Методические указания к самостоятельной работе Специальность 020208. 65 Биохимия
Скачать 0.95 Mb.
|
| Тема 1.1. Врождённые (наследственные) энзимопатии. Примеры наследственных энзимопатий Типичным примером наследственной энзимопатии, протекающей с клиническими проявлениями является такое заболевание, как фенилкетонурия (ФКУ) или фенилпировиноградная олигофрения. ФКУ – это наследственное заболевание, приводящее в раннем детстве к гибели ребёнка или к развитию тяжёлой умственной отсталости. Частота встречаемости составляет ≈ 1:10000 новорожденных. Молекулярный дефект болезни заключается в блокировании превращения незаменимой аминокислоты фенилаланина (Phe) в тирозин (Tyr) в соответствии с уравнением на рис.1. То есть, в этом случае организм теряет способность синтезировать фенилаланингидроксилазу. Phe тносится к незаменимым аминокислотам, поскольку ткани животных не обладают способностью синтеза его бензольного кольца. Tyr является полностью заменимым при достаточном поступлении Phe с пищей. В норме избыток Phe поступившего с пищей и неиспользованный для синтеза белка, с помощью фенилаланингидроксилазы превращается в Tyr. У больных ФКУ происходит накопление Phe в тканях и крови примерно в 40 раз выше, чем в норме.
Рис. 1. Блокирование превращения незаменимой аминокислоты Phe в Tyr Повышение содержание Phe само по себе не опасно, но стимулирует образование необычных продуктов – производных Phe – фенилпирувата и фенилацетата. Эти вещества оказывают губительное действие на развитие мозга и если не принимать необходимых мер, влекут за собой развитие умственной отсталости. Диагноз ФКУ ставят на основании химического метода открытия Phe и фенилпировиноградной кислоты на пелёнках ребёнка. Для этого используют реактивные бумажки, пропитанные FeCl3 или динитрофенилгидразином. Развитие болезни можно предотвратить, если значительно снизить исключить приём Phe с пищей с самого рождения ребёнка и в течение первых месяцев жизни. За это время мозг успевает окрепнуть, и в дальнейшем патологические продукты обмена Phe уже перестают быть опасны ми. Для такого ребёнка Tyr оказывается незаменимой аминокислотой. К относительно бессимптомным энзимопатиям относят те случаи, когда отсутствие или недостаточная активность того или иного фермента вызывает болезненные ощущения, но не угрожает жизни человека. Так, например, некоторые люди страдают непереносимостью молока, выражающейся в том, что даже небольшое количество выпитого молока приводит к расстройству кишечника. Причина такой непереносимости заключается в резком недостатке в кишечнике таких людей фермента галактозидазы, расщепляющей молочный сахар. Молочный сахар – это дисахарид лактоза, состоящий из глюкозы и галактозы. Дисахариды в кишечнике не всасываются, они должны быть предварительно разложены на свои составные части – моносахариды. Отсутствие галактозидазы делает невозможным такое разложение лактозы и тем самым препятствует её усвоению. Люди, страдающие непереносимостью молока, легко усваивают молочнокислые продукты (кефир, простоквашу и др.), в ходе приготовления которых молочный сахар разрушается. К бессимптомным энзимопатиям относят те случаи, когда отсутствие фермента изменяет внешность человека (или другие фенотипические признаки), но не нарушает сколько-нибудь важных жизненных процессов. Например, альбинизм характеризуется врождённым отсутствием пигментов в коже, волосах и сетчатке глаза. Метаболический эффект связан с потерей меланоцитами способности синтезировать тирозиназу – фермент, катализирующий окисление тирозина в диоксифенилаланин и диоксифенилаланинхинон, которые являются предшественниками меланина. При этом альбиносы по здоровью не уступают людям с нормальной окраской. Контрольные вопросы
