Методические указания к самостоятельной работе Специальность 020208. 65 Биохимия
Скачать 0.7 Mb.
|
| Тема 2.1. Механизм действия оксидоредуктаз на примере алкогольдегидрогеназы Контрольные вопросы
Тема 2.2. Специфичность сериновых протеиназ Механизм действия гидролаз на примере лизоцима Лизоцим – фермент относительно небольшого размера, расщепляющий полисахаридный компонент клеточных стенок бактерий. По своей структуре указанный полисахарид представляет собой чередующийся полимер остатков N-ацетилглюкозамина (NAG) и N-ацетилмурамовой кислоты (NAM), соединенных гликозидными связями β (1→4) (рис. 21 и 22).  Рис. 21. Углеводные остатки в полисахариде клеточных стенок бактерий Лизоцим гидролизует глизозидную связь между С-1 остатка NAM и С-4 остатка NAG. Олигомеры N-ацетилглюкозамина также гидролизуются лизоцимом. При этом гекса-NАG и более длинные полимеры легко расщепляются ферментом, тогда как три-NАG и ди-NАG гидролизуютсяс крайне малой скоростью. Три-NАG – сильный конкурентный ингибитор фермента.  Рис. 22. NAM связана с NAG гликозидной связью β(1→4) Трехмерная структура лизоцима и его комплекса с три-NАG изучена на атомарном уровне. Исследования были проведены в 1965г. Д. Филлипсом с сотрудниками. Установлено, что три-NАG занимает половину щели, идущей поперек молекулы фермента, с которым он связывается большим количеством водородных связей (рис. 23) и вандерваальсовых взаимодействий. На основе данных о структуре комплекса лизоцима с три-NАG была построена модель, предсказывающая, как связывается с лизоцимом его эффективный субстрат гекса-NАG.  Рис. 23. Водородные связи между три NAG и лизоцимом. Участвующие в образовании водородных связей химические группы субстрата показаны синим, соответствующие группы фермента – красным. На основании структурных данных Д. Филлипсом с сотрудниками предложена гипотеза механизма каталитического действия лизоцима; суть гипотезы состоит в следующем. Первое: критическими группами для катализа являются неионизированная карбоксильная группа остатка глутамата-35 и карбоксилат-ион аспартата-52. Обе группы расположены на расстоянии около 0,3 нм от гидролизуемой гликозидной связи, а именно связи между остатками D и Е гексамерного субстрата. Нужно отметить, что буквами D, E и F обозначили три дополнительных остатка сахара, поместившихся в щели на ферменте при тщательном построении моделей. Второе: глутамат-35 отдает Н+ связи между С-1 кольца D и гликозидным атомом кислорода, что приводит к разрыву этой связи (рис. 24).  Рис. 24. Первый этап постулированного механизма действия лизоцима - перенос Н+ от Glu 35 на атом кислорода гликозидной связи и образование иона карбония С-1 кольца D становится положительно заряженным; такая переходная форма называется ионом карбония. Третье: ион карбония реагирует с ОН¯-группой растворителя, а глутамат-35 присоединяет водород, возвращаясь в исходную протонированную форму (рис. 25).  Рис. 25. Реакция гидролиза завершается присоединением ОН¯ к промежуточно образовавшемуся иону карбония и Н+ к боковой цепи Glu 35 После того как продукты реакции удаляются от фермента в результате диффузии, лизоцим готов к новому каталитическому циклу. Четвертое: скорость катализа значительно увеличивается под действием двух факторов, способствующих промежуточному образованию иона карбония: это электростатический фактор, а именно близость отрицательно заряженной боковой цепи аспартата-52 и геометрический фактор, состоящий в том, что кольцо D деформируется, приобретая конформацию полукресла, что приводит к распределению положительного заряда иона карбония между С-1 и атомом кислорода углеводного кольца (рис. 26).  