Российской Федерации Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования
Скачать 2.09 Mb.
|
Метод висящей капли. Метод висящей капли используется при измерении поверхностного натяжения на приборе РАТ-1 (Topfen-Blasen-Profiltensiometer) (ФРГ, Sinterface Technologies). Его преимуществами являются малый объём анализируемой жидкости, широкий диапазон измерений времени жизни капли (от 10 до 10000с и более). Прибор РАТ-1 состоит из микродозирующего устройства, включающего шприц для жидкостной хроматографии на 0,5 мл и микрометрического регулятора (1), микродозирующей системы (7), которая через процессор управляется компьютером (6), источника света (3), объектива и специальной видеокамеры (4), обеспечивающей неискажённое изображение капли, термостатируемой ячейки (8) с каплей исследуемой жидкости (2), формируемой на кончике стального или тефлонового капилляра (Рис.1).  Рисунок 1 - Схема строения тензиометра РАТ-1. 1-макродозирующая система, 2-капля биологической жидкости, 3-источник света, 4-объектив и видеокамера, 5-аналогово-цифровой преобразователь, 6-компьютер, 7-микродозирующая система, 8-термостатируемая ячейка. От видеокамеры (4) сигнал поступает в видеопроцессор (5), где происходит его преобразование из аналогового в цифровой. Затем он передаётся на компьютер (6). Для определения геометрической границы капли используется метод локального порога яркости. Граница капли определяется по максимальному градиенту яркости, как функции от координаты строки изображения, а также используется полиномиальное сглаживание каждой группы из 5 последовательных точек на границе капли. Для калибровки видеоустановки используется эталонная оптическая сетка. Экспериментальная погрешность измерений поверхностного натяжения по методу висящей капли составляет около 0,1 мН/м. Форма капли, висящей на кончике капилляра, при прочих равных условиях определяется ее размерами. Чем больше объем капли, тем в большей степени ее форма отличается от сферической. Уравнение Лапласа описывает механическое равновесие капли, как баланс действующих на каплю сил. Избыточное давление в капле жидкости, помещенной в другую жидкость или газ, определяется главными радиусами кривизны (R1 и R2) и поверхностным (межфазным) натяжением жидкости:  (1)где σ – поверхностное натяжение, ΔP – разность давлений между фазами. В отсутствие других внешних сил, кроме гравитации, величина разности давлений может быть выражена как линейная функция высоты капли:  (2)где ΔP0 – разность гидростатических давлений в плоскости z=0, z – вертикальная координата, Δρ – разность плотностей двух объемных фаз, g – гравитационное ускорение. Капиллярные силы стремятся сделать каплю более сферической, тогда как гравитационные, наоборот, стремятся вытянуть каплю вдоль вертикальной оси. Таким образом, если известно поверхностное натяжение, то форма капли (главные радиусы кривизны R1 и R2) может быть определена по уравнению Лапласа (1). Определение поверхностного натяжения по форме капли также может быть осуществлено. Rottenberg с сотрудниками предложили метод, названный методом анализа формы осесимметричных капель (ADSA), в котором форма капли автоматически анализируется, оптимизируется и сравнивается с теоретическим лапласовским профилем. Анализ тензиограмм. Зависимость ПН от «времени жизни» поверхности обусловлена неравновесным характером процессов адсорбции-десорбции поверхностно-активных веществ (липидов, белков и т.п.) на жидкой границе раздела фаз. В начальный момент времени (t0) поверхностный слой не содержит избытка поверхностно-активных компонентов, т.е. адсорбция равна нулю, а ПН раствора и растворителя 0 одинаковы. Для большинства биологических жидкостей величина 0 близка к ПН воды и солевых растворов - 70-74 мН/м. Скорости адсорбции и понижения ПН определяются в общем случае диффузией сурфактантов к поверхности, скоростью преодоления так называемого адсорбционного барьера (электростатической, энтропийной или иной природы) и процессами перестройки адсорбированных молекул в поверхностном слое. Многочисленные теоретические работы дополнены в последнее время теорией кинетики адсорбции без учета перестройки в поверхности, которая была разработана Уордом и Тордеем. Применение данной теории в полном виде встречает значительные затруднения вследствие интегрально-дифференциальной формы итогового уравнения (так называемое уравнение Вольтера) и необходимостью привлечения