет заряд. Это приводит к тому, что белок движется в электрическом поле. Движущая сила определяется величиной напряженности электрического поля Е умноженной на суммарный заряд частицы z. Этой силе противостоят силы вязкости среды, пропорциональные коэффициенту вязкости η, радиусу частицы r (стоксовскому радиусу) и скорости v.
E∙z = 6πηrv
Удельная подвижность:
u = z / 6πηrv
Таким образом, молекулы приобретают разные скорости в зависимости от величины заряда и размеров.
После отключения тока гель помещают в специальный раствор, где интересующие исследователя белки окрашиваются. Существует электрофорез в растворе, но он имеет ограниченное применение, т.к. исследуемые белки часто подвергаются значительному диффузионному размыванию. Однако сейчас стало возможным применять этот метод в условиях невесомости в космосе, что устраняет конвекционные токи, обуславливающие диффузионную размывку.
Изоэлектрическое фокусирование
Метод изоэлектрического фокусирования заключается в создании системы с градиентом рН. Белки, движущиеся в электрическом поле, достигают в этой системе такой области, в которой значение рН равно их изоэлектрической точке. При этом значении суммарный заряд белка равен нулю и он не способен перемещаться в электрическом поле. Изоэлектрическое фокусирование обладает наивысшей разрешающей способностью при разделении смеси белков, хотя этот метод не позволяет разделить белки по величине их молекул. При изоэлектрическом фокусировании диффузия ограничена. Как только белковая молекула диффундирует и попадает в зону, отличающуюся по значению рН от ее изоэлектрической точки, она получает заряд и мигрирует в обратном направлении.
Капиллярный электрофорез
В настоящее время одним из наиболее перспективных методов анализа становится капиллярный электрофорез. Система капиллярного электрофореза включает кварцевый капилляр, источник высокого напряжения, устройство ввода пробы, детектор и устройство вывода информации. В капилляре компоненты пробы, имеющие заряды, перемещаются в соответствии с их электрофоретическими подвижностями. Таким образом, происходит разделение исходной смеси, и на выходе капилляра вблизи анода формируются зоны, содержащие индивидуальные компоненты. Появление компонентов регистрируется с помощью детектора. Полученная запись называется электрофореграммой.
Двумерные системы электрофореза
Все описанные выше методы зонального разделения являются одномерными, разделение в них происходит в одной координате. Наряду с этим применяются двумерные системы разделения на пластинах. При этом разделяемую смесь в виде пятна наносят на один из углов и разделяют в одном направлении. Затем какие-либо параметры, определяющие разделяющую способность системы, изменяют и проводят разделение в перпендикулярном направлении. При удачном подборе системы и условий разделения удается разделить те компоненты, которые не разделились при первой процедуре. Комбинации методов могут быть довольно разнообразны: двумерная хроматография с использованием в разных направлениях разных элюентов, хроматография в одном, а электрофорез – в другом направлении (рис. 1.2.8).
Рис. 1.2.8. Схематическое представление хода двумерного электрофореза
Для сложных смесей белков используется разделение в направлении, перпендикулярном первому. Таким образом, в первом направлении белки разделяются в соответствии с их изоэлектрическими точками, а во втором – в соответствии с размерами субъединиц. Этот метод позволяет разделить одновременно до 5000 белков.
Кристаллизация белков
Кристаллизация белков используется, 1) как завершающая стадия очистки белков; 2) для доказательства гомогенности белков; 3) как метод стабилизации белков при хранении; 4) для определения третичной структуры белков методом рентгеноструктурного анализа.
Кристаллы растут из пересыщенных растворов вследствие агрегации высокоупорядоченным способом (рис. 1.2.9), кроме того, могут образовываться и в очень разнородных смесях белков. Если примеси не находятся в пересыщенном состоянии, то агрегировать будет тот белок, который присутствует в этом состоянии, и будут образовываться его кристаллы. Чтобы началась кристаллизация, необходимо создать такие условия, в которых белковый раствор становится перенасыщенным, что приводит к белок-белковой агрегации. Для этого используют осадители (вещества, уменьшающие растворимость): сульфат аммония, полиэтиленгликоль, органические растворители.
Рис.1.2.9. Кристаллы белка каталазы
Доказательства гомогенности белка
Исследование особенностей строения и свойств фермента начинают после доказательства гомогенности белкового препарата. Для доказательства гомогенности белка используют: электрофорез; определение молекулярной массы с помощью масс-спектрометрии; метод изоэлектрофокусирования; ультрацентрифугирование; аминокислотный анализ; кристаллизацию.
Контрольные вопросы
1. Какие детекторы используются в ВЭЖХ? На чем основан принцип их действия?
2. Опишите методы протеомики.
3. Что такое функциональная и структурная протеомика?
4. Как осуществляется протеомный анализ молекулярных взаимодействий?
5. В чем заключается принцип определения белков с помощью масс-спектрометрии?
Тема 1.3. Методы изучения уровней структурной организации ферментов
Контрольные вопросы
Опишите принцип работы автоматического аминокислотного анализатора.
Какие методы определения N-концевых аминокислотных остатков в полипептидной цепи Вы знаете?
Какие методы определения С-концевых аминокислотных остатков в полипептидной цепи Вы знаете?
С помощью каких методов можно определить местоположение дисульфидных связей?
Что такое метод фингерпринта?
Какие ферменты используются для фрагментации полипептидной цепи?
Что такое метод перекрывающихся пептидов?
Для изучения пространственной конформации белка, какие используются методы?
Чем можно вызвать диссоциацию олигомерного белка на протомеры?
Раздел 2. Ферментативный катализ
|