Тема 1.2. Диагностическая эффективность, чувствительность и специфичность ферментативных тестов При интерпретации энзиматических исследований следует иметь в виду два обстоятельства: 1. Ферментативные тесты могут быть ложноположительными у практически здоровых людей. Это свидетельствует об условности понятия норма, а также об индивидуальной вариабельности параметров. Значение ферментативной активности может зависеть от разных факторов, например от пола, возраста, конституции, состояния беременности, адаптации к переменным условиям среды, генетических факторов и др.; 2. Ферментативные тесты в определённом проценте случаев могут быть ложноотрицательными. В этом случае имеется явное, морфологически подтверждённое повреждение органа, но при этом сывороточная активность фермента остаётся в пределах нормы. Это говорит или о больших компенсаторных возможностях организма или же об аналитических недостатках метода. Для оценки диагностической эффективности ферментативных тестов широко используют два критерия: чувствительность и специфичность лабораторного теста. Эти характеристики определяются на основе статистического анализа больших массивов в результате клинико-лабораторных исследований. В основу расчётов показателей чувствительности и специфичности берут распределение результатов исследований в группах страдающих данной болезнью и не страдающих ею. Результаты оформляются в виде таблицы (табл. 1). Таблица 1 Распределение результатов исследований для расчета диагностической значимости лабораторных тестов
Полученные значения используют в дальнейших расчётах. Диагностическая чувствительность (ДЧ) теста при определённой болезни представляет собой процентное выражение частоты истинно положительных результатов у больных данной болезнью:  ДЧ считается хорошей, если уровень ферментативной активности сыворотки крови при данном заболевании всегда превышает норму. В этом случае всегда можно отличить больного от здорового. Диагностическая специфичность (ДС) при определённой болезни представляет собой процентное выражение частоты истинно отрицательных результатов у людей, не страдающих этой болезнью:  ДЧ считается высокой, если активность данного фермента в сыворотке возрастает только при одном заболевании или небольшой группе заболеваний. Сама же диагностическая эффективность (ДЭ) теста выражается процентным отношением истинных (то есть соотвествующих состоянию обследуемых пациентов) результатов теста к общему числу полученных результатов:  Контрольные вопросы Что такое ложноположительный результат, причины его получения? Что такое ложноотрицательны результат, причины его получения? Как рассчитать диагностическую эффективность, чувствительность и специфичность ферментативных тестов? Тема 1.3. Использование ферментов в лабораторной практике Фосфатазы Фосфатазы – это ферменты, отщепляющие неорганический фосфат от органических фосфорных эфиров. Эти ферменты имеют широкую специфичность и катализируют следующую реакцию:  В разрыве связи принимает участие вода, поэтому фосфатазы относят к классу гидролаз. В зависимости от кислотности среды, при которой фосфатазы наиболее активны, различают щелочную фосфатазу, действующую при рН 8,6-10,1 и кислую фосфатазу, оптимум действия которой лежит при рН 3,4-6,2. Эти ферменты отличаются от некоторых более специфических фосфогидролаз, например от глюкозо-6-фосфатазы и 5'-нуклеотидазы, которые проявляют оптимальную активность в нейтральной среде. Щелочная фосфатаза Щелочная фосфатаза (ЩФ, фосфогидролаза моноэфиров ортофосфорной кислоты; КФ 3.1.3.1) – мембраносвязанный фермент, находится на внешней стороне плазматической мембраны. ЩФ – гликопротеин с Mr 130-220 кДа, является металлоферментом, в состав активного центра фермента входит атом Zn. По структуре это димер. Каждый мономер содержит три металлосвязывающих центра. Фермент, лишённый Zn теряет активность, но восстанавливает её после добавления металла. Активность фермента повышается двухвалентными ионами Mg2+, Co2+, Mn2+. Фосфаты, бораты и оксалаты подавляют активность всех форм фермента. ЩФ содержится практически во всех тканях человека. Наибольшее количество её содержится в костной ткани, слизистой оболочке кишечника и печени. Образуется ЩФ в костной ткани (остеобластах), костном мозге, клетках печени, почек, предстательной и молочной желёз. Выводится фермент с желчью. Для исследования используют свежую сыворотку крови без признаков гемолиза. Кровь у обследуемого нужно брать через несколько дней после приёма сульфаниламидов и антибиотиков. Считается, что ЩФ довольно стабильна, поэтому сыворотку крови можно хранить в течение нескольких дней