Стимуляция ангио/миогенеза при сердечно-сосудистой патологии с использованием генной терапии и аутотрансплантации клеток-предшественников
Скачать 0.55 Mb.
|
На правах рукописиЕремеева Марина Викторовна СТИМУЛЯЦИЯ АНГИО/МИОГЕНЕЗА ПРИ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ ПАТОЛОГИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ И АУТОТРАНСПЛАНТАЦИИ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ 14.00.41. - Трансплантология и искусственные органы 14.00.06. - Кардиология АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук МОСКВА 2010 Работа выполнена в Научном Центре Сердечно-Сосудистой Хирургии им. А.Н.Бакулева РАМН Научные консультанты: Доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Бокерия Лео Антонович Доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН Голухова Елена Зеликовна Официальные оппоненты: академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Бочков Николай Павлович; доктор биологических наук, профессор Народицкий Борис Савельевич; доктор медицинских наук, профессор Онищенко Нина Андреевна. Ведущая организация: ГУ Российский научный центр хирургии им. Б.В. Петровского РАМН. Защита диссертации состоится «__» __________ 2009 года в ____ на заседании диссертационного совета Д.208.055.01 при ФГУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ по адресу: С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ по адресу: 123182, Москва, ул.Щукинская, 1. Автореферат разослан «___» __________2010 г. Ученый Секретарь Диссертационного Совета Доктор медицинских наук, профессор Шевченко О.П. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ИБС – ишемическая болезнь сердца СН – сердечная недостаточность ХИНК – хроническая ишемия нижних конечностей КШ – коронарное шунтирование ЛЖ – левый желудочек VEGF – фактор роста сосудистого эндотелия FBF – фактор роста фибробластов ФВ – фракция выброса ХСН – хроническая сердечная недостаточность ТМЛР –трансмиокардиальная лазерная реваскуляризация ДКМП – дилятационная кардиомиопатия ФК – функциональный класс ЭКГ – электрокардиография ЭхоКГ – эхокардиография КСО – конечный систолический объем КДО – конечный диастолический объем КСР – конечный систолический размер КДР – конечный диастолический размер Синхро-ОФЭКТ - синхронизированная с ЭКГ однофотонная эмиссионная компьютерная томография миокарда ПЭТ – позитронно-эмиссионная томография РФП – радиофармпрепарат 18F-FDG – меченная фтором фтордезоксиглюкоза ЛВГ – левовентрикулография КГ-короноарография КМЦ – кардиомиоцит ДП – дефект перфузии WMSI –индекс региональной сократимости ККМП – клеточная кардиомиопластика ДББХ – длительность безболевой ходьбы ФА – физическая активность БФ – болевой фактор ОЗ- общее здоровье ЖС – жизнеспособность ПЗ – психическое здоровье ЭКП – эндотелиальные клетки – предшественники ВВЕДЕНИЕ Хроническая сердечная недостаточность - заболевание многофакторное. Применяемые на сегодня методы лечения способны замедлить развитие болезни, но постепенно заболевание прогрессирует и становится рефрактерным в отношении «традиционной» терапии. На поздних стадиях единственно эффективным методом лечения остается пересадка сердца. Однако возможности применения трансплантации сердца жестко ограничены дефицитом донорских органов. Поэтому в настоящее время сложилась настоятельная потребность в разработке и внедрении альтернативных методов лечения. Стимуляция регенерации поврежденного органа – следующий после замещения способ лечения. Успех такого лечения существенным образом зависит от понимания молекулярных и клеточных механизмов развития сердечной недостаточности, ее прогрессирования и регрессии в результате регенерации миокарда. В связи с этим представляется важным изучение факторов детерминирующих, а также ограничивающих регенеративные возможности организма взрослого. Открытым остается также вопрос о сохранении способности к регенерации в конечно-дифференцированных тканях человека. В колоссальном потоке современных исследований на данную тему отчетливо прослеживаются три основных направления. Во-первых, это создание имплантируемых протезов левого желудочка . Конкретные механизмы восстановления сердечной функции у больных при данном методе лечения остаются