дополнительных термодинамических и кинетических соотношений. В частности, должны быть использованы уравнения изотермы адсорбции, кинетическое адсорбционное (типа уравнения Ленгмюра) и состояния поверхностного слоя. Эти уравнения были получены для случаев, когда в растворе присутствуют одно или два вещества известной природы. В случае же многокомпонентных биологических жидкостей строгий подход к решению диффузионно-кинетических проблем вряд ли возможен в настоящее время. Использование асимптотических уравнений теории кинетики адсорбции является более простым, но в то же время достаточно информативным методом анализа динамических тензиограмм. При предельно малых временах (t0) из общего уравнения Уорда и Тордея вытекает относительно простое соотношение, которое для многокомпонентного раствора имеет вид:  (3)где R - газовая постоянная, T - температура, сi - концентрация поверхностно-активного компонента, Di - коэффициент диффузии, i - номер компонента, n - общее число ПАВ. Производная в левой части уравнения (3) представляет собой тангенс угла наклона прямой в координатах - t1/2. Поскольку значения коэффициентов диффузии различных ПАВ имеют одинаковый порядок величины, то соотношение (3) показывает, что тангенс угла наклона прямой от t1/2 примерно пропорционален суммарной концентрации ПАВ смеси. Начальный участок кривой хорошо аппроксимируется линейной зависимостью. Точка пересечения линейного участка с осью ординат близка к поверхностному натяжению воды (в наших опытах равна 72,70,3 мН/м). Как следует из теории, величина 0 определяется солевым составом биологической жидкости. Таким образом, сравнивая углы наклона динамических тензиограмм в координатах - t1/2 можно получить информацию о суммарной концентрации поверхностно-активных компонентов в исследуемом образце биологической жидкости. Второе важное соотношение, вытекающее из теории Уорда - Тордея (так называемое уравнение Йооса - Хансена), относится к случаям предельно больших времен жизни поверхности. Расширенное для многокомпонентной системы, оно может быть записано в виде:  (4)где Г - величина гиббсовской (избыточной) адсорбции данного поверхностно-активного соединения. Производная в левой части этого уравнения берется в координатах - t1/2 и рассчитывается в пределе t (т.е. t1/20). Поскольку отношение Гi/ci для многих сурфактантов является константой (так называемая константа Генри Кi = Гi/ci), то сумма в правой части уравнения (4) приближенно выражает адсорбцию всех компонентов смеси с учетом их адсорбционной активности (Ki). Таким образом, сравнивая значения производных (d/dt1/2)t для различных образцов биологических жидкостей, мы получаем информацию об изменении их состава по изменению величины адсорбции.  Рисунок 2 - Динамическая тензиограмма сыворотки крови человека в зависимости от teff1/2. Характеристика линейного участка 0=72,8 мН/м, λ0=2,8 мН.м-1.с1/2 Экспериментальная зависимость имеет «квазилинейный» участок при t1/20. Точка пересечения прямой с осью ординат дает величину равновесного (т.е. приведенного к t) ДПН () . Последняя характеристика является чрезвычайно важной и может быть получена только путем экстраполяций динамической тензиограммы в координатах - t1/2. Анализ общего решения и асимптотических уравнений для «не диффузионной» кинетики адсорбции свидетельствует, что существование адсорбционного барьера оказывает слабое влияние на выражаемую уравнением (1) зависимость от t1/2 при t, поскольку в этих условиях диффузионный поток из раствора к поверхности является наиболее медленной стадией, определяющей скорость адсорбции. В области очень коротких времен, для которых используется уравнение (3), адсорбционный барьер существует только в концентрированных растворах и поэтому им можно пренебречь в случае для биологических жидкостей человека и животных. В то же время процессы перестройки в поверхности, например, адсорбция-десорбция сегментов белковых молекул, могут замедлять кинетику адсорбции в области средних и больших времен по сравнению с диффузионным механизмом.  Рисунок 3 - Динамическая тензиограмма сыворотки крови человека в зависимости от teff-1/2. Характеристика линейного участка: =62,9 мН/м, =11,2 мН.м-1.