Рис. 26. Измененме конформации кольца D субстрата лизоцима в конформацию полукресла На рис. 26 под буквой А обозначен углеводный остаток в обычной конформации кресла, под Б – при связывании с лизоцимом атом кислорода кольца и С-5 в углеводном остатке D перемещаются так, что С-1, С-2, С-5 и оказываются в одной плоскости, как это показано под буквой В. Контрольные вопросы 1. Строение, свойства и биологическая роль лизоцима? 2. Субстраты лизоцима? 3. Каким образом была построена модель, предсказывающая, как связывается с лизоцимом его эффективный субстрат гекса-NАG.? 4. В чём состоит суть гипотезы механизма каталитического действия лизоцима, предложенная Д. Филлипсом с сотрудниками? 5. Что такое ионом карбония? 6. Каким образом электростатический фактор способствует промежуточному образованию иона карбония? 7. Каким образом геометрический фактор способствует промежуточному образованию иона карбония? Раздел 3. Регуляция активности и компатментализация ферментов Тема 3.1. Сходство и отличия мультиферментных комплексов от мультиферментных конъюгатов Контрольные вопросы 1. Что такое мультиферментный комплекс? 2. Что такое мультиферментный коньюгат? 3.Пируватдегидрогеназный комплекс – это мультиферментный комплекс или коньюгат? 4. Синтаза жирных кислот – это мультиферментный комплекс или коньюгат? 5. В чём сходства и отличия мультиферментного комплекса и коньюгата? Тема 3.2. Белок-белковые взаимодействия в регуляции активности ферментов Контрольные вопросы 1. Приведите примеры ферментов, в регуляции, активности которых принимают участие белок-белковые взаимодействия? 2. Какова структура протеинкиназы А? 3.Что такое псевдосубстратная последовательность в структуре протеинкиназы А? 4. Какое соединение является сигналом, приводящим к отделению регуляторных субъединиц от каталитических в протеинкиназе А? 5. В чём сходства и отличия мультиферментного комплекса и коньюгата? Раздел 4. Прикладное значение ферментов Тема 4.1. Создание ферментов с заданными свойствами путем сайт-специфического мутагенеза Контрольные вопросы 1. Что такое сайт-специфическй мутагенез? 2. В чём преимущества сайт-специфического мутагенеза перед другими классическими методами мутирования? 3. Какие мутации можно получить при использовании направленного мутагенеза? 4. В чём отличия сайт-специфическй мутагенеза от сегмент-специфического? 5. Каким образом может быть использован сайт-специфическй мутагенез для изучения механизмов катализа, субстратной специфичности ферментов, стабильности полипептидов? 6. Приведите пример создания фермента с заданными свойствами методом сайт-специфического мутагенеза с использованием эндонуклеаз рестрикции? 7. Приведите пример создания фермента с заданными свойствами методом сайт-специфического мутагенеза с использованием сайт-специфического олигонуклеотид-направленного мутагенеза? 8. В чём приемущества и недостатки использования сайт-специфического мутагенеза с применением эндонуклеаз рестрикции? III. НАПИСАНИЕ И ЗАЩИТА РЕФЕРАТА При изучении курса «Энзимология» студент должен подготовить реферат по одной из предложенных преподавателем тем или предложить свою тему. Темы рефератов и задания по их написанию выдаются лектором на первой лекции вместе со списком учебной литературы. Указания по написанию реферата. Одной из форм самостоятельной работы студентов является написание реферата. Реферат – краткое описание рецензируемых текстов с набором ключевых понятий и основных положений. Работа над рефератом способствует повышению общей и профессиональной эрудиции студентов. Реферирование может быть посвящено отдельной проблеме или содержать обобщение разных точек зрения по определенной теме. Автор реферата определяет свое отношение к рассматриваемым научным позициям, взглядам или определениям, принадлежащим различным авторам. Реферат должен представлять собой научную ценность, поэтому подход студента к написанию реферата должен иметь исследовательский характер. При подготовке реферата следует использовать монографии, обзоры и оригинальные научные статьи. Выполнение