даже при комнатной температуре. Клиническое значение определения различных изоферментов ЩФ В сыворотке крови ЩФ находится в трёх белковых фракциях: α-, β- и γ-глобулинов и присутствует в виде нескольких изоферментов: 1. Костный изофермент ЩФ преобладает в крови здоровых детей до 13 лет. В сыворотке здоровых взрослых этого изофермента практически нет. Костная ЩФ в больших количествах присутствует у больных рахитом, при саркоме костей, у онкобольных с метастазами в кости, а также при заживлении перелома; 2. Печёночный изофермент ЩФ – основная часть ЩФ здоровых взрослых людей. Её концентрация повышается при механической желтухе, гепатите, у больных с различными видами новообразований; 3. Кишечный изофермент ЩФ синтезируется энтероцитами, поступает в просвет тонкого кишечника и частично всасывается в кровь. Вклад её в общую активность ЩФ невелик. Активность может быть увеличена у лиц с I и III группами крови, особенно после приёма пищи, при заболеваниях кишечника, сопровождающихся диареей; 4. Почечный изофермент ЩФ частично всасывается в кровь, но в основном, экскретируется с мочой. Исследование данной изоформы используется в диагностике заболеваний почек (гломерулонефрит, пиелонефрит и др. нефропатии); 5. Плацентарный изофермент ЩФ появляется в крови у женщин в последние 3 месяца беременности; 6. Неидентифицированные изоферменты ЩФ, которые называют «изоферменты Regan или Nagao». Эти изоферменты обнаруживаются в крови больных онкозаболеваниями и наиболее часто определяются при раке лёгкого. Термолабильность, электрофоретическая подвижность и иммунологические характеристики близки к таковым для плацентарного изофермента. В норме, у здоровых взрослых людей активность изоферментов ЩФ распределена следующим образом: Печёночный изофермент ЩФ – 70-80% от общей активности фермента, костный изофермент – 0-30%, кишечный изофермент – 0-30%, почечный изофермент и др. – 0%. Концентрация ЩФ в плазме высока при рождении, но затем быстро падает (рис. 2). Тем не менее, она остаётся в 2-3 раза выше нормального уровня у взрослых. Следующий подъём активности происходит во время подросткового ускорения роста перед снижением до взрослого уровня по мере прекращения роста костей.  Рис. 2. Зависимость активности ЩФ в сыворотке от возраста ребёнка На рис.2 приведены средние значения. Указанные пики повышения активности ЩФ между 10-ю и 16-ю годами соответствуют ускоренному росту в период созревания и могут более чем в 3 раза превышать верхний предел нормы для взрослых. Кислая фосфатаза В группе кислых фосфатаз (КФ, фосфогидролаза моноэфиров ортофосфорной кислоты; КФ 3.1.3.2) различают несколько ферментов, которые отличаются оптимум рН и происхождением: КФ II (оптимум рН при 4,6) находится в основном в предстательной железе; КФ III (оптимум рН при 3,4-4,4) – в печени и других паринхиматозных органах; КФ IV (оптимум рН при 5,2-6,2) – в эритроцитах. Активность КФ в различных органах и тканях распределяется неравномерно, максимальная активность наблюдается в предстательной железе, затем – в печени, селезёнке, эритроцитах, тромбоцитах, костном мозге, женском молоке и в сыворотке крови. КФ локализована в лизосомах. У мужчин половина содержащейся в сыворотке крови КФ поступает из предстательной железы, а остальная часть – из печени, разрушающихся тромбоцитов и эритроцитов. У женщин КФ в сыворотку крови поступает в основном из печени, эритроцитов и тромбоцитов. Для исследования используют свежую сыворотку крови, свободную от гемолиза, так как эритроциты содержат КФ. Анализ следует проводить в день взятия крови или в течение 24 часов, при условии хранения пробы в холодильнике. Клиническое значение определения КФ Определение активности КФ в сыворотке крови имеет исключительное значение при диагностике заболеваний предстательной железы и, в частности, карциноме предстательной железы. Простатическая изоформа локализуется в лизосомах эпителия предстательной железы. Это гликопротеин с Mr 100 кДа. Фермент секретируется в семенную жидкость, незначительная его часть попадает в мочу и совсем немного поступает в кровь. Активность фермента в норме в сыворотке крови составляет 0-6 Е/л. При раке предстательной железы без