с1/2 . Однако в области небольших (до 3 мН/м) понижений ДПН (малых t) процесс адсорбции макромолекул контролируется диффузией. Таким образом, уравнения (3) и (4) для биологических жидкостей могут использоваться почти без ограничений. Результаты исследований представляются в виде тензиограмм (кривых зависимости от t), на которых определяются точки, соответствующие t0,01 с (0) и t1 с (1), а также равновесному ДПН (3). Кроме того, подсчитывается угол наклона кривой (λ) в координатах (t-1/2). Значения 1, (как и 0), характеризуют как свойства растворителя, так и адсорбцию в области коротких времен, а 2 - в области средних времен жизни поверхности. Эти процессы обусловлены в основном наличием в биологических жидкостях низко и средне молекулярных поверхностно-активных веществ, тогда как для высокомолекулярных фракций (белков и других соединений) определяющими являются значения 3. При этом угол наклона прямой λ характеризует величину адсорбции и концентрацию основного компонента сыворотки. 4.1.2 Метод измерения активности ферментов Для определения активности ферментов, в частности липаз, использован pH-стат - автоматический титратор фирмы “Radiometer”(Копенгаген).  Рисунок 4 - Устройство автоматического титратора фирмы “Radiometer”(Копенгаген). Титратор состоит из 4 частей:
В кювету помещают 10 мл рабочего раствора субстрата и ставят на магнитную мешалку. Запускают программу титрования и после звукового сигнала добавляют 100 мкл раствора липазы или комплекса липазы с полиэлектролитами. Время титрования 10 минут, в течение которых программа Stat Talk (версия 1.2) строит график зависимости объема добавленной щелочи от времени. Активность рассчитывается по тангенсу угла наклона касательной к графику. Одна единица активности липазы соответствует 1 мкмоль уксусной кислоты, выделяющейся при ферментативном гидролизе субстрата в одну минуту. Каждую пробу измеряют по 5 раз и рассчитывают среднее значение абсолютной активности липазы. Относительная активность в % рассчитывается как отношение активности опытной пробы к активности контрольной пробы. Результаты представляют в виде таблиц и графиков. 4.1.3 Метод изучения гидролиза триглицеридов и новых липидоподобных субстратов в монослоях под действием липаз Изучение кинетики ферментативного гидролиза липофильных субстратов, организованных в монослои на границе раздела фаз вода-воздух (как простейшей супрамолекулярной системы), постоянно привлекает внимание исследователей. Причина этому - уникальная возможность регистрировать скорость превращения субстрата, находящегося в ориентированном состоянии, характерном для липидов клеточных мембран, мицелл в биологических жидкостях и т.п. Для изучения реакций подобного типа удобно воспользоваться установкой “пленочные весы” (называемой также “весы Ленгмюра”), широко используемой для получения и исследования монослоев ПАВ. Для проведения реакции фермент растворяют в водной фазе, находящейся в ванне “пленочных весов”, а субстрат наносят на ее поверхность в количестве, соответствующем образованию монослоя. Определение скорости ферментативного гидролиза проводят путем регистрации изменения площади, занятой субстратом на поверхности раздела фаз при заданном поверхностном давлении, с течением времени. В общем случае, гидролиз ПАВ, липидов и других липоподобных субстратов сопровождается отщеплением жирных кислот, частично растворимых в воде (по крайней мере, в области низких концентраций, достигаемых при гидролизе монослоя). Вследствие растворения продуктов гидролиза в водной фазе площадь монослоя ПАВ уменьшается. Характерно, что вместе с этим уменьшается и количество фермента, контактирующего с монослоем. Наложение двух указанных процессов приводит к получению интегральной кинетической кривой, математическая обработка которой довольно сложна. Для упрощения расчетов было предложено использовать “пленочные весы”, состоящие из двух отсеков, соединенных неглубоким каналом, так что монослой в обоих отсеках представляет собой единое целое, а водные фазы существенно разъединены. Указанная конструкция позволяет регистрировать скорость ферментативной реакции, протекающей при постоянном количестве контактирующих фермента и субстрата, что облегчает обработку данных. В рамках проекта предложен альтернативный подход к изучению кинетики ферментативного гидролиза в однокюветных «пленочных весах», основанный на регистрации его начальных скоростей, подобно тому как это принято для реакций, протекающих в гомогенной среде. Основным направлением работы явилось сравнительное изучение кинетики ферментативного гидролиза новых поверхностно-активных производных глицерина и некоторых