неясными, однако, предполагается активация регенерации зрелых клеток, либо стимуляция миграции стволовых клеток сердца или костного мозга в пораженный участок миокарда. Эта последняя возможность подкрепляется фактом обнаружения повышенного содержания факторов привлечения стволовых клеток (инсулин-подобного фактора роста 1 и фактора 1 стромы) в миокарде пациентов после операции ( AssmusB., et al., 2002; Adams G. et al., 2007). Вторым активно развивающимся в последние 20 лет направлением является применение генной терапии для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы и сердечной недостаточности, в частности ( Isner J., 2002; Henry T. et al., 2003 ). Несмотря на связанные с этим направлением большие ожидания и огромный энтузиазм исследователей, реальный прогресс весьма ограничен, что объясняется как трудностью разработки эффективного метода доставки соответствующего гена в пораженный участок, так и сложностью выбора подходящего гена. Дополнительной возможностью служит применение клеточной терапии в качестве средства доставки «терапевтического» гена. В целом генная терапия остается перспективной возможностью стимуляции регенерации миокарда, как сама по себе, так и в сочетании с другими способами регенеративной терапии. Однако успех этого направления полностью зависит от интенсивности исследовательской работы. Третьей по порядку изложения, но не по важности, возможностью регенеративной терапии сердечной недостаточности является клеточная терапия. На экспериментальных моделях было продемонстрировано, что кардиомиоциты плода могут формировать межклеточные контакты с клетками миокарда, однако практической перспективы применения данный источник стволовых клеток не имеет ( Strauer B., 2003). Наиболее практичной в настоящее время возможностью представляется использование аутологичных либо гомологичных стволовых клеток взрослого, выделяемых из костного мозга, крови, жировой ткани, скелетных мышц, или непосредственно из сердца. На экспериментальных моделях сердечной недостаточности была продемонстрирована потенциальная способность клеток из вышеперечисленных источников улучшать функцию миокарда (Szmitko P., et al. 2003). Нуждается в дальнейшей отработке еще целый ряд вопросов, таких как оптимизация выбора клеток для введения и способа введения, недостаточное выживание введенных клеток и низкая скорость их пролиферации после инъекции, а также способность введенных клеток к трансдифференцировке и интеграции, либо к воздействию на оставшийся жизнеспособным миокард через паракриновый эффект. Прояснение этих основных моментов необходимо для оптимизации условий клеточной терапии, сочетающей максимальный клинический эффект с минимумом осложнений. Целью настоящей работы стала разработка безопасных и эффективных методов генной и клеточной терапии, которые могли бы использоваться изолированно или в дополнение к существующим традиционным хирургическим методам для лечения ряда сердечно-сосудистых заболеваний. Задачи исследования
Научная новизна работы. Создана уникальная плазмидная конструкция, позволяющая эффективно экспрессировать ген VEGF165 в тканях и обоснована перспективность его применения для стимуляции ангиогенеза в процессе реваскуляризации ишемизированных тканей. Впервые продемонстрирована большая по сравнению с CD133+/CD34+/VEGFR-2+ клетками способность клеток CD133+/CD34-/VEGFR-2+ к дифференцировке в направлении эндотелиального ростка, и тем самым обоснована большая перспективность использования маркера CD133 по сравнению с CD34 для выделения стволовых клеток с целью лечения ишемической болезни сердца и хронической ишемии нижних конечностей. Впервые показано, что в зависимости от локализации ишемии, внутримышечное и/или интраартериальное введение CD133+ аутологичных костномозговых клеток-предшественников ведет к достоверному улучшению перфузии вследствие формирования новой сосудистой сети. Практическая значимость работы. Разработанная на основе гена VEGF165 генетическая конструкция внедрена в клиническую практику НЦССХ им. А.Н.Бакулева и успешно применяется для лечения больных ишемической болезнью сердца и хронической ишемией нижних конечностей с целью реваскуляризации пораженных тканей. В результате изучения потенциала к пролиферации, дифференциации и регенерации стволовых клеток костного мозга разработаны и внедрены в клиническую практику НЦССХ им. А.Н.Бакулева методы клеточной терапии ишемической болезни сердца и хронической ишемии нижних конечностей. Материалы работы могут быть рекомендованы к применению в научно-педагогической деятельности кардиохирургических центров нашей страны, в которых осуществляется квалификационная подготовка специалистов, работающих в кардиологии и кардиохирургии. Результаты данной работы внедрены в клиническую практику Научного Центра Сердечно-Сосудистой Хирургии им. А.Н.Бакулева РАМН, а также материалы диссертации используются в курсе лекций для аспирантов и ординаторов, в сертификационном курсе для сердечно-сосудистых хирургов, проходящих обучение на базе НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН. Положения, выносимые на защиту:
Апробация диссертации состоялась 8 мая 2009 года на заседании апробационного совета НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН. Публикации. По теме работы опубликовано 43 научные работы, из них 16 – в центральной (в том числе зарубежной) печати объемом более 100 страниц. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 186 страницах, состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, характеристика материалов и методов исследования, результаты, обсуждение), выводов, практических рекомендаций и указателя литературы из 6 отечественных и 323 зарубежных источников. Диссертация содержит 40 таблиц и 70 рисунков. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Методы экспериментальных исследований. Гистологическая оценка экспрессии факторов ангиогенеза и рецепторов к ним. Для окраски срезов тканей миокарда использовали моноклональные антитела: анти- CD34 Dako Corp., Дания; анти-CD31 Dako Corp., Дания; анти-VEGF Santa Cruz Bio-tech., U.S.A.; анти- Flt-1 Santa Cruz Bio-tech, U.S.A.; анти-Flk-1 Santa Cruz Bio-tech, U.S.A.; анти-Thrombospondin Boerhinger Manhiem, Германия; анти-CD95, анти-CD95L Novocastra. Биопсийный материал ишемизированного участка миокарда размером не менее 5×3 мм забирали во время операции КШ. Материал немедленно помещали в 10% раствор нейтрального формалина. Проводка и заливка биопсийного материала в парафин проводилась по стандартной методике. Выдержка в 10% нейтральном формалине не превышала 24-36 часов. Для оценки экспрессии факторов ангиогенеза и других факторов роста использовались срезы толщиной 4мкм. Срезы депарафинировали и дегидратировали по стандартной методике. Для восстановления структуры антигенов срезы обрабатывались в Target Retrieval Solution (Dako) на водяной бане в течение 30 мин при 95-990С. Для блокирования эндогенной пероксидазы и неспецифического связывания срезы инкубировали с 3% Н2О2, 15 мин, а затем с 1% БСА - 15 мин при комнатной температуре. Инкубацию с первичными антителами проводили от 30 до 60 мин (в зависимости от вида антител) при комнатной температуре. После инкубации срезы промывали в PBS. Визуализация первичных антител производилась с помощью системы 4SAB plus kt (Dako Corp.) согласно инструкции. Препараты докрашивали гематоксилином и заключали в бальзам. Подсчет количества сосудов проводился в поле зрения микроскопа при увеличении х200-х250. Электронная микроскопия интраоперационной биопсии миокарда зоны, расположенной рядом с постинфарктной аневризмой левого желудочка. У 16 больных с постинфарктной аневризмой ЛЖ были взяты интраоперационные биопсии миокарда ЛЖ из зоны, расположенной рядом с постинфарктной аневризмой левого желудочка. Биопсийный материал фиксировали в растворе 2,5% глютарового альдегида и 1% параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4), дофиксировали в 1,5% растворе четырехокиси осмия, обезвоживали, заливали в аралдит. На ультратоме Leica изготавливали полутонкие и ультратонкие срезы. Полутонкие срезы ткани окрашивали по методу ШИК с докраской метиленовым синим, изучали под световым микроскопом. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, просматривали в электронном микроскопе Philips CM100. Получение плазмидной конструкции, содержащей ген васкулоэндотелиального фактора роста VEGF165 (ангиостимулин). Последовательность человеческого гена VEGF была получена из базы данных Genom Database c помощью программы Entrez (NM003376). Для получения гена к его последовательности были синтезированы праймеры: к 5' концу гена TGO GGC CGA AAC CAT GA и CGG CTC ACC GCC TCG GCT T к 3' концу гена. Праймер к 5' концу гена был выбран с учетом последовательности Козак, обеспечивающей эффективное начало трансляции. Для обеспечения возможности проверки экзогенного белкового продукта гена VEGF был также синтезирован праймер на 3' конец гена, который помимо последовательности гена содержал эпитоп распознавания антителами полигистидиновой последовательности, необходимой для последующей очистки белка. Для удобства клонирования и анализа праймеры также включали сайты узнавания уникальными рестриктазами, не содержащимися в последовательности гена. Сайт Eco RI для 5' концевого праймера и Smal сайт для 3' концевого праймера. Фрагменты ДНК, соответствующие по размерам VEGF165 и VEGF121, элюировались из геля после рестрикции и очищались с помощью набора фирмы Qiagen. Конструкция, содержащая ген VEGF165, была изготовлена на основе вектора pBK-CMV neo (Stratagene). Полученные плазмиды встраивали в соответствующий штамм Escherichia coli с целью наработки белка в процессе ферментации с последующей очисткой препарата из клеточного лизата на аффинных колонках с антителами, специфичными к гистидиновому хвосту молекулы. |
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | «Организация лечебно-профилактической помощи при патологии сердечно-сосудистой... Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Красноярский государственный медицинский... |  | Программа дисциплины по выбору «гипертензиология» Углубить фундаментальные представления о физиологии, анатомии и патологии сердечно-сосудистой системы |
| Лекция №13. Тема: беременность и заболевания сердечно-сосудистой системы По частоте заболевания сердечно-сосудистой системы у беременных составляют 5-10% | | Программа дисциплины по выбору «аритмология» к основной образовательной... Углубить фундаментальные представления о физиологии, анатомии и патологии сердечно-сосудистой системы |
| Лечение движением при заболеваниях сердца При заболеваемости сердечно-сосудистой системы используются все средства лечебной физкультуры (лфк) | | Шизофрения и расстройства шизофренического спектра, коморбидные сердечно-сосудистой... Автор: Жигунова Г. В., кандидат философских наук, доцент кафедры «социальных наук» |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Строение и работа сердца. Гигиена сердечно – сосудистой системы. Предупреждение сердечно – сосудистых заболеваний | | Тема урока: Предупреждение сердечно-сосудистых заболеваний. Влияние... Показать простейшие функциональные пробы, позволяющие определять состояние сердечно-сосудистой системы |
| Темы докладов и рефератОВ Основные симптомы при заболеваниях сердечно-сосудистой системы. Ишемическая болезнь сердца и формы ее проявления | | Зависимость заболеваний сердечно-сосудистой системы от содержания вредных веществ в воздухе Из рис. 1 видно, что при 1,5 резко увеличивается выброс оксида углерода и углеводородов, при 1,5 повышается содержание в... |
| Аэробные программы Разучивание сложной хореографии с использованием танцевальных элементов. Улучшает работу сердечно-сосудистой системы, дыхательную... | | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... «Гигиена сердечно-сосудистой системы. Первая помощь при заболеваниях сердца и сосудов» |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Тема: Гигиена сердечно – сосудистой системы. Первая помощь при заболеваниях сердца и сосудов | | Вопросы к вступительному экзамену в ординатуру по специальности «Рентгенэндоваскулярные... Анатомия и физиология сердечно-сосудистой системы. Нормальная анатомия сердца. Нормальная анатомия артериальной и венозной сосудистой... |
| «лфк при инфаркте миокарда» «лфк при заболеваниях сердечно-сосудистой системы» для студентов института туризма, рекреации, реабилитации и фитнеса 4 курса, обучающихся... | | Учебно-методический комплекс дисциплины физическая реабилитация (наименование... Физическая реабилитация при переломах позвоночника и таза. Физическая реабилитация при нарушениях осанки, сколиозах и плоскостопии.... |