реферативных работ осуществляется в несколько этапов: выбор темы, составление плана, проработка литературных источников с их анализом, написание и защита реферата. Тема реферата выбирается из рекомендованного списка или по предложению студента (с согласия преподавателя). Рекомендуемый объём реферата – около 20 страниц компьютерного набора через 1,5 интервала. Высота букв (кегль) – 14. Текст должен быть напечатан на одной стороне стандартного листа белой бумаги формата А4 (210 х 297 мм). Страницы должны иметь поля: левое – 30 мм; верхнее – 25 мм; правое – 15 мм; нижнее – 20 мм. Страницы нумеруются вверху (от центра). К реферату прилагается презентационный материал, включающий около 10 слайдов. Структура реферата и правила оформления рисунков, схем, цитируемой литературы аналогичны требуемым для курсовых и дипломных работ. Примерные темы рефератов*. 1. Иммобилизованные ферменты. Методы получения, применение в промышленности и медицине. 2. Основные типы биолюминесцентных систем. Биолюминесцентный анализ активности ферментов. 3. Протеолитические ферменты – строение, активация, механизм действия. 4. Пути создания биологических катализаторов с заданными свойствами. 5. АDР- рибозилирование ферментов как механизм изменения их активности. 6. Аминотрансферазы – строение, свойства, роль в метаболизме аминокислот. 7. Изоферменты – классификация, номенклатура, роль в метаболизме. 8. Фосфофруктокиназа – аллостерический поливалентный фермент. 9. Протеинкиназы, строение, механизм действия и биохимические функции. 10. Белок-белковые взаимодействия как механизм регуляции активности ферментов. 11. Особенности функционирования и регуляции мембранносвязанных ферментов. 12. Цитохромы Р450. Строение, механизм действия и биохимические функции. 13. ДНК-полимераза I. Строение, механизм действия, роль в процессе репликации. 14. Аспартокиназа – гомосериндегидрогеназа как пример бифункционального фермента. Строение, функции, регуляция. 16. Мультиферментные комплексы: строение и функционирование пируватдегидрогеназного комплекса. * Студенту предоставлено право выбора темы реферата, при условии что он будет написан на основе изучения оригинальной научной литературы. IV. ЗАДАНИЯ И ЗАДАЧИ Пример решения задачи Задача. Активный центр фермента обычно представляет собой "карман" на поверхности фермента, выстланный боковыми цепями аминокислот, необходимыми для связывания субстрата и катализа его химического превращения. Молекула карбоксипептидазы, последовательно отщепляющей С-концевые аминокислотные остатки от субстратов (пептидов), состоит из одной полипептидной цепи (307 аминокислотных остатков (АО)). Три главные каталитические группы в активном центре – это аргинин 145, тирозин 248 и глутаминовая кислота 270 (номер указывает положение аминокислоты в цепи). а) Если бы карбоксипептидаза представляла собой идеальную -спираль, то на каком расстоянии (в нм) друг от друга находились бы аргинин 145 и тирозин 248, аргинин 145 и глутаминовая кислота 270? б) Объясните, каким образом эти три аминокислоты, расположенные так далеко друг от друга в полипептидной цепи, могут катализировать реакцию, участники которой занимают пространство размером в несколько десятых долей нанометра. в) Если в процессе гидролиза участвуют только эти три каталитические группы, для чего ферменту необходимо иметь так много аминокислотных остатков? Решение. а) Сначала найдём расстояние между аргинином 145 и тирозином 248 в АО: 248 – 145 = 103 АО. Затем выразим найденное расстояние из АО в нм, учитывая то, что шаг -спирали соответствует периоду 0,54 нм или 3,6 АО. Для этого составим пропорцию: 0,54 нм --- 3,6АО X нм --- 103АО Откуда X = 0,54*103/3,6=15,5нм (расстояние между аргинином 145 и тирозином 248). Аналогично найдём расстояние между аргинином 145 и глутаминовой кислотой 270 в АО: 270 – 145 = 125 АО. Затем выразим найденное расстояние из АО в нм. Для этого составим пропорцию: 0,54 нм --- 3,6 АО X нм --- 125 АО Откуда X = 0,54*125/3,6=18,8 нм (расстояние между аргинином 145 и глутаминовой кислотой 270). б) При образовании трёхмерной конформации фермента эти аминокислоты оказываются в непосредственной близости друг от друга. в) Белок служит «каркасом», поддерживающим каталитичсекие группы в правильной ориентации. Примерный перечень используемых задач Раздел 1.