аминокислот, которые являются удобными липофильными субстратами для выяснения особенностей механизма действия липаз. В ряду гидролитических ферментов липазы (ЕС 3.1.1.3) занимают особое место ввиду того, что липиды, их природные субстраты, сильно ассоциированы в водной среде и активация фермента происходит именно в контакте с границей раздела фаз. Известно, что адсорбция липаз на гидрофобных носителях часто увеличивает каталитическую активность фермента. В связи с этим представляет интерес изучение взаимодействия липазы Pseudomonas fluorescens с монослоями ориентированных субстратов, а также влияния строения их молекул на каталитическую активность фермента. Методическая часть. Синтез липофильных субстратов – производных глицерина и следующих аминокислот: валина (Val-PG), лейцина (Leu-PG) и фенилаланина (Phe-PG) был проведен на кафедре органической химии Университета г. Вупперталь (ФРГ) под руководством проф. М. Шнайдера, субстраты были исследованы под руководством автора и описаны в совместной работе. В общем виде схема синтеза приведена ниже:  Схема 1 - Общая схема синтеза липофильных субстратов на основе глицерина и аминокислот. На первом этапе синтеза проводилась ферментативная этерификация глицерина двухкратным молярным избытком винилового эфира лауриновой кислоты в присутствии 1,3-sn-специфической липазы. На втором этапе свободная гидроксильная группа в положении 2 у полученного 1,3-sn-дилаурина реагировала с N-BOC-защищенной аминокислотой в присутствии дициклогексилкарбодиимида (DCC) и каталитических количеств N,N-диметил-4-аминопиридина (DMAP). Реакция проводилась в дихлорметане. После окончания реакции N-BOC-защитную группу снимали обработкой продукта сначала трифторуксусной кислотой, а затем - соляной кислотой, с образованием гидрохлорида соответствующей аминокислоты. Таким образом были получены три новых псевдоглицерида – гидрофобных производных аминокислот: валина (Val-PG), лейцина (Leu-PG) и фенилаланина (Phe-PG).
В работе использовали препарат липазы из бактерий Pseudomonas fluorescens молекулярной массы 33000 Да (фирма «RÖHM Pharma», ФРГ), который очищали следующим образом: 40 мг фермента растворяли в 2 мл 10 мМ КН2РО4 (рН 7,0) при перемешивании и охлаждении льдом на магнитной мешалке в течение 1 ч, после чего отделяли раствор от нерастворимых примесей фильтрованием. Активность фермента определяли в реакции гидролиза 2 %-го раствора триацетина в 0,05М CaCl2, 0,05M NaCl (pH 7,0) путем титрования выделяющейся уксусной кислоты 0,01М раствором NaOH на автоматическом титраторе ТТТ 80 (Radiometer Copenhagen, Дания). Содержание белка в полученном растворе определяли по методу Бредфорда и использовали при расчете каталитических констант. Перед экспериментами в монослоях 10 мкл раствора липазы переносили в водную субфазу весов Ленгмюра и тщательно перемешивали. Монослои указанных липофильных субстратов и трилаурина были получены и исследованы на установках "Lauda FW2" (ФРГ) и NIMA (Англия), работающих по принципу Ленгмюра и Вильгельми, соответственно. 10-50 мкл 10 мМ раствора трилаурина в хлороформе наносили на поверхность раздела водная субфаза/воздух. Водная субфаза представляла собой 10 мМ фосфатный буфер с рН 7,0, содержащий свежеприготовленный раствор липазы. Изотермы поверхностное давление (σ) - площадь на молекулу (А) записывали при сжатии монослоя с постоянной скоростью 10 см2/мин. Из серии последовательных нанесений и удалений монослоя трилаурина на одной и той же водной субфазе был определен коэффициент распределения фермента между монослоем и субфазой. Более подробно указанные эксперименты описаны при обсуждении результатов. Кинетику ферментативного гидролиза трилаурина и липофильных субстратов, организованных в монослои на границе раздела фаз вода-воздух, проводили при постоянном поверхностном давлении 10 мН/м. Реакцию проводили на “пленочных весах” обычного типа, состоящих из одного отсека (“ванны”). Как показано на рис.7, при конверсии субстрата в пределах 10-15 % площадь монослоя линейно уменьшается с течением времени, что дает возможность надежно измерять начальную скорость реакции в широком диапазоне ее значений (правая “ветвь” кривой на рис.7а). Начальный участок представленной зависимости площади монослоя от времени гидролиза (левая “ветвь” кривой на рис.7б) отвечает уравновешиванию монослоя в течение нескольких минут после приложения к нему постоянного поверхностного давления.
