Стимуляция ангио/миогенеза при сердечно-сосудистой патологии с использованием генной терапии и аутотрансплантации клеток-предшественников
Скачать 0.55 Mb.
|
Исследование эффективности ангиостимулина in vivo в тесте с матригелем. В экспериментах использовали мышей-самок С57Bl/6 возрастом 6-8 недель. Матригель (BD Bioscience, Discovery Labware) при 40С смешивали со 100 нг/мл VEGF (Becton Dickinson Labware), либо с клетками, трансфецированными геном VEGF165. Смесь Матригеля затем вводили подкожно мышам в подмышечную впадину, где он полимеризовался с формированием имплантанта, который удаляли на 7 день, фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 24-36 часов и заключали в парафин. Срезы толщиной 4-5 мкм докрашивались гематоксилин-эозином и по Мейсону (Masson’s trichrome, Sigma Diagnostic). Общий индекс клеточной инвазии определялся при анализе изображений срезов, полученных с помощью цифровой камеры. Количество мигрировавших клеток определялось подсчетом процента области, занятой эндотелиальными клетками к общей области Матригеля. Исследование эффективности ангиостимулина на модели ишемии нижних конечностей. В эксперименте использовались крысы Vistar, взрослые особи массой 200-250 грамм обоего пола. Для изучения ангиогенного эффекта испытываемых препаратов была создана модель хронической ишемии скелетной мышцы конечности крысы. Под внутрибрюшинным наркозом раствором тиопентала производилась перевязка бедренной артерии крысы нитью Prolen на двух уровнях – проксимальном и дистальном. На 10-е сутки после перевязки артерии из области ишемии брался кусочек ткани для гистологического исследования, вводился ген ангиогенного фактора в различных дозах. На 30-е сутки после введения препарата брался на гистологический анализ кусочек ткани из места инъекции. Блоки ткани скелетной мышцы замораживали при помощи охлажденного до -800С петролейного эфира. Срезы толщиной 10 мкм приготавливали в криостате Leica. Свежезамороженные срезы скелетной мышцы окрашивали гематоксилином и эозином по Ван-Гизон, выявляли активность сукцинатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы. Активность ферментов определяли по методике Burstone M.S., регистрируя восстановление соли нитросинего тетразолия до синего диформазана. Методика оценки эффективности препаратов по плотности капиллярной сети в ишемизированной ткани. Блоки ткани скелетной мышцы фиксировали в 4% нейтральном формалине и заливали в парафин. Парафиновые срезы скелетной мышцы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином по Ван-Гизон. Оценка плотности капиллярного русла проводилась при увеличении х1000 с использованием иммерсии. Подсчитывалось количество открытых капилляров при оценке не менее 10 полей зрения на срез. Сравнивались полученные данные от одного животного до введения препарата и через 30 дней после введения. Метод выделения и получения аутологичных клеток-предшественников CD133+. Использовалась стандартная методика пункции костного мозга под местной анестезией из крыла подвздошной кости в количестве 40 мл. Пункция помещалась в 2х50 мл пробирки с 5 мл PBS и 200U/мл гепарина. Полученная масса разводилась 1:2 средой RPMI 1640, содержащей 0,02% коллагеназы B и 100U/мл ДНКзы. Осторожно перемешивалась при 200C 45 мин. После фильтрации через фильтр 40 мкм выделялся весь пул мононуклеаров методом центрифугирования (35 мин - 400g - 200 C) на градиенте плотности Ficoll. Выделенные мононуклеары двукратно отмывали в растворе PBS, содержащем 2mM EDTA, центрифугировали (10 мин -300g - 200C). Подсчитывали концентрацию мононуклеаров в камере Горяева. Оставляли финальный объем 300мкл PBS/не более 108 клеток для последующей магнитной сепарации CD133+. Для ингибирования неспецифического связывания добавляли FcR блокирующий реагент (100мкл). Инкубировали 10 мин при 200C. После чего сразу вносили антитела CD133 на микросферах (100мкл) и инкубировали 30 мин при 40C. После отмывки в 10х объеме раствора PBS (10 мин - 300g – 200С) ресуспендировали осадок в 500 мкл буфера. Для магнитной сепарации использовали MS колонки. После подсчета и оценки жизнеспособности клетки помещали в инкубатор (370С, 0,5% CO2) в бессывороточной среде X-VIVO 15 согласно рекомендациям GMP, где сохраняли в течение 1-2 суток до процедуры введения пациенту. Для введения CD133+ клетки-предшественники разводили в физиологическом растворе (2мл), содержащем 20% аутологичной сыворотки пациента. Метод проточной цитофлюориметрии (FACS). Цитометрический анализ проводился с использованием программ MultiGraph и FlowJo. Иммуноцитохимический анализ. Мононуклеары были выделены на градиенте фикола и в конценрации 4х106 помещены в 24-луночный планшет, предварительно покрытый человеческим фибронектином (10мкг/мл) (Sigma), в эндотелиальной основной среде EBM (CellSystems) c добавлением компонентов SingleQuots и 