Структура и свойства ферментов 1. Из экстракта, содержащего 500 мг общего белка и 100 ед. активности фермента, получен препарат, содержащий 2 мг белка и 80 ед. активности. С каким выходом (по активности) получен фермент и какова степень его очистки? 2. Дана смесь белков:
Предложите методы разделения белков и укажите последовательность их выделения из смеси. 3. При каких значениях рН наиболее целесообразно электрофоретическое фракционирование: а) миозина и гемоглобина; б) уреазы и гемоглобина; в) щелочной фосфатазы, сывороточного альбумина и уреазы; г) цитохрома с и гемоглобина, если изоэлектрическая точка миозина – 5,4; щелочной фосфатазы – 4,5; гемоглобина – 6,8; уреазы – 5,0; цитохрома С – 10,65? 4. Используя обозначения: К – катод, А – анод, С – линия старта, укажите направление перемещения при электрофорезе следующих белков: а) тропомиозина – в буферной системе с рН 5,1; б) гемоглобина – рН 4,8; в) рибонуклеазы – рН 4,2; 9,5; 11,3; учитывая, что изоэлектрическая точка тропомиозина – 5,1; гемоглобина – 6,8; рибонуклеазы – 9,45. 5. Как изменится электрофоретическая подвижность белка (изоэлектрическая точка его равна 6,8; фракционирование ведется при рН 7,0), если в его молекуле: а) глу заменен на вал; б) лиз заменен на глу; в) глу заменен на лиз; г) вал заменен на глу; д) гис заменен на арг? 6. Токсический эффект тяжелых металлов, например Cd2+ и Hg2+, объясняется тем, что они могут замещать Zn2+ в активном центре определенных ферментов. Приведите примеры ферментов, в активном центре которых содержатся металлы, и объясните: а) как при этом изменяется активность ферментов и почему; б) почему при этом изменяется скорость транскрипции, а также снабжение клеток кислородом. 7. В двух пробах за 10 мин гидролизовалось равное количество крахмала: в первой пробе количество амилазы 2 мг, во второй – 5 мг. Одинакова ли активность амилазы в обеих пробах? 8. В гомогенатах печени двух крыс обнаружена одинаковая удельная активность фруктозо-l,6-бисфосфатазы. Одинаковое ли количество этого фермента содержится в 1 г печени обеих крыс? Почему вы так считаете? а) дайте определение удельной активности фермента, объясните, какова размерность этой величины; б) напишите реакцию, которую катализирует фермент, назовите вещества, которые могут повлиять на ак тивность этого фермента в печени. 9. Рассмотрите схему ферментативной реакции. Сравните структурные формулы субстрата и продукта:  а) Назовите класс фермента, катализирующего данную реакцию. б) С участием какого кофермента протекает реакция? Напишите формулу витамина, входящего в его состав. в) Рассчитайте удельную активность фермента, если за 30 с 1 мг фермента при оптимальных условиях инкубации (рН 7,2; 37 0С) превращает 50 мкмоль пирувата. 10. Добавление адреналина к гомогенату или препарату разрушенных клеток здоровой печени приводит к увеличению активности гликогенфосфорилазы. Однако если гомогенат предварительно центрифугировать при высокой скорости и затем к прозрачной надосадочной жидкости добавить адреналин или глюкагон, то увеличения фосфорилазной активности не наблюдается. Объясните причину данного явления. 11. При длительном приеме антибиотиков и сульфаниламидов происходит угнетение микрофлоры кишечника, участвующей в синтезе пиридоксина. Скорость каких реакций в клетках уменьшится и почему? а) напишите несколько реакций, для протекания которых необходим пиридоксин; б) какое значение имеют эти реакции для организма человека? 