Величину I (объем монослоя) вычисляли, умножая площадь монослоя на его толщину, принятую за 1,5 нм. Площадь монослоя рассчитывали, умножая его начальную длину на ширину ванны. Начальную длину монослоя определяли путем экстраполяции линейного участка зависимости длины монослоя к оси ординат (см. рис.6а). Далее, зная объем ванны V (для установок Landa и NIMA, 0,7 дм3 и 1 дм3, соответственно), рассчитывали отношение I/V, которое важно для решения кинетических задач, представленных ниже. Параметры монослоев липофильных субстратов. Обнаружено, что все синтезированные липофильные субстраты (Val-PG, Leu-PG и Phe-PG), а также трилаурин способны образовывать стабильные монослои на границе раздела вода/воздух (рис. 7).
Как видно из рис.7, изотермы зависимости поверхностного давления от площади на молекулу для всех синтезированных липофильных субстратов в монослое качественно подобны: имеют практически одинаковый наклон и протяженный "квазилинейный участок", что свидетельствует о наличии только одного жидко-конденсированного состояние монослоя. Средние значения давлений коллапса монослоя (33-34 мН/м) для всех указанных соединений позволяют говорить об их относительной устойчивости на границе раздела вода/воздух. При давлении коллапса монослоя минимальные площади на молекулу для производных псевдогицеридов (Val-PG, Leu-PG и Phe-PG) составляют 0,85 нм2, 0,76 нм2 и 0,68 нм2. При этом величина площади на молекулу для Phe-псевдоглицерида, имеющего два лауриновых и объемистый гидрофобный фенилаланиновый заместители, практически равна утроенной площади сечения на молекулу жирных кислот в монослое (0,22 нм2), что указывает на плотную упаковку молекул в слое. Увеличение площади на молекулу для Leu- и Val-псевдогицеридов, что свидетельствует о соответствующем уменьшении степени упорядоченности молекул в монослое, коррелирует с уменьшением длины третьего гидрофобного заместителя. Аналогичная последовательность значений площади на молекулу в монослое: 1,23 нм2, 1,17 нм2 и 1,05 нм2 (рис.7) наблюдается для указанных псевдоглицеридов (Val-PG, Leu-PG и Phe-PG) и в случае поверхностного давления 10 мН/м (выбор этого давления был обусловлен тем, что именно при этом поверхностном давлении начинается протяженный квазилинейный участок на изотерме, и осуществляли изучение кинетики гидролиза монослоя указанных субстратов липазой из водной субфазы).
Для описания кинетики ферментативного гидролиза нами использована простейшая модель, представленная на рис.8. Ориентированный в монослой субстрат находится на поверхности водной фазы и занимает объем I. Фермент распределен между водной фазой объемом V и монослоем субстрата. В нашей кинетической модели, молекула фермента, контактирующая с монослоем, немедленно образует фермент-субстратный комплекс. Отметим, что большинство известных из литературы моделей взаимодействия молекулы фермента с монослоем субстрата учитывает стадию перехода фермента в сорбированное состояние и лишь затем - образование фермент-субстратного комплекса. Это необходимо учитывать только при медленной сорбции фермента, когда ее скорость определяет скорость ферментативной реакции в целом, что приводит к появлению предстационарных эффектов: вначале реакция идет медленно, постепенно увеличивая скорость (lag period). В нашем случае, как следует из рис.6, такие эффекты отсутствуют. Еще одно отличие нашей модели от цитированных выше заключается в том, что концентрация субстрата в монослое выражается в объемных величинах, а не в