20% FCS. После культивирования (4 суток) были удалены неприкрепившиеся клетки и прикрепившиеся оставлены для цитохимического анализа. Для анализа эндотелиального фенотипа выделенных клеток-предшественников использовали 1,1-dioctadecyl-3,3,39,39-tetramethylindocarbocyanine–labeled acetylated LDL (Dil-Ac-LDL)(CellSystems). Клетки инкубировали в среде с 2,4 мкг/мл Dil-Ac-LDL 60мин при 370С. После отмывки в PBS клетки фиксировали в 2% растворе формальдегида в PBS 10 мин при 200C в темноте. Затем клетки отмывали и инкубировали с FITC-меченным Ulex europaeus agglutinin I (Sigma) в течение 60мин в темноте. Клетки, позитивные и по Dil-Ac-LDL, и по лектину были идентифицированы как эндотелиальные клетки–предшественники (ЭКП) и подсчитаны в каждой лунке. Два независимых исследователя подсчитывали количество ЭКП в каждой лунке трижды в 6 полях зрения. 2. Материалы и методы исследования в клинике. Общая характеристика больных. В клиническое исследование по оценке эффективности стимуляции ангиогенеза при применении генного препарата «ангиостимулин» и фракции клеток CD133+ было включено всего 101 пациент (29 пациентов с ишемической болезнью сердца, 29 пациентов с хронической сердечной недостаточностью различной этиологии и 43 пациентa, страдающих ишемией нижних конечностей). Группа 1: 11 пациентов (средний возраст 49±8,7 лет, средний класс стенокардии напряжения 3,0±0,77 ФК ССS, ФВ ЛЖ 52,8±9,2%), которым было выполнено КШ в сочетании с введением генного препарата «Ангиостимулина». Группа 2: 13 пациентов (средний возраст 51,4±6,7 лет, средний класс стенокардии напряжения 3,23±0,73 ФК CCS, ФВ ЛЖ 50,8±8,8%), которым при проведении КШ был введен генный препарат «Ангиостимулин» и проведена ТМРЛ. Группа 3: 5 пациентов (средний возраст 56,8±9,8 лет, средний класс стенокардии напряжения 3,4±0,65 ФК CCS, ФВ ЛЖ), которым было выполнено ТМЛР в сочетании с введением «Ангиостимулина». Группа 4: 10 пациентов (средний возраст 56,7±10,5лет) с ИБС (стенокардия напряжения III-IV ФК CCS) и ХСН (III-IV ФК NYHA, ФВ ЛЖ =37,7±13,7%), которым были введены клетки CD133+. Группа 5: 12 пациентов (средний возраст 43,1±14,8лет) с ДКМП и ХСН (III-IV ФК NYHA, ФВ ЛЖ = 28,4±7,2%), которым были введены клетки CD133+. Группа 6: 7 пациентов (средний возраст 55,1 ± 14,1лет), с длительным ревматическим анамнезом, после операции протезирования митрального клапана со сроком послеоперационного периода не менее 1 года, при отсутствии поражения аортального клапана и с сохранной функцией протеза митрального клапана, при отсутствии атеросклеротического поражения коронарных артерий, подтвержденного данными коронарографии, со сниженной сократительной функцией миокарда ЛЖ по данным эхокардиографии (ФВ ЛЖ=36,4±10%, III-IV ФК NYHA). Всем пациентам этой группы при проведении коронароангиографии были введены транскатетерно интрамиокардиально CD133+ клетки. Группа 7: 14 пациентов, страдающих ХИНК, которым были введены клетки-предшественники CD133+. Группа 8: 29 пациентов с ХИНК, которым был введен «Ангиостимулин». Стандартная электрокардиография (ЭКГ) выполнялась на 6/12 канальном электрокардиографе MWZ BIOSET 8000 (Германия) со скоростью лентопротяжного механизма 25 мм/сек до и после операции в 12 стандартных отведениях. Эхокардиография (ЭхоКГ) выполнялась на аппарате Hewlett Packard Sonos 5500 с использованием трансторакального S4 и чрезпищеводного Omniplane II датчиков до и после операции. Определение конечных размеров и объемов полости ЛЖ в систолу и диастолу выполнялось из стандартных позиций по методике Teichkholtz. Оценка фракции выброса миокарда левого желудочка осуществлялась по модифицированному методу Simpson из апикальной 4-х камерной проекции. Из этой же проекции проводилось измерение конечно-диастолического объема левого желудочка (КДО ЛЖ, мл) и конечно-систолического объема ЛЖ (КСО ЛЖ, мл) по формуле площадь-длина в модификации Simpson. Проба с физической нагрузкой (тредмил – тест) выполнялась на системе сопровождения нагрузочных проб «Burdic Quest» (CША) по протоколу Bruce с применением системы 12 модифицированных отведений ЭКГ по методу Mason-Likar на фоне отмены антиангинальных препаратов в утренние часы до операции и перед выпиской пациентов после операции. Производилась оценка толерантности к физическим нагрузкам, оценивалась длительность нагрузки и наличие ЭКГ критериев ишемии. Рентгеноэндоваскулярные методы исследования артерий. Всем пациентам с заболеваниями сердца была сделана вентрикулоангиография. В группе пациентов с ХИНК было выполнено ангиографическое исследование магистральных сосудов нижних конечностей. Селективная коронароангиография на этапе дооперационного обследования выполнялась на ангиографических установках «Angioscop D» фирмы Siemens (Германия) и «Integris – 3000» фирмы Phillips (Голландия) под местной анестезией по методу M. Jadkins с введением катетера в бедренную артерию по S. Seldinger. Применялся контраст «Омнипак». Анализ ангиограмм выполняли на установке «Integris - V3000» со скоростью киносъемки 25-50 кадров в секунду на пленку фирмы «Kodak». Характер и степень поражения коронарного русла определяли по классификации Ю.