метастазов активность КФ увеличивается незначительно (примерно у 25-ти% больных). Однако, при вторичных опухолях активность КФ значительно возрастает у более чем 80-ти% больных. Это обусловлено появлением большого числа клеток, синтезирующих КФ, и более лёгким проникновением фермента в кровь, так как метастатические опухоли не окружены капсулой, как сама железа. Поскольку повышение активности фермента встречается лишь в 25-ти% случаев первичного рака предстательной железы, то определение КФ не рекомендуется для использования при скрининге. Тест может быть применён для контроля за течением болезни. Другим маркером рака предстательной железы является простатический специфический антиген (ПСА). Его чувствительность выше, чем у КФ. ПСА – это сериновая протеаза с химотрипсинподобной активностью. У 80-ти% мужчин количество ПСА в крови в норме менее 4 мкг/л, у 20-ти% – до 20мкг/л. Содержание антигена увеличивается при раке и доброкачественной гиперплазии предстательной железы, а после лечения снижается до нормы. Определение количества ПСА рекомендуется для наблюдения за лечением. – Амилаза -Амилаза (1 ,4-а-D-глюкан-4-глюканогидролаза; КФ. 3.2.1.1) – фермент, осуществляющий гидролитическое расщепление -1,4-глюкозидных связей крахмала и гликогена до декстринов и мальтозы: Крахмал амилодекстрины эритродекстрины охродекстрины мальтотетрозы мальтотриозы мальтоза Сыворотка крови человека содержит –амилазу двух изозимных типов: панкреатическую (Р-тип), вырабатываемую поджелудочной железой, и слюнную (S-тип), продуцируемую слюнными железами. Амилолитической активностью обладают также клетки кишечника, печени, почек, легких. Молекулярная масса -амилазы относительно низкая (примерно 48 кДа), поэтому в отличие от других ферментов она фильтруется в клубочках почек и содержится в моче. Оптимум рН для действия фермента находится в интервале 6,5-7,5. Активность фермента значительно возрастает в присутствии ионов хлора. В структуру молекулы –амилазы входит ион кальция, который не только ее активирует, но и предохраняет от потери активности и гидролиза при действии протеолитических ферментов. Активность фермента ингибируется фторидами, цитратом, оксалатом и ЭДТА, связывающими ионы кальция. Клиническое значение определения -амилазы Повышение активности -амилазы в крови и моче наблюдается при многих заболеваниях, но наиболее выражено при остром панкреатите, при котором активность увеличивается в основном (до 90% и более) за счет панкреатического изофермента. При данном заболевании наиболее выраженный подъем содержания амилазы в крови и моче отмечен в первые 1-3 сут. Гиперамилазурию панкреатического происхождения вызывают также такие заболевания, как вирусный гепатит, рак поджелудочной железы. К гиперамилаземии непанкреатического происхождения относят поражение слюнных желез, почечную недостаточность. Причинами повышения -амилазы в крови являются нарушение секреции желез, синтезирующих -амилазу,. недостаточность выведения почками амилазы из организма. При ряде заболеваний повышение активности -амилазы в крови трудно объяснимо: холецистит, перитонит, ожоги, острый аппендицит. Гиперамилаземию вызывают многие фармакологические препараты – кортикостероидные гормоны, салицилаты, тетрациклины, фуросемид., гистамин. Для -милазы крови характерны широкие внутри- и межиндивидуальные вариации. Наиболее информативным с диагностической точки зрения является определение панкреатической изоамилазы, на активность которой в крови здоровых людей приходится до30%, а в моче – до 70% от общей амилолитической активности. Липаза Липаза (триацилглицерол-ацилгидролаза; К.Ф. 3.1.1.3) – фермент, катализирующий расщепление глицеридов высших жирных кислот. Этот энзим в организме вырабатывается рядом органов и тканей, что позволяет различать липазу желудочного происхождения, поджелудочной железы, липазу легких, кишечного сока, лейкоцитов и др. Сывороточную липазу можно считать суммой органных липаз, а повышение активности ее является следствием патологического процесса в каком-либо органе. Колебания активности серолипазы у здорового человека незначительны. Липаза является термолабильным ферментом и при 37С частично инактивируется.
Клиническое значение определения липазы Снижение активности липазы в сыворотке (плазме) крови имеет место при раке желудка (при отсутствии метастазов в печень и поджелудочную железу). При злокачественном новообразовании поджелудочной железы в ранней стадии заболевания отмечается нарастание активности серолипазы; в более поздний период заболевания (по мере разрушения ткани железы) активность этого энзима снижается. Серолипаза больных раком легкого характеризуется высокой активностью. При остром панкреатите активность фермента может увеличиться в 200 раз по сравнению с нормой. Активность липазы в крови быстро увеличивается в течение нескольких часов после приступа панкреатита, достигая максимума через 12-24 ч, и остается повышенной в течение10-12 дней, то еесть более продолжительное время, чем активность -амилазы. В моче активность липазы не обнаруживается. В дуоденальном содержимом липазу рекомендуется определять после стимуляции секретином или панкреозимином. -Глутамилтрансфераза -Глутамилтрансфераза [(5-глутамил)-пептид: аминокислота 5-глутамилтрансфераза, -глутамилтранспептидаза; К.Ф. 2:3.2.2.] открыта в1950 г. Фермент катализирует реакцию переносау -глутамилового остатка глутамиловой кислоты на акцепторный пептид или на L-аминокислоту. -Глутамилтрансфераза (-ГТФ) содержится почти во всех органах человека, наибольшая удельная активность определяется в ткани почек. Фермент не является гомогенным, в зависимости от вида патологии количество фракций может меняться. Клиническое значение определения -Глутамилтрансферазы Несмотря на высокую активность -ГТФ в почках, определение активности фермента в сыворотке крови проводят преимущественно для диагностики заболеваний печени и желчевыводящих путей. Повышение активности -ГТФ наблюдается при гепатитах, опухолях и метастазах в печень, патологии желчевыводящих путей с явлениями обтурации. Активность -ГТФ в сыворотке крови увеличивается, как правило, параллельно увеличению активности щелочной фосфатазы, но активность -ГТФ увеличивается раньше, держится на повышенных цифрах более длительное время и относительное увеличение активности фермента в несколько раз выше, чем щелочной фосфатазы Наркотики, седативные средства, этанол индуцируют активность -ГТФ печени. Поэтому -ГТФ является чувствительным тестом для алкогольнотоксических поражений печени. Исследование изоферментов -ГТФ не имеет большого диагностического значения. При острых панкреатитах активность фермента повышена незначительно. Холинэстераза В настоящее время различают два типа холинэстераз, которые обозначают как истинную холинэстеразу (ацетилхолинэстераза – АХЭ) и псевдохолинэстеразу (холинэстераза – ХЭ). Истинная холинэстераза (ацетилхолингидролаза; К.ф. 3.1.1.7) отличается узкой субстратной специфичностью, псевдохолинэстераза (ацетилхолин-ацилгидролаза; К.Ф. 3.1.1.8) обладает более широкой субстратной специфичностью, благодаря чему их можно раздельно выявить и количественно определить активность. Наиболее специфичным субстратом для АХЭ является ацетилхолин, для ХЭ – бутирилхолин. ХЭ, ввиду отсутствия строгой субстратной специфичности, гидролизует и другие эфиры холина: ацетилхолин, сукцинилхолин, бензоилхолин и т. д. При гидролизе ацетилхолина реакция протекает следующим образом:
АХЭ содержится преимущественно в эритроцитах, нервной и мышечной тканях, а ХЭ – в сыворотке крови, печени, поджелудочной железеи других внутренних органах. АХЭ находится на наружной поверхности мембраны эритроцитов и ее активность зависит от возраста эритроцитов: в молодых эритроцитах активность выше. Роль АХЭ сводится к разрушению ацетилхолина в нepвных синапсах и различных структурах клетки. По мнению некоторых авторов, активной является внеклеточная АХЭ, тогда как внутриклеточный фермент является резервными служит для пополнения запасов внеклеточной АХЭ. В отличие от АХЭ, ХЭ плазмы крови – внеклеточный фермент гликопротеиновой природы с молекулярной массой 348 кДа, образующийся в клетках паренхимы печени. Физиологическая роль ХЭ неясна. Клиническое значение определения холинэстеразы При заболеваниях и поражениях печени активность холинэстеразы в сыворотке крови снижается, т. к. нарушается синтез фермента гепатоцитами. Определение активности холинэстеразы особенно ценно для наблюдения за течением болезни и при определении прогноза при хронических заболеваниях печени. При остром гепатите диагностического значения практически не имеет. Активность фермента также уменьшается при отравлениях фосфоорганическими соединениями. Контрольные вопросы
РАЗДЕЛ 2. БЕЛКИ И ДРУГИЕ АЗОТСОДЕРЖАЩИЕ СОЕДИНЕНИЯ ПЛАЗМЫ КРОВИ В КЛИНИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
енилаланин
риглицерид + Н2О глицерин + жирные кислотыПохожие:
 | Методические указания к самостоятельной работе Специальность 020208. 65 Биохимия Учебное пособие предназначено для студентов, обучающихся по специальности «Биохимия» | | Методические указания к самостоятельной работе (для специальности биохимия) Б 545 Безопасность жизнедеятельности: методические указания к самостоятельной работе [Текст ] / cост. О. А гусейнов. – Красноярск:... |
 | Методические указания к самостоятельной работе (для специальности 020208. 65 «биохимия») Самостоятельная работа студентов включает блоки индивидуальной практики языковых и речевых умений по всем модулям курса, а также... | | Учебно-методическое пособие по самостоятельной работе Специальность... Большой практикум. Раздел «Свободнорадикальные процессы в биологических системах»: Учебно-методическое пособие по самостоятельной... |
| Методические указания к самостоятельной работе Красноярск Методические указания предназначены для студентов, обучающихся по специальности «Биохимия» | | Биохимия тканей Биохимия тканей: методические указания к самостоятельной работе [Текст ] / cост. Е. В. Инжеваткин – Красноярск: Сибирский федеральный... |
| Методические указания к самостоятельной работе студентов Специальность... Денисова Т. Ю. Мировой опыт художественной культуры в связях с общественностью: Методические указания к самостоятельной работе студентов.... | | Учебно-методическое пособие к самостоятельной работе Специальность 020208. 65 Биохимия Учебно-методическое пособие предназначено для студентов биологических и медико-биологических специальностей университетов |
| Методические указания к самостоятельной работе Красноярск Человек: основы антропологии: методические указания к самостоятельной работе [Текст ] / cост Е. В. Инжеваткин. – Красноярск: Сибирский... | | Методические указания по самостоятельной работе студентов Красноярск... Методические указания предназначены для студентов специальности 012300 Общая биохимия. В учебном пособии представлена структура дисциплины,... |
| Методические указания по самостоятельной работе студентов содержат... М 20 Математическое моделирование биотехнологических процессов: Методические указания к самостоятельной работе [Текст] / сост. П.... | | Методические указания по самостоятельной работе Красноярск ... |
| Методические указания по самостоятельной работе красноярск 2013 удк... Методические указания предназначены для студентов, обучающихся по направлению 020400. 68 «Биология» (магистерские программы: 020400.... | | Методические указания для самостоятельной работы студентов по дисциплине «Антропология» Антропология: методические указания к самостоятельной работе [Текст ] / cост Е. В. Инжеваткин. – Красноярск: Сибирский федеральный... |
| Методические указания по самостоятельной работе студентов Методические указания предназначены студентам для выполнения самостоятельной работы по дисциплине «Вторичные метаболиты растений»... | | Методические указания по самостоятельной работе студентов Методические указания предназначены студентам для выполнения самостоятельной работы по дисциплине «Избранные главы экологической... |