количестве молекул на единицу поверхности. Для изученных 1,3-дилаурил-псевдоглицеридов и трилаурина толщина монослоя была принята равной 1,5 нм, на основании ряда литературных данных. В этом случае начальная скорость химической реакции, регистрируемая в пределах 10%-ной конверсии субстрата, вычисляется по формуле: Т  акой расчет скорости реакции дает возможность получить эффективные значения kкат и Км(каж) в привычных размерностях (с-1 и М, соответственно). В соответствии со схемой, представленной на рис. 8 , запишем уравнения материального баланса для фермента и субстрата, условие стационарности ([ES]=const) и уравнение скорости реакции:  П  ри [P] 0 получим следующее выражение для начальной скорости: (6) В выбранных нами условиях концентрация фермента [E]o варьируется от 0,75 . 10-11 до 3,40 . 10-10 М, а отношение  составляет 1,4-1,8 . 10-7. Поскольку объемная концентрация субстрата [S]o для всех изученных веществ близка к 1,0 М, вкладом слагаемого [E]o в знаменателе правой части уравнения (6) следует пренебречь. Легко заметить, что в таком виде из экспериментально полученной зависимости vo от [E]o невозможно раздельно получить константы kкат и  . Для определения kкат воспользуемся следующим методическим подходом. При заданной концентрации фермента определим начальную скорость гидролиза, подобно тому, как представлено на рисунке 6. Затем при постоянном поверхностном давлении удалим монослой с поверхности водной фазы при помощи шприца. Конечно, при этом удаляется и часть водной фазы, но она невелика (не более 0,5 % от общего объема) и ей можно пренебречь. Нанесем на поверхность новый монослой и вновь определим начальную скорость гидролиза (v1). Повторим эту операцию несколько раз. Очевидно, что в каждом цикле количество фермента, равное [ES].I , удаляется с поверхности водной фазы. После первого цикла общая концентрация фермента в системе [E]1 составит:  , а после i-го цикла  . Логарифмируя последнее уравнение, получим  . Поскольку vo прямо пропорционально [E]o , можно записать:  .Из зависимости lnvi от i были определены значения k, равные 0,92 для Phe-псевдоглицерида и 0,93 для трилаурина. Таким образом, 7-8% от внесенного в водную фазу фермента концентрируется в монослое, объем которого в миллионы раз меньше объема водной фазы!
Учитывая, что  , получим Перепишем уравнение (6) в виде:  Экспериментально полученные зависимости vo от [E]o представлены на рис. 9(а и б), из которых следует, что предложенная нами кинетическая схема описывает процесс ферментативного гидролиза в монослоях лишь приблизительно. В пределах ошибки эксперимента скорость химической реакции монотонно возрастает с увеличением концентрации фермента, но не является ей строго прямо пропорциональной. При больших концентрациях [E]0 v0 , по-видимому, стремится к предельному значению, по крайней мере, в реакции гидролиза трилаурина. Указанное явление не может быть описано уравнением (6), поскольку, повторим,  . Одним из возможных объяснений является присутствие в препарате фермента большого количества примесей, способных влиять на связывание фермента с монослоем. В  области малых концентраций фермента (и примесей) указанное влияние слабее, в связи с чем значение kкат определяли согласно уравнению (8) из начальных участков кривых (см. табл.1). Приравнивая правые части уравнений 6 и 8, получим выражение для определения KM(каж): Таблица 1 - Концентрации трилаурина и псевдоглицеридов в монослоях и кинетические параметры их ферментативного гидролиза.