С. Петросяна и Л.С. Зингермана. Синхронизированная с ЭКГ однофотонная эмиссионная компьютерная томография миокарда (синхро-ОФЭКТ). Проба с дозированной физической нагрузкой выполнялась на велоэргометре «Meditronic» фирмы Hellige (Германия) с помощью 12 канального электрокардиографа «Bioset-800» фирмы в положении сидя по стандартному протоколу, принятому в НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН. Реконструкцию полученных томограмм выполняли с применением стандартной программы AUTOSPECT-plus, реализующей механизм обратного проецирования фильтрованных проекций. Позитронная эмиссионная томография (ПЭТ). Для оценки метаболизма глюкозы применяли радиофармпрепарат (РФП) – фтордезоксиглюкозу, меченую фтором (18F-FDG), которую синтезировали по двухстадийному методу R. Hamacher и соавторов на автоматизированном модуле синтеза производства фирмы «Nuclear Interface» (Германия). За 1 час до введения РФП пациенты получали перорально 50 г глюкозы с целью увеличения концентрации глюкозы в крови и подавления потребления жирных кислот в миокарде, что способствовало более высокому накоплению 18F-FDG в миокарде и лучшей его визуализации. Исследование осуществляли на позитронном эмиссионном томографе «Exact 47» фирмы «Siemens» в статическом режиме сбора данных через 40 мин после внутривенной инъекции 370 МБк РФП. Эмиссионное сканирование длилось 20 мин, а трансмиссионное – 10 мин. Оценка транскутанного напряжения кислорода в тканях осуществлялась с помощью монитора ТСМ-2 фирмы «Radiometer» (Дания) исходно перед введением стимулятора ангиогенеза, через 1, 3 и 6 месяцев после введения (в некоторых случаях дополнительно через 9 месяцев и 1 год). Во время исследования пациент находился в горизонтальном положении на спине с выпрямленными конечностями. Фиксация датчика осуществлялась по стандартной технологии, рекомендуемой фирмой – изготовителем прибора в первом межпальцевом промежутке на тыле стопы. Показатели регистрировались не ранее, чем через 20 минут после помещения откалиброванного датчика на место измерения. Ультразвуковая допплерография сосудов нижних конечностей проводилась до операции на аппарате Hewlett–Packard Sonos 5500 c линейным сосудистым мультичастотным датчиком. Оценивалась проходимость сосудов, состояние комплекса интима-медиа-адвентиция, состояние просвета сосудов с оценкой степени их стенозирования. Изучение качества жизни проводилось при помощи опросника общего назначения – Короткая Версия Опросника Здоровья – 36 (MOS 36-item Short – Form Health Survey, или MOS SF – 36), разработанный в США в рамках исследования MOS (Medical Outcome Study, англ. – Изучение Медицинских Результатов). Статистическая обработка данных. Результаты, представленные в работе, выражались как среднее значение ± стандартное отклонение. При сравнении зависимых переменных использовался W- критерий Уилкоксона, независимых – T-критерий Манна-Уитни. Результаты считались статистически достоверными при значениях р<0,05. Все расчеты проводились при помощи программы «Statistica 6.0» Copyright © Stat Soft, Inc. Методы введения ангиогенного фактора. «Ангиостимулин» вводился на заключительном этапе операции коронарного шунтирования интрамиокардиально в общей дозе 1000 мкг в зону, нуждающуюся в стимуляции неоангиогенеза. 11 пациентам препарат был введен на заключительном этапе операции, 13 пациентам дополнительно к КШ и введению препарата проводилась ТМЛР. Суммарная доза препарата делилась на 4 интрамиокардиальных инъекции (по 250мкг). Область введения определялась на основании результатов коронароангиографии, сцинтиграфии миокарда, позитронно-эмиссионной томографии, как область ишемизированного, но жизнеспособного миокарда, не подлежащая хирургической реваскуляризации по техническим причинам (плохое дистальное русло, малый диаметр коронарной артерии). Транскатетерно интракоронарно изолированно клетки CD133+ вводили 6 пациентам. Первоначально выполнялась селективная коронарография, затем ретроградная катетеризация ЛЖ и ЛВГ. Производилась смена катетера и под флюроскопическим контролем в полость ЛЖ проводили 7F Gaid катетер, кончик которого был установлен в область введения, которая определялась заранее на основании данных КГ и сцинтиграфии миокарда. Через Gaid катетер проводилась специальная гибкая игла 3,5F с ограничителем вкола 0,3мм для интрамиокардиальной пункции (с выбросом гибкой иглы) и выполнялись последовательные (по часовой стрелке) иньекции аутологичных клеток-предшественников CD133+ (в объеме 200-250 мкл) под флюороскопическим контролем положения кончика иглы. Заключительным этапом выполнялась ЛВГ. Интрамиокардиально клеточный препарат CD 133+ вводили на заключительном этапе операции. 12 пациентам клеточный препарат был введен путем интрамиокардиальной транскатетерной инъекции. 4 пациентам препарат был введен интрамиокардиально транскатетерно (через полость ЛЖ). В дополнение к хирургической реваскуляризации или при изолированном введении ангиогенных факторов все пациенты с поражением миокарда получали стандартную кардиальную терапию. Введение стимулятора ангиогенеза (ангиостимулина, либо клеток-предшественников) при ХИНК производилось однократно внутриартриально в магистральную артерию пораженной нижней конечности с помощью катетера, после выполнения исходной ангиографии, или внутримышечно обкалыванием икроножной мышцы в области пораженной артерии через 4-5 вколов. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Результаты экспериментальных исследований. В результате иммуноморфологического исследования полученных в ходе оперативного вмешательства тканей ишемизированного миокарда больных ИБС нами зарегистрирован параллелизм в экспрессии стимулирующих ангиогенез факторов в тканях и рецепторов к этим факторам на отвечающих клетках. При этом в значительной степени подавляется экспрессия маркеров апоптоза на клетках сосудов сердца. Таким образом, в ишемизированном миокарде активизируются механизмы формирования новых кровеносных сосудов, способных компенсировать недостаток кровотока и ишемию в пораженном участке. Нам удалось показать, что в результате хирургической реваскуляризации миокарда с помощью КШ происходит стимуляция эндогенного компенсаторного ангиогенеза. По-видимому, дополнительное введение факторов, стимулирующих ангиогенез (в частности ДНК, кодирующей VEGF) при ишемии миокарда, может способствовать более эффективным результатам хирургического лечения, а также в сочетании с лазерным воздействием, поддерживая уровень экспрессии ангиогенных факторов, необходимый для терапевтического ангиогенеза. По данным гистологического анализа у всех больных в анализируемой зоне миокарда содержание соединительной ткани было повышено: у 4 больных наблюдали выраженный склероз, у 2 больных – умеренный. В интерстиции у половины больных отмечены отдельные жировые клетки, у одного больного – единичные тучные клетки. КМЦ у всех больных были гипертрофированы (средний поперечный диаметр составил от 28,96±6,17 до 32,21±7,03мкм). Большинство КМЦ демонстрировало разную степень утраты миофибрилл: слабую, умеренную или значительную, - с накоплением в саркоплазме повышенного количества гликогена. Наибольшая степень утраты миофибрилл была типична для КМЦ, расположенных в зонах миокарда с более выраженным склерозом. Электронно-микроскопическое исследование выявило характерные изменения ультраструктуры КМЦ. Ядра этих клеток, как правило, имели сильно извитые контуры, содержали эухроматин с небольшими глыбками гетерохроматина и крупные ядрышки. В околоядерной зоне располагались митохондрии, гранулы гликогена, отложения липофусцина, цистерны и везикулы аппарата Гольджи. У 5 из обследованных 6 больных в некоторых КМЦ рядом с везикулами аппарата Гольджи были обнаружены специфические предсердные гранулы, у 3 больных в околоядерной области КМЦ встречались хорошо развитые цистерны шероховатого эндоплазматического ретикулума. Большинство КМЦ демонстрировало четко организованный сократительный аппарат. Миофибриллы этих клеток имели параллельное расположение, между ними находились цепочки митохондрий межмиофибриллярной популяции. В некоторых КМЦ были выявлены области саркоплазмы, утратившие миофибриллы и заполненные несократительными структурами, в том числе, митохондриями, расширенными везикулами саркоплазматического ретикулума. В межмиофибриллярной и околоядерной зонах КМЦ всех больных определялись отдельные митохондрии с зонами расхождения крист, заполненные хлопьевидным содержимым матрикса. Вставочные диски КМЦ были интенсивно развиты, имели зигзагообразные контуры, включали соединения типа fascia adherence, в меньшей степени – десмосомы и щелевые контакты. У 2 больных некоторые вставочные диски КМЦ демонстрировали локальные расхождения контактирующих мембран. У большинства больных в отдельных КМЦ были обнаружены множественные вставочные диски, расположенные на расстоянии 1-3 саркомеров. Характерным признаком многих КМЦ была дилятация каналов Т-системы. Содержание гликогена в КМЦ сильно варьировало, обычно оно было повышено в клетках с расширенными зонами утраты миофибрилл. Иногда в клетках выявляли скопления гликогена, окруженные мембранами, которые в ряде случаев могли входить в состав миелиноподобных образований. Миелиноподобные фигуры были обнаружены у большинства больных в некоторых КМЦ. Как правило, они располагались под сарколеммой. В отдельных КМЦ присутствовали мелкие жировые капли. Во всех изученных образцах миокарда выявлен умеренный или выраженный склероз, описанный в литературе как характерный признак миокарда больных ИБС (Zimmer G., et al., 1992), в том числе больных с постинфарктной аневризмой ЛЖ (Su X., et al., 2000). Размеры КМЦ были значительно выше нормы, при которой, как установлено (Maron B.J., et al., 1975), диаметр КМЦ составляет 10-15 мкм. Средний диаметр КМЦ у разных КМЦ демонстрировали ультраструктурные признаки, типичные для гипертрофированных больных находился в пределах от 28,96±6,17 до 32,21±7,03 мкм, что соответствовало тяжелой степени гипертрофии миокарда по классификации B.Kunkel, M. Schneider (1987). Таким образом, результаты морфологического исследования миокарда демонстрируют наличие в нем склеротических изменений, тяжелой степени гипертрофии КМЦ с началом их перестройки по типу дедифференцировки, что сопряжено со снижением их сократительной способности, а также выявлены дистрофические изменения КМЦ. Полученные результаты свидетельствуют, что у больных ИБС с постинфарктной аневризмой присутствуют значительные патологические изменения миокарда ЛЖ, что является основанием для целенаправленного применения клеточной и генной терапии для стимуляции регенеративных и ангиогенных процессов в пораженном миокарде. В работе получена и оценена плазмидная конструкция, содержащая ген васкулоэндотелиального фактора роста VEGF165 (ангиостимулин). На модели ишемии задней конечности крысы и в тесте с матригелем продемонстрирована эффективность препарата и обоснована перспективность его применения для стимуляции ангиогенеза в процессе реваскуляризации ишемизированных тканей. Было выявлено, что эта конструкция позволяет эффективно экспрессировать ген VEGF165 в тканях экспериментальных животных. Также в эксперименте продемонстрированы высокая переносимость и отсутствие токсичности препарата. Для изучения эффективности ангиогенных препаратов VEGF165 и bFGF была создана модель хронической ишемии скелетной мышцы задней конечности крысы. Достоверный прирост количества капилляров был обнаружен через 30 дней после введения гена VEGF165, даже при введении минимальной в нашем исследовании (250 мкг) дозы препарата. Плотность капиллярной инфильтрации мышечной ткани после введения гена bFGF не отличалась от таковой в контроле (физиологический раствор). При изучении проангиогенной активности генных препаратов в тесте с матригелем клетки человека линии НЕК 293 были трансфецированы плазмидой, содержащей ген VEGF165. В качестве контроля использовался аналогичный препарат, не экспрессирующий белок VEGF165 . С целью более полной характеристики стволовых клеток-предшественников мы выделяли CD133+ клетки методом магнитной сепарации на покрытых антителами бусах из костного мозга больных ИБС. Анализ на проточном цитофлуориметре позволил выявить наличие двух субпопуляций в составе данной клеточной фракции: большая CD34+/CD133+ (69±3% от всех CD133-положительных клеток) и меньшая CD34-/CD133+ (29±3%) субпопуляции. Обе эти субпопуляции в равной мере экспрессируют на поверхности рецептор к VEGF (99%) и не экспрессируют моноцитарно-макрофагальный маркер CD14. В процессе культивирования в условиях, благоприятствующих дифференцировке в эндотелиальные клетки, на протяжении 4 дней в популяции CD34-/CD133+/VEGFR-2+ клеток параллельно с усилением экспрессии CD34 и маркера эндотелиальных клеток CD31, было зарегистрировано прогрессивное снижение экспрессии CD133 на клеточной поверхности. Тем самым, наши данные показывают, что субпопуляция клеток-предшественников CD34+/CD133+/VEGFR-2+ находится на более продвинутой стадии дифференцировки в направлении эндотелиальных клеток по сравнению с CD34-/CD133+/VEGFR-2+ клетками. Дополнительно было проанализировано поглощение DiIAc-LDL и связывание лектина U. europaeus клетками. При этом удалось продемонстрировать, что в большей степени двойное положительное окрашивание этими специфическими для клеток эндотелия маркерами свойственно субпопуляции CD34-/CD133+/VEGFR-2+ клеток по сравнению с CD34+/CD133+/VEGFR-2+ клетками (Рисунок 1). В отличие от этой последней субпопуляции клеток-предшественников, двойное положительное окрашивание по маркерам эндотелия проявляется уже через 24 часа культивирования, что позволяет предположить, что их более высокий дифференцировочный потенциал в направлении зрелых клеток эндотелия может быть связан с более высокой адгезивностью этих клеток. В связи с этим предположением, в тестах на адгезивность нам удалось показать, что стимулированная SDF-1 и зависимая от β1-интегрина адгезия выше в субпопуляции CD34-/CD133+/VEGFR-2+ клеток по сравнению с CD34+/CD133+/VEGFR-2+ клетками (Рисунок 2). Рисунок 1.   Выделенные методом магнитной сепарации клетки разделяли на CD34+ и CD34- субпопуляции, культивировали в основной эндотелиальной среде. В обозначенные на рисунке сроки по методике приведенной в главе «Материалы и методы» определяли поглощение Dil-Ac-LDL и присоединение лектина U europaeus. (*Р<0,05 по сравнению с CD34+/CD133+ клетками, культивированными в течение 24 часов; #P<0,05 по сравнению с CD34+/CD133+ клетками, культивированными в течение 4 дней). Рисунок 2.  Прилипание обозначенных на рисунке субпопуляций ЭПК к покрытому фибронектином предметному стеклу в присутствии или отсутствии SDF-1 (100 nmol/L, 5 min) оценивали под световым микроскопом (х100) путем прямого подсчета прилипших клеток после 3 интенсивных отмывок 1х PBS. Для каждой группы оценивали по 5 препаратов; (*Р<0,05 по сравнению с нестимулированными клетками; #P<0,05 по сравнению с SDF-1-стимулированными CD34+/CD133+ клетками). В итоге экспериментальных исследований была отработана методика получения высокоочищенной популяции CD133+ стволовых клеток костного мозга. Показано, что данная популяция состоит из двух субпопуляций: менее зрелых CD133+/CD34-/VEGFR-2+ клеток и более дифференцированных CD133+/CD34+/VEGFR-2+ клеток. В экспериментах in vitro установлено, что субпопуляция CD133+/CD34-/VEGFR-2+ клеток обладает большим по сравнению с CD133+/CD34+/VEGFR-2+ клетками потенциалом к дифференцировке в направлении эндотелиального ростка. Тем самым обоснована большая перспективность использования маркера CD133 по сравнению с CD34 для выделения стволовых клеток с целью лечения ИБС и ХИНК. 2. Результаты клинического применения ангиогенных факторов. На ограниченном контингенте больных (n=101) с ишемическим поражением миокарда и при ишемии нижних конечностей проанализирована эффективность трансплантации генного препарата и клеток-предшественников для стимуляции регенеративных процессов. Препарат «Ангиостимулин» был введен 29 пациентам, страдающим ИБС. Из 29 пациентов исходно 24 (83%) находились в III – IV ФК стенокардии (ССS), после операции большинство пациентов (21 человек, 84%) относились к I и II ФК. 11 пациентам было выполнено КШ в сочетании с введением генного препарата «Ангиостимулина».13 пациентам при проведении КШ был введен генный препарат «Ангиостимулин» и проведена ТМРЛ. 5 пациентам было выполнено ТМЛР в сочетании с введением «Ангиостимулина», в дальнейшем эта группа выбыла из наблюдения. Сравнение результатов лечения проводилось между 1 группой (КШ+VEGF) и 2 группой (КШ+VEGF+ТМЛР). Значительно снизилась потребность в приеме нитратов и возросла толерантность к нагрузке у пациентов обеих групп. При оценке изменения сократимости миокарда ЛЖ по данным ЭхоКГ было выявлено в леченных, а также в смежных к пролеченным сегментах обеих групп наблюдался прирост количества нормокинетичных и уменьшение гипо- и акинетичных сегментов. При оценке индекса региональной сократимости было определено достоверное уменьшение значения WMSI в первой группе при оценке всех пациентов вместе в сроки от 2 месяцев. Во второй группе также отмечается небольшая, однако, недостоверная положительная динамика. Большая выраженность данной тенденции у пациентов 1 группы, возможно, связана с более тяжелым исходным состоянием сократимости миокарда у этих больных. При оценке изменения перфузии миокарда оперированных больных с помощью ОФЭКТ с 99mТс-тетрофосмином все сегменты в обеих группах пациентов были подразделены на 3 подгруппы: леченные, смежные к леченным и нелеченные. Леченные сегменты: у пациентов 1-й группы (АКШ+VEGF) отмечается достоверное увеличение накопления РФП при нагрузке в ранние сроки после операции (до 1 месяца), затем наблюдается некоторая тенденция к снижению (статистически недостоверная), но с сохранением положительного эффекта в сравнении с дооперационным исследованием (таблица 1). В покое наблюдаются схожие изменения, но не такие существенные, как при нагрузке. У пациентов 2-й группы (АКШ+ТМЛР+VEGF) в нагрузке в раннем постоперационном периоде наблюдаются схожие с 1-й группой достоверные изменения (прирост накопления РФП в сроки до 1 месяца), а также, в отличие от 1-й группы, наблюдается достоверный прирост перфузии в отдаленном постоперационном периоде (1 год). Изменения в покое менее выражены (недостоверный прирост в 1-й месяц, положительная динамика в отдаленном периоде). Смежные сегменты: у пациентов 1-й группы при исследовании в нагрузке отмечен незначительный, но достоверный прирост накопления РФП и далее – достоверное снижение (даже в сравнении с исходным накоплением) при наблюдении до 1 года (таблица 2). Наблюдения в покое повторяют результаты исследования в нагрузке. У пациентов 2-й группы мы не нашли достоверных изменений при исследовании в нагрузке. В покое отмечено незначительное достоверное снижение накопления РФП к 2-4 месяцам и затем небольшой прирост в сроки до 1 года. Таблица 1. Показатели накопления РФП (в %) в леченных сегментах исходно и в различные сроки после операции у пациентов 1 и 2 групп.
Таблица 2. Показатели накопления РФП (в %) в смежных сегментах исходно и в различные сроки после операции у пациентов 1 и 2 групп.
Каких-либо существенных изменений в нелеченных сегментах не выявлено. При оценке площади дефектов перфузии в динамике было выявлено, что у пациентов обеих групп отмечалось существенное уменьшение площади ДП (%) как при нагрузке, так и в покое в 1-й месяц после операции в сравнении с дооперационными значениями. Помимо этого, практически исчезает разница площадей дефектов при нагрузке и в покое, что свидетельствует о редукции ишемии миокарда. В 1-й группе в дальнейшем наблюдалось постепенное увеличение площади дефекта в течение года наблюдений, не достигшее, однако дооперационных значений. Во 2-й группе небольшое увеличение площади дефектов в 2-4 месяца сменялось второй волной снижения к 6-12 месяцам наблюдения. Суммарно результаты изучения динамики площадей дефектов перфузии повторяют тенденции, обнаруженные при сегментарной оценке накопления РФП. Аутологичные клетки-предшественники CD133+ были введены 22 пациентам с хронической сердечной недостаточностью различной этиологии. Все пациенты находились под динамическим наблюдением, в течение которого им было проведено комплексное обследование в различные сроки после операции. Из 22 пациентов исходно 9 (41%) находились в III ФК и 13 (59%) в IV ФК СН по классификации. В послеоперационном периоде у большинства пациентов (68%) отмечается переход в более благоприятный функциональный класс сердечной недостаточности классификации NYHA. После операции улучшение в функциональном классе сердечной недостаточности наблюдается как у пациентов с ИБС, так и у больных с ДКМП. Средний ФК исходно составил: в группе ИБС – 3,4±0,5, в группе ДКМП – 3,75±0,45; после операции достоверно уменьшился и составил при обследовании в отдаленном периоде (к 1 году): в группе ИБС – 2,0±0,6, в группе ДКМП – 2,0±0,4. У больных ИБС достоверно снизился функциональный класс стенокардии по классификации CCS. Толерантность к нагрузке возросла у пациентов обеих групп, что было подтверждено при проведении тредмил-теста. При проведении ЭхоКГ также было выявлено достоверное улучшение сократимости миокарда ЛЖ в группах пациентов, страдающих ИБС и ДКМП. При оценке индекса региональной сократимости было получено достоверное уменьшение значения WMSI в группе ИБС, в группе ДКМП небольшая положительная динамика оказалась недостоверной. Данные отличия в динамике сократимости между больными ИБС и ДКМП предположительно связаны с более благоприятным исходным состоянием миокарда ЛЖ у больных ИБС. При сравнении до- и послеоперационных объёмных показателей ЛЖ выявлено достоверное уменьшение КДО и КСО ЛЖ в обеих группах. В группе пациентов с ИБС до операции КДО составил 262,0 ± 53,2 (122-335) мл/м2, КСО - 173±69,5 (55-279) мл/м2 , а к 1 году после операции 207,4 ± 40,5 (97-253) мл/м2 и 114,2 ± 43,5 (47-222) мл/м2 соответственно. У больных ДКМП КДО и КСО в различные сроки после вмешательства так же достоверно уменьшались по сравнению с исходными значениями: КДО 296,3 ± 56,2 (186-394) мл/м2 против 222,7 ± 49,1 (187-257) мл/м2; КСО 214,8 ± 51,4 (116-289) мл/м2 против 143,7 ± 38,2 (99-170) мл/м2 . Тенденция к уменьшению объёмных показателей ЛЖ у больных с ДКМП менее выражена, что объясняется более тяжелым исходным состоянием миокарда в данной группе больных. Анализ посегментарной сократимости по данным ЭхоКГ показал, что и у больных ИБС, и ДКМП отмечается положительная динамика к 1 году после клеточной кардиомиопластики (ККМП). У больных ИБС количество нормокинетичных сегментов увеличилось на 14%. У пациентов с ДКМП через 1 год после процедуры ККМП отмечали уменьшение количества сегментов со значительным гипокинезом, акинетичных сегментов не наблюдали, нормокинетичные сегменты составили 6%. При оценке перфузии миокарда ЛЖ с помощью однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ) с 99mТс-тетрофосмином все сегменты в обеих группах пациентов были подразделены на 2 подгруппы: леченные (согласно зонам миокарда, в которые были введены аутологичные клетки-предшественники CD133+) и нелеченные. Сначала были проанализированы средние показатели накопления РФП (%) в каждой группе без разделения их по степени исходного нарушения перфузии. При этом в леченных сегментах у пациентов ИБС отмечалось достоверное увеличение накопления РФП (прирост от 10% и более) на нагрузке в поздние сроки после операции (к 1 году). В покое не наблюдалось достоверных изменений перфузии миокарда в этих зонах. У пациентов ДКМП на нагрузке также наблюдался достоверный прирост перфузии в отдаленном постоперационном периоде (прирост накопления РФП в сроки к 1 году). Изменений перфузии в покое не отмечали. Результаты исследования нелеченных сегментов показали, что для них характерно отсутствие каких-либо существенных изменений в динамике. Чтобы оценить эффективность методики, дополнительно была проанализирована динамика количества нормально перфузируемых и с различной степенью нарушения перфузии сегментов до операции и через 1 год после вмешательства. Оказалось, что количество нормально перфузируемых сегментов увеличилось только в группе леченных сегментов у больных ИБС и ДКМП, при этом количество сегментов с различной степенью нарушения перфузии уменьшилось. В нелеченных сегментах, аналогичных изменений выявлено не было. При анализе показателей систолического утолщения, в леченных сегментах исходно и в различные сроки после операции также отмечается достоверно положительная динамика. В нелеченных сегментах не было обнаружено достоверного изменения показателя систолического утолщения. На рисунках 3 и 4 представлена динамика величины дефектов перфузии (ДП) на нагрузке и в покое у больных ДКМП и ИБС. Как видно из рисунков, у пациентов обеих групп отмечается существенное уменьшение площади ДП (%) как на нагрузке, так и в покое к 1 году после операции в сравнении с дооперационными показателями. Помимо этого, отмечается незначительное уменьшение разницы площади дефекта перфузии на нагрузке и в покое.  Рисунок 3. Динамика величины дефектов перфузии (ДП) исходно и в различные сроки после операции на нагрузке и в покое у больных ИБС. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Похожие:
 | «Организация лечебно-профилактической помощи при патологии сердечно-сосудистой... Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Красноярский государственный медицинский... |  | Программа дисциплины по выбору «гипертензиология» Углубить фундаментальные представления о физиологии, анатомии и патологии сердечно-сосудистой системы |
| Лекция №13. Тема: беременность и заболевания сердечно-сосудистой системы По частоте заболевания сердечно-сосудистой системы у беременных составляют 5-10% | | Программа дисциплины по выбору «аритмология» к основной образовательной... Углубить фундаментальные представления о физиологии, анатомии и патологии сердечно-сосудистой системы |
| Лечение движением при заболеваниях сердца При заболеваемости сердечно-сосудистой системы используются все средства лечебной физкультуры (лфк) | | Шизофрения и расстройства шизофренического спектра, коморбидные сердечно-сосудистой... Автор: Жигунова Г. В., кандидат философских наук, доцент кафедры «социальных наук» |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Строение и работа сердца. Гигиена сердечно – сосудистой системы. Предупреждение сердечно – сосудистых заболеваний | | Тема урока: Предупреждение сердечно-сосудистых заболеваний. Влияние... Показать простейшие функциональные пробы, позволяющие определять состояние сердечно-сосудистой системы |
| Темы докладов и рефератОВ Основные симптомы при заболеваниях сердечно-сосудистой системы. Ишемическая болезнь сердца и формы ее проявления | | Зависимость заболеваний сердечно-сосудистой системы от содержания вредных веществ в воздухе Из рис. 1 видно, что при 1,5 резко увеличивается выброс оксида углерода и углеводородов, при 1,5 повышается содержание в... |
| Аэробные программы Разучивание сложной хореографии с использованием танцевальных элементов. Улучшает работу сердечно-сосудистой системы, дыхательную... | | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... «Гигиена сердечно-сосудистой системы. Первая помощь при заболеваниях сердца и сосудов» |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Тема: Гигиена сердечно – сосудистой системы. Первая помощь при заболеваниях сердца и сосудов | | Вопросы к вступительному экзамену в ординатуру по специальности «Рентгенэндоваскулярные... Анатомия и физиология сердечно-сосудистой системы. Нормальная анатомия сердца. Нормальная анатомия артериальной и венозной сосудистой... |
| «лфк при инфаркте миокарда» «лфк при заболеваниях сердечно-сосудистой системы» для студентов института туризма, рекреации, реабилитации и фитнеса 4 курса, обучающихся... | | Учебно-методический комплекс дисциплины физическая реабилитация (наименование... Физическая реабилитация при переломах позвоночника и таза. Физическая реабилитация при нарушениях осанки, сколиозах и плоскостопии.... |