12. Напишите схемы реакций, назовите ферменты, ускоряющие указанные реакции, и определите класс ферментов: А) Глюкоза + АТР → Глюкозо-6-фосфат; Б) Глюкозо-1-фосфат → Глюкозо-6-фосфат; В) Молочная кислота + NAD+ → Пировиноградная кислота + NADН + Н+; Г) Аланин + Н2О → Молочная кислота + NH3. 13. Назовите по рациональной номенклатуре ферменты, катализирующие гидролиз: а) дипептида; б) лактозы; в) сахарозы; г) амилозы. 14. Инкубационная проба объёмом 3 мл содержит 2,75 мл. буфера, 200 мкл субстрата с конечной концентрацией 0,3 мМ и 50 мкл кофермента с конечной концентрацией 0,2 мМ. Рассчитайте начальные концентрации субстрата и кофермента. |
Похожие:
 | Методические указания к самостоятельной работе Специальность 020208. 65 Биохимия Учебное пособие предназначено для студентов, обучающихся по специальности «Биохимия» | | Методические указания к самостоятельной работе (для специальности биохимия) Б 545 Безопасность жизнедеятельности: методические указания к самостоятельной работе [Текст ] / cост. О. А гусейнов. – Красноярск:... |
 | Методические указания к самостоятельной работе (для специальности 020208. 65 «биохимия») Самостоятельная работа студентов включает блоки индивидуальной практики языковых и речевых умений по всем модулям курса, а также... | | Учебно-методическое пособие по самостоятельной работе Специальность... Большой практикум. Раздел «Свободнорадикальные процессы в биологических системах»: Учебно-методическое пособие по самостоятельной... |
| Методические указания к самостоятельной работе Красноярск Методические указания предназначены для студентов, обучающихся по специальности «Биохимия» | | Биохимия тканей Биохимия тканей: методические указания к самостоятельной работе [Текст ] / cост. Е. В. Инжеваткин – Красноярск: Сибирский федеральный... |
| Методические указания к самостоятельной работе студентов Специальность... Денисова Т. Ю. Мировой опыт художественной культуры в связях с общественностью: Методические указания к самостоятельной работе студентов.... | | Учебно-методическое пособие к самостоятельной работе Специальность 020208. 65 Биохимия Учебно-методическое пособие предназначено для студентов биологических и медико-биологических специальностей университетов |
| Методические указания к самостоятельной работе Красноярск Человек: основы антропологии: методические указания к самостоятельной работе [Текст ] / cост Е. В. Инжеваткин. – Красноярск: Сибирский... | | Методические указания по самостоятельной работе студентов Красноярск... Методические указания предназначены для студентов специальности 012300 Общая биохимия. В учебном пособии представлена структура дисциплины,... |
| Методические указания по самостоятельной работе студентов содержат... М 20 Математическое моделирование биотехнологических процессов: Методические указания к самостоятельной работе [Текст] / сост. П.... | | Методические указания по самостоятельной работе Красноярск ... |
| Методические указания по самостоятельной работе красноярск 2013 удк... Методические указания предназначены для студентов, обучающихся по направлению 020400. 68 «Биология» (магистерские программы: 020400.... | | Методические указания для самостоятельной работы студентов по дисциплине «Антропология» Антропология: методические указания к самостоятельной работе [Текст ] / cост Е. В. Инжеваткин. – Красноярск: Сибирский федеральный... |
| Методические указания по самостоятельной работе студентов Методические указания предназначены студентам для выполнения самостоятельной работы по дисциплине «Вторичные метаболиты растений»... | | Методические указания по самостоятельной работе студентов Методические указания предназначены студентам для выполнения самостоятельной работы по дисциплине «Избранные главы экологической... |