* - ошибка измерений 2. Поскольку концентрации субстратов [S]0 в монослоях нам известны, а соответствующие значения кажущихся констант Михаэлиса определены нами впервые и приведены в таблице 1, то из уравнения (7) можно непосредственно определить концентрацию фермент-субстратного комплекса в монослое трилаурина, равную 9.10-6 М при исходной концентрации фермента в растворе 1,7.10-7 М (см. подпись к рис.7). Зная объем монослоя, можно вычислить поверхностную концентрацию [ES]*, равную приблизительно 8 молекул/мкм2. Другими словами, площадь монослоя, приходящаяся на 1 молекулу фермента в условиях эксперимента в несколько сотен раз превышает площадь сечения самой молекулы фермента. Из данных таблицы 1 следует, что величина каталитической константы ферментативного гидролиза (kкат) приблизительно соответствует константе, найденной ранее для некоторых эмульгированных субстратов. Например, при гидролизе трибутирина, под действием липазы Rhizopus oryzae, в эмульсии, стабилизированной поливиниловым спиртом, kкат = 5 с-1 и KM(каж) = 2.610–3 М, при этом на величины кинетических констант сильно влияют процессы эмульгирования субстрата. В отсутствии эмульгатора kкат становится ниже, а Км(каж) выше приведенных значений. Отметим, что сравнение вышеприведенных констант с найденными в данной работе носит приблизительный характер и показывает лишь примерное соответствие величин, полученных двумя различными способами. Значения каталитических констант kкат, полученных нами впервые, свидетельствуют о более высоких скоростях превращения синтетических 1,3-дилаурилпсевдоглицеридов по сравнению с трилаурином. Этот, абсолютно новый и неожиданный результат можно объяснить особенностями строения псевдоглицеридов. содержащих в положении 2 остаток аминокислоты и, следовательно, алифатическую аминогруппу, протонированную в условиях проведения реакции (рН 7,0). Электростатическое взаимодействие положительно заряженного субстрата с молекулой липазы Pseudomonas fluorescens, содержащей большое количество карбоксильных групп аспарагиновой (33 остатка) и глутаминовой (24 остатка) кислот, может приводить к снижению свободной энергии переходного состояния реакции образования ацилированного фермента, что является ключевым условием эффективности ферментативного катализа. Особенно важно то, что вопрос о соответствии параметров ферментативных реакций, протекающих в монослоях водонерастворимых субстратов и в их эмульсиях, который до наших работ оставался «открытым» впервые нашел свое принципиальное решение в данной работе. В ходе исследований нами предложен оригинальный подход к определению параметров ферментативного гидролиза липидоподобных субстратов, организованных в мономолекулярные слои на границе раздела фаз. Это дает возможность дальнейшего изучения химических превращений субстратов подобного типа под действием липаз в монослоях и в объеме и сопоставления количественных характеристик этих реакций. Таким образом, предложен простой метод определения параметров ферментативного гидролиза липидоподобных субстратов и трилаурина, организованных в монослои на поверхности раздела фаз. Метод основан на определении начальной скорости реакции по уменьшению площади монослоя субстрата, происходящем при его гидролизе под действием фермента, растворенного в водной субфазе однокюветных весов Ленгмюра, при поверхностном давлении 10 мН/м. Указанным методом определены каталитические константы kкат и кажущиеся константы Михаэлиса Км(каж) ферментативного гидролиза трилаурина и трех 1,3-дилаурил-псевдоглицеридов, ацилированных в положение 2 аминокислотами (фенилаланином, лейцином и валином) под действием липазы из Pseudomonas fluorescens. В отличие от моделей ферментативного гидролиза, пренебрегающих толщиной монослоя субстрата, предложенный метод позволяет получить кинетические константы в привычных размерностях. Установлено, что при близких значениях Км(каж) около 2.10 –6 M, значения kкат заметно выше для синтетических псевдоглицеридов (7 – 13 с–1), чем для трилаурина (4 с–1), что может быть связано с наличием в их молекулах положительно заряженных первичных аминогрупп. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Похожие:
 | Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное... М., Розенштейн М. М., Серпунин Г. Г., Авдеева Е. В., Шеховцев Л. Н., Уманский С. А. Калининград: Федеральное государственное бюджетное... | | Рабочие программы учебных дисциплин (модулей) министерство образования... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования |
 | Правительство Российской Федерации Государственное образовательное... Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования | | Федеральное агентство по образованию государственное образовательное... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ставропольская государственная медицинская академия»... |
| Методические указания Новокузнецк 2012 Министерство образования и... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования | | Правила оформления дипломных работ Министерство образования и науки... Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования |
| Программа дисциплины «Сценарный трейдинг» Правительство Российской... Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования | | Программа учебной практики министерство образования и науки российской... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования |
| Министерство образования и науки российской федерации федеральное... Негосударственное образовательное частное учреждение высшего профессионального образования | | Российской федерации высший арбитражный суд российской федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования |
| Министерство образования и науки российской федерации федеральное... Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования | | Министерство образования и науки российской федерации федеральное... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования |
| Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования | | Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное... Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение |
| Министерство образования и науки российской федерации федеральное... Государственное автономное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования (повышения квалификации) специалистов... | | Российской федерации Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования |
