Раздел 2. Ферментативный катализ
Фермент проявляет относительную специфичность. Определите, исходя из величины Км тот субстрат, который будет подвеграться каталитическому превращению с наибольшей скоростью при концентрации субстрата, равной : а) Км= 2*10-1М; б) Км= 2*10-3М;в) Км= 2*10-4М; г) Км= 2*10-6М.
Сериновые протеазы проявляют групповую специфичность к субстратам. Эти ферменты имеют похожую структуру и общий каталитический механизм, но различаются по субстратной специфичности. Что определяет специфичность этих ферментов к субстрату, а что специфичность к пути превращения?
а) объясните название этих ферментов – «сериновые протеазы»;
б) сравните структуру каталитического и субстратсвязывающего участков активного центра химотрипсина, трипсина и эластазы.
Метанол (древесный спирт), который когда-то использовался как антифриз для автомобилей, очень токсичен; прием внутрь всего лишь 30 мл метанола может привести к смерти. Такая необычайно высокая токсичность метанола обусловлена действием не столько самого метанола, сколько продукта его метаболизма – формальдегида. Метанол быстро окисляется до формальдегида под действием фермента печени алкогольдегидрогеназы:
|
метанол
|
формальдегид
|
Один из методов лечения при отравлении метанолом состоит в том, что больному назначают этанол (этиловый спирт) либо внутрь, либо внутривенно в количествах, которые у здорового человека вызывают интоксикацию. Объясните, почему такое лечение оказывается эффективным?
№
п/п
|
Разделы
дисциплины
|
Темы для самостоятельной работы, трудоемкость (часы)
|
1
|
Раздел1.
Структура и свойства ферментов.
|
1.1. Классификация и номенклатура ферментов (2 ч.)
1.2. Методы выделения и очистки ферментов (2 ч.)
1.3. Методы изучения уровней структурной организации ферментов (2 ч.)
1.4. Решение задач и выполнение заданий (2 ч.)
|
2
|
Раздел 2. Ферментативный катализ.
|
2.1. Механизм действия оксидоредуктаз на примере алкогольдегидрогеназы (2 ч.)
2.2. Специфичность сериновых протеиназ (2 ч.)
2.3 Решение задач и выполнение заданий (2 ч.)
|
3
|
Раздел 3. Регуляция активности и компартментализация ферментов.
|
3.1. Сходство и отличия мультиферментных комплексов от мультиферментных конъюгатов (2 ч.)
3.2. Белок-белковые взаимодействия в регуляции активности ферментов (2 ч.)
3.3. Решение задач и выполнение заданий (4 ч.)
3.4. Реферат (8 ч.)
|
4
|
Раздел 4. Прикладное значение ферментов.
|
4.1. Создание ферментов с заданными свойствами путем сайт-специфического мутагенеза (2 ч.)
4.2. Решение задач и выполнение заданий (2 ч.)
4.3. Реферат (2 ч.)
|
Раздел 3. Регуляция активности и компартментализация ферментов
1. Чем отличается изменение ферментативной активности путем ковалентной модификацией от аллостерической регуляции?
2. В метаболической цепи реакций реакция, катализируемая ферментом Е1, протекает с наименьшей скоростью.
а) Какой фермент может быть регуляторным в данной цепи реакций?
б) Какой из продуктов реакций (Р1, Р2, Р3, Рn) может служить ингибитором метаболического пути? Объясните, почему.
в) Назовите тип регуляции.
г) Каковы структурные особенности регуляторного фермента?
3. Докажите, что быстрая и эффективная регуляция активности метаболического пути осуществляется аллостерическими ферментами, а не ферментами, подчиняющимися кинетике Михаэлиса.
4. Исследователям аденилатциклазной системы удалось выделить мутантные клетки мышиной лимфомы, способные связывать гормон и содержащие нормальное количество фермента аденилатциклазы. Однако присоединение гормона не приводило к повышению концентрации сАМР. Какой блок отсутствовал в цитоплазматической мембране мутантных клеток? Для ответа на вопрос:
а) приведите схему трансмембранной передачи сигнала;
б) укажите особенности строения этого белка;
в) объясните, какую роль играет этот белок в функционировании аденилатциклазной мессенджерной системы.
5. Для изучения инозтитолфосфатной системы использовали мембраны клеток печени. В инкубационную среду добавили активатор рецептора и субстрат фосфолипазы С. Однако концентрация Са2+ не возрастала. Что забыли добавить в инкубационную среду исследователи?
Для решения задачи:
а) приведите схему инозитолфосфатной мессенджерной системы передачи сигнала;
б) объясните, на каком этапе функционирования системы необходимо это вещество.
6. Существует выражение «сахарный диабет – это голод среди изобилия». Для обоснования этого выражения ответьте на вопросы и выполните задание:
а) в каких тканях протекает метаболизм по типу голодания на фоне гипергликемии;
б) какие метаболические пути активируются и ингибируются в этих тканях;
в) представьте схему одного из метаболических путей, скорость которого повышена в этих условиях;
г) какие симптомы сахарного диабета отражают эти изменения метаболизма.
7. Изобразите схему передачи сигнала в фосфоинозитидной мессенджерной системе.
8. Назовите соединение, структурная формула которого изображена ниже, укажите связь, на которую действует фосфолипаза С.
9. Объясните механизм стимулирующего действия кофеина.
10. Чем можно объяснить, что многие тирозинкиназные рецепторы вовлечены в процессы злокачественного роста?
11. Объясните причину ускорения инициации опухоли канцерогенами, при воздействии форболовых эфиров.
12. В каком направлении будет изменяться активность аденилатциклазы в результате действия гормона на данный рецептор?
13. Перекисное окисление липидов (ПОЛ) может приводить к нарушению основных функций биологических мембран. Одним из проявлений ПОЛ мембран является нарушение липид-белковых взаимодействий. Как это отразится на функциях белков мембран? Для ответа на этот вопрос:
а) объясните, какие компоненты молекул липидов подвергаются этой модификации;
б) укажите, какие процессы, протекающие в клетке, могут быть источниками активных радикалов, инициирующих ПОЛ;
в) приведите примеры мембранных белков и объясните влияние липидного окружения на их функции.
14. Молекула холестерола легко встраивается в бислой мембраны. Существует механизм защиты клеток от избытка ХС – это реакция его этерификации. Образованный продукт не удерживается в мембране. Как изменится содержание ХС в бислое при снижении активности этого фермента? Для решения задачи:
а) напишите схему реакции этерификации ХС, назовите фермент;
б) укажите, какие изменения в структуре мембран наблюдаются при этом нарушении;
в) объясните, как повышение содержания ХС будет влиять на функционирование мембранных ферментов.
15. Нарисуйте схему действия гидрофильных гормонов на примере адреналина.
16. Нарисуйте схему действия гидрофобных гормонов.
Раздел 4. Прикладное значение ферментов
1. Составьте схему эксперимента по получению рекомбинантной гексозаминидазы А человека для ее использования в качестве лекарственного препарата.
2. Составьте схему эксперимента по сайт-специфическому мутагенезу глюкозо-6фосфат дегидрогеназы с заменой Arg132 на Ala.
3. Перечислите преимущества и недостатки рекомбинантных ферментов и рекомбинантных ферментативных систем перед природными.
4. Составьте схему эксперимента по изменению специфичности рестриктазы ecori методами генной инженерии.
5. Предложите конструкцию эффективного экспрессионного вектора.
6. Предложите схему эксперимента по созданию искусственного метаболического пути, объединяющего один бактериальный и один растительный фермент.
7. Предложите перечень методов с их краткой характеристикой, которые можно использовать для проверки того, что свойства ферментов действительно изменились после генно-инженерных манипуляций.
V. ПЕРЕЧЕНЬ ПРИМЕРНЫХ ВОПРОСОВ
К ЭКЗАМЕНУ ПО КУРСУ «ЭНЗИМОЛОГИЯ»
1. Общие правила работы с ферментами.
2. Способы количественного выражения активности ферментов. Единицы ферментов.
3. Методы определения активности ферментов: спектрофотометрический, флуориметрический, колориметрический, манометрический, биолюминесцентный, иммунохимический.
4. Методы регистрации ферментативной активности: стационарный (по конечной точке), непрерывный.
5. Три этапа количественного определения активности ферментов.
6. Использование сопряженных ферментативных реакций для определения активности ферментов.
7. Методы экстракции и выделения ферментов
8. Жидкостная хроматография белков. Виды хроматографии.
9. Электрофорез. Принцип метода. Расчет подвижности биомолекул в электрическом поле. Капиллярный электрофорез. Двумерный электрофорез. Преимущества двумерного электрофореза.
10. Активный центр ферментов: общие представления. Использование метода РСА для изучения топографии активных центров.
11. Активные центры простых ферментов.
12. Активные центры сложных ферментов.
13. NAD(P). Строение, свойства, биохимические функции.
14. FMN, FAD. Строение, свойства, биохимические функции.
15. Убихиноны. Строение, свойства, биохимические функции.
16. Железопорфириновые коферменты. Строение, свойства, биохимические функции.
17. Аскорбат. Строение, свойства, биохимические функции.
18. HSCoA. Строение, свойства, биохимические функции.
19. Пиридоксаль-5-фосфат. Строение, свойства, биохимические функции.
20. Тетрагидрофолат. Строение, свойства, биохимические функции.
21. Нуклеозидфосфаты. Строение, свойства, биохимические функции.
22. Тиаминдифосфат. Строение, свойства, биохимические функции.
23. Биотин. Строение, свойства, биохимические функции.
24. Кобамидные коферменты. Строение, свойства, биохимические функции.
25. Истинные металлоэнзимы и металлоэнзимные комплексы. Роль металлов в функционировании ферментов.
26. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента.
27. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата. Константы КS, KM, VMAX. Число оборотов ферментов.
28. Методы определения KM и VMAX (Лайнуивера-Берка, Вульфа-Хайнса, Иди-Хофсти, Эйзенталя и Корниш-Боудена).
29. Кинетическая классификация ингибиторов. Константа ингибирования (Кi). Конкурентное ингибирование.
30. Неконкурентное ингибирование, смешанное ингибирование. бесконкурентное ингибирование. Методы определения константы ингибирования.
31. Кинетика аллостерических ферментов. Уравнение Хилла. Методы определения коэффициента Хилла (метод Хилла, Курганова с соавторами).
32. Обработка экспериментальных данных для определения VMAX и [S]0,5 у аллостерических ферментов. Коэффициент крутизны – RX, методы его определения. Связь RX и h.
33. Модели аллостерических ферментов.
34. Аспартаткарбамоилтрансфераза – ключевой фермент пути биосинтеза пиримидинов.
35. Фосфофруктокиназа – поливалентный аллостерический фермент.
36. Ферментативный катализ: стадии образования и распада фермент-субстратного комплекса, доказательства его существования. Ферментативный катализ: работы Э. Фишера, Дж. Кошланда, К. Дженкса.
37. Факторы, определяющие эффективность и специфичность ферментативного катализа.
38. Карбоксипептидаза А. Строение, свойства, биологическая роль, механизм лействия.
39. Лизоцим. Строение, свойства, биологическая роль, механизм действия.
40. Специфичность действия ферментов.
41. Уровни структурной организации ферментов – от мономерных до ферментных ансамблей.
42. Внутриклеточная локализация ферментов.
43. Мономерные ферменты: изостерическая регуляция активности.
44. Ковалентная модификация ферментов как быстрый и обратимый способ регуляции их активности: общие представления.
45. Белок-белковые взаимодействия в регуляции активности ферментов.
46. Механизмы регуляции зимогенов.
47. Изоферменты. Классификация. Номенклатура. Биологическая роль изозимов лактатдегидрогеназы, креатинкиназы, гексокиназы.
48. Ковалентная модификация - основной тип регуляции активности ферментов в клетке.
49. Каскадный механизм регуляции активности гликогенфосфорилазы.
50. Каскадный механизм регуляции активности гликогенсинтазы.
51. Строение и регуляция активности пируватдегидрогеназного комплекса.
52. Строение и регуляция активности комплекса синтазы жирных кислот.
53. Строение и регуляция гликолитического метаболона.
54. Биосинтез ферментов и его регуляция на генетическом уровне.
55. Характеристика АТР-зависимых протеаз прокариот.
56. Пути деградации ферментов у эукариот. Убиквитин-протеосомный путь.
57. Получение рекомбинантных ферментов. Основные этапы молекулярного клонирования.
58. Изменение свойств ферментов генно-инженерными методами. Методы сайт-специфического мутагенеза.
59. Сайт-специфическое изменение свойств ферментов генно-инженерными методами.
60. Использование рекомбинантных ферментов. Метаболические пути, созданные методами генной инженерии.
61. Ферменты в выявлении энзимопатологий.
62. Наследственные энзимопатии. Классификация, механизмы возникновения.
63. Ферменты в энзимодиагностике. Факторы, влияющие на распределение ферментов в сыворотке крови.
64. Ферменты в энзимодиагностике. Источники ошибок при проведении лабораторных анализов.
65. Ферменты в энзимодиагностике. Ранняя диагностика острого инфаркта миокарда.
66.Энзимотерапия. Заместительная терапия. Использование ингибиторов ферментов.
67. Принципы классификации и номенклатуры ферментов.
68. Оксидоредуктазы. Характеристика ферментов важнейших подклассов и подподклассов.
69. Трансферазы. Характеристика ферментов важнейших подклассов и подподклассов.
70. Гидролазы. Характеристика ферментов важнейших подклассов и подподклассов.
71. Лиазы. Характеристика ферментов важнейших подклассов и подподклассов.
72. Изомеразы. Характеристика ферментов важнейших подклассов и подподклассов.
73. Лигазы (синтетазы). Характеристика ферментов важнейших подклассов и подподклассов.
74. Иммобилизованные ферменты – способы получения.
75. Применение иммобилизованных ферментов в практической деятельности человека.
|
